重组人内皮抑素与血管内皮生长抑制因子融合基因对角膜新生血管内皮细胞的协同作用.pdf

中国临床康复第 加 卷 第 3 3朋2 0 0 6 0 9 1 0出版 C h i n e s e J o u r n a l of C l i n ic a l Re h a b i l i t a t i o n，S e p t e m b e r 1 0 2 0 0 6 V o 11 0 No 3 3 重组人内皮抑素与血管内皮生长抑制因子融合基因对角膜新生 血管内皮细胞的协同作用 王泳 ，柳林，潘欣 8 5 基 础 研 究 解放军广州军 区广 州总医院 眼科，广 东省 广 州市 5 1 0 01 0；解放军 第 二军医大学，长海 医院眼科，微 生物教研 室，上海 市2 0 0 4 3 3 王泳，女，1 9 7 6年 生，河南省临汝市人，汉族，2 0 o 3年解放军第二军 医大学毕业，硕士，医师，主要 从事屈 光外科 方面的研 究。国家 自然科 学基金资助项 目(3 0 2 7 l 3 9 1)中图分 类号：R 3 l 8 文献标 识码：A 文 章编 号：l 6 7 l 一 5 9 2 6(2 0 0 6)3 3 0 0 8 5-0 4 收稿 日期：2 0 0 6 0 6 2 6修回 日期：2 0 0 6-0 7 一I l(0 6 5 0 6-4 6 6 0 G Ef r e c t o f r e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s-m e d i a t e d e n d o s t a t i n-s o l u b l e v a s c u l 8 r e n d o t h e l i u m g r o wt h i n h i b i t o r f u s i o n g e n e o n c o m e a l n e o v a s c u l a r i z a t i o n Wan g Y o n g L i u L i n 2,P a n Xin 0 De p a r t me n t o f Op h t h a l mo l o g y，Ge n e r al Ho s p i t al o fGu a n g z h o u Mi l i t a r y Ar e a Co mma n d o f Ch i n e s e PL A，Gu a n g z h o u 5 1 0 01 0，Gu a n g d o n g P r o v i n c e，C hina；Z De p a r p me n t o f Op h t h almo l o gy，F i r s t Affi l i a t e d Ho s p i t al，S e c o n d M i l i t a r y Me d i c al U ni v e rsi t y o f Ch i n e s e P L A，S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 Ch i n a；De p a r p me n t o f M i c r o bio l o gy，S e c o n d Mi l i t a r y Me d i c al Un i v e rsi t y o f Ch i n e s e P L A，S h a n g h a i 2 0 0 4 33，Ch i n a Wa n g Y on g，Ma s t e r，Ph y s i c i a n，De p a r t me n t o f Op h t h almo l o gy，Ge n e r al Ho s p i t al o f Gu a n g z h o u Mi l i t a r y Ar e a Co mma n d o f Ch i n e s e P L A Gu a n g z h o u 5 l 0 01 0，Gu a n g d o n g P rov i n c e，Ch i n a Su p p or t e d b y：t h e Na t i o n al Na t ur a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f Ch i n a，No 3 0 2 7l 3 9l Re c e i v e d：2 0 0 6)6 2 6 Ac c e p t e d：2 0 0 6 0 7 一I l Ab s t r a c t AI M：To o b s e r v e t h e i n h i b i t o ry a n d s p e c i al e f f e c t s o f r e c o mbi n an t a d e n o v i r u s me d i a t e d e n do s t a t i n s o l u b l e v as c u l a r e n d o t h e l i u m g r o wt h i n h i b i t o r(s VE GI)f u s i o n g e n e(A d-h E N D O-s V E G I)o n p rol i f e r a t i o n o f v asc u l a r e n d oth e l i u m c e l l l i n e M ETHODS：Th e e x p e rime n t was c a r r i e d o u t i n t h e l a b o r a t o ry o f t h e De p a r t me n t o f Mi c rob i o l o gy o f t h e S e c o n d Mi l i t a r y M e d i c al Un i v e rsi t y o f Ch i n e s e P LA b e t we e n J u ne 2 0 o 2 a n d J u n e 2 0 o3 Re c o mb i n a n t a d e n o v i r u s-me d i a t e d e n d ost a t i n s o l u b l e v asc u l a r e n d o i h e l i u m g r o wt h i n h i b i t o r f u s i o n g e n e was c o n s t r u c t e d b y r o u t i n e mo l e c u l a r b i o l o gy，an d i d e n t i fi e d b y e n z y me d i g e s t i o n and pel y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(P C R】T h e v i r al p a r t i c l e s we r e t i t e r e d b y 5 0 t i s s u e c u l t u r e i n f e c t i v e d o s e me t h o dP h osph a t e b u ff e r e d s o l u t i o n(P B s】，A d-L a c Z a n d A d-V E G I w e r e r e g a r d e d as c o n t rol g r o u p s wi t h v i r u s t i t e r o f MOI=2 0W h e n ECV3 0 4 an d L 9 2 9 we r e i n f e c t e d f 0 4 h o u rs f n v i t r o t h e e x p r e s s i o n o f f u s i o n g e n e mRNA an d p rot e i n we r e d e mo n s t r a t e d b y RT PcR a n d W e s t e r n b l o t r e s p e c t i v e l y Th e b i o a c t i v i t y was d e t e r mi n e d b y Vi o l e t c rys t al as s a y o n d a y 1 2，3，4，5 an d 7 a n d r e p r e s e n t e d b y a b s o r b a n c e似1 5 7 0 6 3 0 n m；t h e g r o wt h c u rve o f EC V3 04 a n d L 9 2 9 wa s dr a wn a n d c o mp a r e d t o o b s e rve i t s e ffe c t s a n d t h e s p e c i fic it y RE s UL T S：P C R s h o w e d t h a t t h e f u s i o n g e n e w as s u c c e s s f u l l y c l o n e d a n d t i t t e r e d 2 l o 8 p f u m L C o m p a r i s o n o f v i o l e t c rys t al ass a y r e s u l t s o f E CV3 04 c e l l s i n e a c h g r o u p：E x c e p t t h e l s t d a y o f i n f e c t i o n o f t h e Ad-V E GI g r o u p(P0 0 5)，t h e A v alu e s o f E C V 3 o 4 c e l l s o f t h e A d-V E G I ，P BS an d Ad L a c Z g r o u p s we r e all h i g h e r t h an t h e Ad h ENDO-s VEGI g r o u p 0 0 5)C0NCLUS 1 0N：Th e c o n s t r u c t e d Ad-hENDO-s VEGI c an e x p r e s s f u s e g e n e p r o du c t s wi t h b i o a c t i v i t y，a n d s h o w s a s pe c i fic s y n e r g i s t i c i nh i b i t i o n o n p rol i f e r a t i o n o f e n d o t h e l i al c e l l o f v e i n wh i c h i s s t ron g e r t h a n t h a t o f mo n o g e n i c p r o d u c t s I t c a n b e u sed i n f u r t h e r e x p e rime n t s f o r t r e a t i n g c o r n e a l n e o v as c u l a r i z a t i o n Wa n g Y L i u L P a n X E ff e c t o f r e c o mb in a n t a d e n o v i r u s-me d ia t e d e n d o s t a t i n-s o lu b le v a s c u la r e n d o t h e li u m g r o wt h i n h ib i to r f u s io n g e n e o n c o r n e al n e o v a s c u la d z a t i o n g l正 o L in c h u a n g K a n u 2 0 0 6 1 o 3 3 l：8 5 8 lc h i n 0】王泳，柳林，潘欣 重组人内皮抑素与血管内皮 生长抑 制因子融合基因对角膜新生 血 管内皮细胞的协 同作 用U】_ 中国临床康复，2 0 0 6，1 0(3 3 1：8 5-8 1www z g lc k f c o m 摘 要 目的：观察 内源性血管抑制因子内皮抑素与血管 内皮生 长抑制 因子融 合基因对新 生血管 内皮细胞增殖 的协同抑制作用，分析其作 用特异性。方法：实验 于 2 0 o 2 一 o 6 2 0 o 3 0 6在解放军第二军 医大学微 生物 实验室 完成。常规分 子生物学构建携带融合基因 内皮抑素一 血管 内皮生长因子 的重组腺病 毒，酶切法、聚合酶链反应法鉴定 重组腺病 毒一 内皮抑素一 血 管内皮生长因子 的正确性，半数细胞感染剂量法测定 重组腺病 毒滴 度。以磷酸盐缓 冲液、重组腺病毒一 13 一 半乳糖苷酶 和重组腺病毒一 血管内皮 生长因子 为对照 组，病毒滴度 均为感染复 数(MO I)=2 0，体外感染 人 静脉 内皮 细胞 E C V 3 o 4与小 鼠成纤维 细胞 L 9 2 9 4 h，7 2 h后 应用反转 录一 聚合酶链反应和 We s t e rn 印迹法分别检测融合基 因细胞内的转录及 表 达情况；于病毒感 染后第 l，2，3，4，5和 7天，结 晶紫染 色法检 测活细 胞数，用 5 7 0 6 3 0 n m吸 光度(A)值表示，绘 制并 比较 E C V3 04 和 L 9 2 9 转基因细胞的生长曲线，观察其作用并分析其作用特异性。结果：聚合酶链 反 应法证 实成 功构 建 了融合基 因 重组腺病 毒一内 皮抑 素一 血管 内皮 生长 因子，半数 细胞感 染剂 量法 测得病 毒 滴度 为 2 1 0 p f u mL。各组 E C V 3 04 细胞结晶紫染色检测结果比较：除感染 第 l天重组腺病毒一 血管 内皮生长 因子 感 染组外(P0 0 5)，其余感 染各时相重 组腺病毒一 血管 内皮 生长因子。感 染组、重 组腺病毒一 13 一 半 乳糖苷酶感染组及磷酸盐缓 冲液组 E C V 3 o 4细胞 A值均显 著高于重组 腺病毒一 内皮 抑素一 血管 内皮生长 因子感染组(P0 0 5)。结论：重组 腺病毒一 内皮抑素一 血管 内皮生长 因子在体外 能有效 表达具 有生物学活性的融合基因产物，对静脉 内皮细胞 的增殖具 特异性 抑制 作用，且较单 基因产物的抑制作用更强，可用 于治疗 角膜新 生血管的进 一步体内实验。主题词：基因疗法；角膜 新生血管化；内皮抑素类；内皮，血管；生长抑制 物；基因融合 0 引言 角膜 新生 血管 是角 膜盲 的主要 病 因，同时也 是 同 种异体角膜移植术后发生排斥反应的高危因素，其治疗 由于发 生机制不 明而缺乏安 全有效 的药物，一 直是眼科 界的棘手问题。最新资料显示，内源性血管生成抑制因 子具有较强的抗血管作用。联合应用不同作用机制的血 管抑 制 因子，针对 新生 血管形 成 的过程 进行 多 因素调 控，能够优 化治疗方案，达 到最佳效果 1，2 1。本 实验选择 内 源性血管抑制因子 内皮抑素与血管内皮生长抑制因子 为 目的基因，构建携带内皮抑素一 血管内皮生长因子融 合基 因的重组腺病毒载体(A d h E N D O s VE G I)，观察 融合基因产物对静脉内皮细胞增殖的影响及其作用特 异性，为进一步研究奠定基础。1材料 和方 法 设计：以细胞 为观 察对象，完 全随机 分组 设计。维普资讯 http:/ 维普资讯 http:/ I S S N 1 6 7 1-5 9 2 6 c 2 l 1 4 7 0 由 棚 国 怖床康 复 2 6年 9 1 0旧 尊 1 0 卷 第 2 2 重组腺 病 毒一内皮抑 素一血管 内皮 生长 因子 的 包装、扩 增 和 滴度 应 用脂 质 件 介导 的 方 法，将 p eAi 3一 I L 3 h E N D0-s V E G1和 D J Ml 7导 人 2 9 3 A 细 胞，经细胞 内同源重 组获得重组腺病 毒一内皮抑素一 血 管内皮生 长因 子聚合 酶链 反应 法证实重 组腺病 毒 含融合基 因，见图 2 半 数细胞感 染剂量法 测得病 毒 滴度为 2 x 1 0 p f u mL i h p 春 譬 囊 摹 薏 未 舌 鬻。一 囝 2 重蛆 雌病毒 聚音酶链应 立鉴定电泳圈 2-3 内皮押 素一血管内皮生长因子融合基因的体外表 达重组腺病 毒(MOI=2 0)感染 E CV 3 0 4，7 2 h后提取 两组细胞 mR NA，反转录一 聚 合酶链反应结 果显示重 组腺病毒一内皮抑素一血管 内皮 生 长因子组扩增 条带 大小与预 计片段(4 7 6 b p)一致，而重组 腺病 毒一 13 一半 乳糖苷酶感染组 未见扩 增条带，见图 3 重组腺病毒一 内皮抑 素一 血管 内皮生长 因子组细胞 上清 We s t e r n印 迹法结果显示 与人内皮抑素抗体特异 反应蛋 白条带，相对分子质量约 4】0 0 0，与融合基 因蛋 白产物理论值 相符，见 图 4，说 明重 组腺病 毒一内皮抑 素一 血管 内皮 生长因子在 E C V3 0 4中表达并分泌融 合基因产物。47 6 b p 矗 高 器 蠢 品 腺 病 毒 一 p 一 半 乳 惜 苷 晦 感 染 ：重 组 悻 犏 膪 3硷、I 舡告基 圆 mR NA反转录一 辈奢酶链 反应屯津 囤 l 2 “-3 9 2 k h锢鞠睁 I M日 ；2 蛆 睬锅 毒 一 矗 座 抑幂一血管 内皮 生 长羁 于感 染 蛆 囤 4 w 幅【e n 1 l 【击培溉 融合 基固蛋 白 2 4重组腺 病 毒一内皮 抑素一血 管 内皮 生长 因子 对 E C V3 0 4细胞生长的影响 见表 I 袁 l 吝蛆 E CV 3 0 4细孢 蛄启蒙柒 包栓阐 H 蛄 采比较 L ，盟刷 第 l 天 第 2 第3天 熏组腺病毒一 内盛抑翥00 9 3 I _ 0 0 0 9 7 0 I l l 3 1 0 0 3 5 3 0 I-,9 7=0 0 3 l 0 一血臂内皮生长西于疑；组 重组l愫病毒一 m管内_喳生长 O 0 8 9 3-00 2 2 5 )2 2 5 8=U 0 4 51 _0 3 1 4 0 0 0 5 8 9 凶子 感挚鲳 重组腺病毒 B阜乳l暗甘阵0 2 4 7 2*-0 0 4 l 9。0 2 3 9 6=0 0 7 31-0 5 5 5 8：0 0 5 4 8 感染组 磷酸盐缓冲蔽蠼0 2 8 4 l z 0 0 9 0 2 0 4 3 5 1=0 1 嘶 0 8 0 1 1 5 4 组别 第4 第 5 旃7 重组嵘病嚣一 内盅 q l 紊01 0 9 5 e 0I)l 8 5 I I l 0 8 g 0啦!6 0I 2 6 3=0 0 2 3 7 一血管内歧生长盈于感染组 重组腺病毒一 血昔内皮#k 0 3 8 3 2 00 5 I 0 3 6 1 1 0 00 6 3I )4 2 2 5：0 0 7 I 因于 感 船 重蛆隙病毒一 B 一 半乳晴甘晦 0 6 9 0 8 e O0 5 1 l I 8 3 0 5 e l I 2 01。l 2 3 7 ：I 1 4 7 3 培臻组 磷酸盐缓冲聩j】王 0 6 7 5 l 士 oI】4 0 u 8 2 8 8 0 3 g l 3 l l 0=0呻8 7。自 熏虹 朦 藕毒内直 押 音一 血 骨 a皮生 繁 囤 感 蛆 较 0 0 5)，其余 感染各 时相 重组腺病毒一血管 内皮生长因子 感染组、重组腺病 毒一 B 一 半乳糖苷酶感染组及磷酸盐缓 冲液组 细胞 A值 均 显著高于重 组腺病毒一内皮抑 素一 血管 内皮生 眭因 子感 染组(P 0 0 5)。提 示 重 组 腺 病 毒 一内 皮 抑 素一血管 内皮生长因子对 L 9 2 9细胞增殖无明显抑制 作 用。观 察期 间 3组 细 胞生 长状 态 良好，细 胞 折光 性 强，增殖 旺盛，生长 曲线 基本相 同，见 图 6。1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 重组腺病毒一 内皮抑素 一血 管 内 皮 生长 因子 感 染组 重组腺病毒一 13 一半 乳 糖 苷酶 感 染 组 磷酸盐缓冲液组 1 2 j 4 )O 7 “生 长)d 图 6 L 9 2 9细胞 生 长 曲 线(MO I=2 0)3讨论 众 多研 究 显示，促 血 管 生长 因子 的增 加 打破 了控 制角膜血管形成的网络平衡，使新生血管得 以形成，而 增 加 血 管 生 长 抑 制 因子，可 加 强 抗 血 管 形 成 的力 量，使血管控制网络重新恢复平衡，新生血管消退。目 前治疗角膜新 生血管的主要药物皮质类 固醇激素和 免疫抑制剂，可导致继发性青光眼和巩膜坏死等严重 的 并 发症，相 比之 下，内 源性 血 管生 长 抑 制 因子 作 为 组 织 中的 天然 成分，特 异作 用 于增 生 的 内皮 细 胞，尚 未 发现 明显 副作用，使治疗 过 程更 安全。因此，如何 合 理使用血管生长抑制因子有效地控制血管形成 网络 的平 衡 已成 为当今 角膜新 生血 管治 疗研 究 的新 方 向。由于控制角膜新生血管分子 网络的复杂性，针对 单 一环 节 的治 疗疗 效 有 限，因而 联 合作 用 机 制 不 同的 血管生长抑制因子治疗更为合理。Y o k o y a m a等 5 1 观察 内皮抑素和血管 抑素在体外抑制人脐静脉内皮细胞 与牛肾上腺腺管内皮细胞 的作用时发现，两者联合使 用 的抗 内皮 细 胞增 殖 活性 是 单 独用 药 的 1 6倍，统 计 学 上 差 异 有 显著 性 意义(P0 0 1)，研 究 认 为 这 是 两 者作 用机 制不 同而形 成 的协 同作用。随后 有学 者在 碱 烧 伤 诱 导 的 兔 角膜 血 管 新 生 模 型 中进 一 步 确 证 了这 一结论。尽 管 联合 用 药能 获 得更 理 想 的治 疗 效 果，但 却仍不能摆脱直接使用重组血管生长抑制因子所带 来的缺点。临床研究表 明，重组血管生长抑制因子体 内半衰期短，使用时需反复给药，而且大量制备高纯度 具生物活性的蛋白质的费用昂贵，使该治疗的临床运用 受 到了一定 程度的 限制。然而，随 着基 因传递技术 的发 展，这些缺点 正逐步为基 因治疗 的方法所 克服。内皮抑素和血管内皮抑制因子都 是新 近发现的 特 异 的血管 生 成抑 制 因子，对血 管 内皮 细 胞 的 黏 附、增 殖、移 行 及 血 管 样 组 织形 成 均有 抑 制 作 用，且 作 用 机制可能不同。内皮抑素在正常角膜组织 中有表达，能 特 异 地 抑 制 与 血 管 内皮 细 胞 活 动 相 关 的 多 种 基 因 中国临床康复第 卷 第 3 3朋2 0 o 6 0 9 1 0出版 C h i n e s e J o u l ll o l o f C l i n ic a l R e h a b i l i t a t i o n S e p t e m b e r l o 2 0 0 6 V o l l o N o 3 3 表达，并能通过干扰细胞骨架完整性及基质金属蛋 白 酶活性，影 响血 管 内皮细 胞 的迁 移 和侵袭。而 血管 内皮 抑制因子是 型跨膜蛋白，其氨基酸序列与肿瘤坏死 因子 家 族 成 员 肿 瘤 坏 死 因子、肿 瘤 坏 死 因 子 B和 F a s配体 有 2 0-3 0 的 同源 性，是肿 瘤 坏 死 因子 超 家 族 的新 成员，主 要 由血管 内皮细 胞 表达。其 细胞 外 C 末端是活性片段，通过激活 C D K 4，C D K 6，C D K2等多 种 细胞 周期蛋 白依赖 激 酶使 血管 内皮 细胞停 滞 于 G o ，G。期，并能使应激信号蛋 白 P 3 8和 J N K磷酸化，启动下游相关信号途径，诱导增殖期 的血管内皮细胞 凋亡。本实验中观察到，血管 内皮细胞感染重组腺病 毒一 内皮抑素一 血管内皮生长因子 7 2 h后，融合基因 mR N A在细胞内转录，细胞上清能检测到分泌融合蛋 白 的表 达，且 可 抑 制静 脉 内皮 细 胞 增 殖，具 有 生 物 学 活性。重组腺病毒一 内皮抑素一 血管 内皮生长因子组 与 重组 腺病 毒一 血 管 内皮 生 长 因 子。组 比较，显 示 出 更 强 大 的静 脉 内皮 细胞 增殖 抑 制 作 用，提 示融 合 基 因 可 能从 不 同途径 抑 制静 脉血 管细 胞增 殖，产 生协 同作 用。此 外 融合 基 因中的血 管 内皮 生长 因子属 于肿 瘤 坏 死 因子超 家族，虽然 大 多数研 究显 示它 仅抑 制血 管 内皮细 胞 的生长，但有 学者 却发 现血 管 内皮生 长 因子 还 可通 过 激活 N F K B途 径，抑 制 U 一 9 3 7，MC F 一 7，H e l a 等多种肿瘤细胞的体外增殖，由此提出血管内皮生长 因子可 能具 有类 似肿瘤 坏死 因子 的 细胞毒 性，这对 融 合 基 因产物用 于 治疗 角膜新 生血 管实 为不 利。小 鼠成 纤 维 细 胞 L 9 2 9最 常 用 于 检 测 肿 瘤 坏 死 因子 生 物 活 性。作 者也选 择 它对融 合基 因产 物 的作用 特异 性进 行 检验。实验发现，感染重组腺病毒一 内皮抑素一 血管内 皮 生 长 因子 的 E C V 3 0 4生 长状 态 受 到 了 明显 的抑 制，与重 组 腺病 毒一 B 一 半 乳 糖苷 酶感 染 组 和磷 酸 盐缓 冲液 空 白对 照组 相 比差 异有非 常性 意义(P=0 0 0 0)，后 两 组 之 间无 明显差 异尸=0 0 6 1)。而 对 于 L 9 2 9细 胞，3组 细 胞 的 生 长 基 本 相 同(P=0 5 5 6，P=0 3 1 0)，一方 面 说 明了感染重组腺病毒一内皮抑素一 血管内皮生长因 子 的细 胞表达 具 有生物 学 活性 的融合 基 因产物，另 一 方面则提示内皮抑素一 血管内皮生长因子的融合蛋白 对非 血 管 内皮 细胞 无 明显 的细胞 毒作 用。4 参 考文献 1 O Re i l l y MS，B o e h m T，S h i n g Y，e t a 1 E n d o s t a t i n：An e n d o g e n o u s i n h i b i t o r o f a n g i o g e n e s i s a n d t u mo r g r o w t h C e l l 1 9 9 7；8 8(2)：2 7 7 8 5 2 Z h a i Y，N i J，J i a n g GW，e t VE GI，a n o v e l c y t o k i n e o f th e t u m o r n e c r o s is f a c t o r fa mi ly，i s a n a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r t h a t s u p p r e s s e s t h e gro wth o f c o lo n c a r c i n o ma s i n v i v o F AS EB J 1 9 9 9；1 3(1)：1 8 1 9 3 柳 林，王泳腺病毒介导酸性成纤维 生长因子对兔角膜内皮细胞感 染及促 增 殖 作用 的实验研 究I J 中华眼科 杂志，2 0 0 4 A0(3)：1 5 6 9 4 余 伟明 焦丙 华 肿瘤坏 死因子及相关细 胞毒素【M 上海：上海 科技技术 出版 社 1 9 9 0：6 6 5 Yo k o y a ma YDh a n a b a l MG r i fl i o e n AW，e t a l S y n e r g y b e t w e e n A n g i o s t a t in a n d E n d o s t a t in：I n h i b it i o n o f O v a ri a n C a n c e r G r o wth C a n c e r R e s 2 0 0 0；6 0(8)：21 9 0-6 维普资讯 http:/