白血病抑制因子及受体在多囊卵巢综合征中的表达.pdf

中南大学硕士学位论文白血病抑制因子及受体在多囊卵巢综合征中的表达姓名：潘琼申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：薛敏20050501中文摘要目的研究多囊卵巢综合征(P C O S)不孕患者血清白血病抑制因子(L I F)水平及卵巢组织中L I F 和其受体(L I F R、g p l 3 0)表达是否异常，从整体及细胞水平探讨卵巢局部调节因子L I F 及其受体在P C O S排卵障碍中的作用。方法应用化学发光法及E L I S A 法测定2 2 f f I I P C O S 患者和2 0 例输卵管性不孕患者血清性激素及血清L I F 水平；应用免疫组织化学方法检测以上患者卵巢组织L I F 及其受体的蛋白表达。结果1、P C O S 组廊清中L I F 的水平明显低于对照组(尸 O 0 5)，且与E：和城F S H 比馕曼负相关，与P、T 无栩关性。2、L I F 在P C O S 组颗粒绣脆中星弱黼性表达，鞠显院对照缝嚣(P O 0 5)。3、L I F R 在P C O S 组颗粒细胞中呈阳性或强阳性表达，与对照组比较蠢漫著差吴(P O。0 5)；闻覆细胞均璺弱阳性表达，比对照缝弱(P O 0 5)。4、g p l 3 0 禚两组颗粒细胞中的表达均弱，无盟著差异(P 0 0 5)，在卵泡膜及间矮细胞无表达。5、在两篷均可发现，L I F 在颗粒纲腌中酶表达均是隧郭漉愈大纛愈强。L I F R 在P C O S 组颗粒细胞的表达无论卵泡大小均表现较强染色，未发现其染色随卵泡愈大简愈强的趋势；在对照组中，L I F R 在颗粒细您的表达圈L I F 类麓，照郛泡增大染惫增强。结论P C O S 患者血清L I F 水平的异常及L I F 与其受体的调节失常可能是导致P C O S 排卵障碍的一个黧要因素。关键词多囊卵巢综合征，岛盘病；每铡霭子，岛|薤病静裁霞子受体(L I F R)，g p l 3 0A B S T R A C To b j e e t i v eT od e t e r m i n ew h e t h e rt h ei n f e r t i l ep a t i e n t sw i t hp o l y c y s t i co v a r i a ns y n d r o m ea r er e l a t e dt od y r e g u l a t i o no ft h el e v e l so fs e r u ml e u k a e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r(L I F)a n de x p r e s s i o no fL I Fa n di t sr e c e p t o r si no v a r i e s，a n dt oc o m p a r eg e n e r a la n dl o c a la c t i o na n dt oe x p l a i nf u r t h e rt h ef a i l u r eo ff o l l i c u l a rd e v e l o p m e n tr e g u l a t e db yo v a r i a nl o c a lf a c t o r s，s u c ha sL I Fa n di t sr e c e p t o r si np o l y c y s t i co v a r i a ns y n d r o m e M e t h o d s2 2i n f e r t i l i t yp a t i e n t sw i t hp o l y c y s t i co v a r i a ns y n d r o m ea n d2 0c o n t r o lp a t i e n t sw e r ei n c o r p o r a t e di n t ot h es t u d y T h el e v e l so fs e r u mL I Fa n dg o n a d a lh o r m o n e sw e r ed e t e c t e db yE L I S Aa n dC h e m i l u m i n e s c e n c er e s p e c t i v e l y E x p r e s s i o no fl e u k a e m i ai n h i b i t o r yf a c t o ra n di t sr e c e p t o r sw e r e m e a s u r e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y R e s u l t1 T h em e a nl e v e lo fs e r u mL I Fo ft h es t u d yg r o u pw a so b v i o u s l yl o w e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p，P 0 0 5 a n dn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t 量lE 2a n dL 薹，F S Hr a t i o b u tc o r r e l a t e dw i t h o u tPa n dT 2 S t a i n i n gf o rL I Fi ng r a n u l o s ac e l l so fp o l y c y s f i co v a r i e sw a ss i g n i f i c a n t l yw e a k e rt h a nt h a ti nt h en o r m a lo v a r i e s(P O 0 0 1)w h e r e a ss i m i l a ri nt h e c aa n di n t e r s i t i t i a lc e l l s(j O 0 5)3 S t a i n i n gf o rL I F Ri ni n t e r s t i t i a lc e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yw e a k e ri np o l y c y s t i co v a r i e st h a nt h a ti nt h en o r m a lo v a r i e s(P 0 0 5)G r a n u l o s ac e l l sh a dv e r yi n t e n s es t a i n i n gf o rL I F R，b u ts t a i n i n gf o rL I F Ri nt h e c ac e l l sw e r ev e r yw e e ki np o l y c y s t i co v a r i e s 霹I nt w og r o u p s，t h eg r a n u l o s ac e l l sh a dw e a ks t a i n i n gf o rg p l 3 0(P O 0 5)，a n di n t e r s t i t i a lc e l l sa n dt h e c ac e l l sw e r en e g a t i v eo fi m m u n o s t a i n i n gf o rg p l3 0 5 I nt w og r o u p s，t h ei n t e n s i t yo fi m m u n o s t a i n i n gf o rL I Fo b s e r v e di ng r a n u l o s ec e l l si n c r e a s e da sf o l l i c l eb e c a m el a r g e 纛I np o l y c y s t i co v a r i e s，t h ei n t e n s i t yo fi m m u n o s t a i n i n gf o rL I F Ri ng r a n u l o s ac e l l sl a s t e di n t e n s es t r o n g l yi na t ls i z eo ff o l l i c l e s，w h i c hw a sd i f f e r e n tf r o mn o r m a lo v a r i e s I nn o r m a lo v a r i e s，t h ei n t e n s i t yo fi I m m m o s t a i n i n gf o rI IL 1 F Ro b s e r v e di ng r a n u l o s ec e l l si n c r e a s e da sf o l l i c l eb e c a m el a r g e rC o n c l u s i o nK E YW O R D Sp o l y c y s t i co v a r i a ns y n d r o m el e u k a e m i aI n h i b i t o r yf a c t o r,L I F R，g p l 3 0l n=炷竺：|差唧=湘积蛐羞原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。作者签名：i 耋堕：日期：丝!年上月兰臼关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。储虢监聊签名毒堕眦旦年三月!日里瞠塑鲨一堕童第一章前言多囊卵巢综合征(p o l y c y s t i co v a r i a ns y n d r o m e，P C O S)是神经、内分泌及代谢系统和卵巢局部的调控因素失衡而出现的疾病，是女性内分泌紊乱性疾病中最常见且较为复杂的一种，育龄妇女的患病率为5 1 0“1，以月经异常、多毛、肥胖等为临床特征，病理生理变化以雄激素过多和排卵功能障碍的内分泌紊乱为特征，是造成不孕的重要原因之一，占无排卵性不育病因的5 0 7 0 0 1。其生化改变、发病机制及临床表现有高度的异质性，但目前此症病因尚不清楚，成为妇科内分泌领域内的研究热点和难点之一。目前已明确证实。1 P C O S 发生与卵巢局部旁分泌调节因子有关。其中白血病抑制因子(t e u k a e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r，L I F)是国内外在生殖领域新近研究的一种卵巢局部调节因子“15。6”。L I F 为白介素6(I L 一6)家族中一员，最早发现他具有能诱导小鼠 l I l 型白血病细胞分化为巨噬细胞和抑制白血病细胞增殖而得名”1。以后，发现它是一种高度糖基化的分泌型蛋白，由1 8 0 个氨基酸残基组成，具有广泛生物学功能，能调节胚胎干细胞、原始生殖细胞、肝细胞和内皮细胞等多种细胞的生长和分化。L I F 有高亲和力和低亲和力两种受体：L I F R a 为低亲和力受体；g p l 3 0 是一种分子量为1 3 0 k d 的跨膜糖蛋白，与L I F R a 结合后形成的复合体使其转变为高亲和力受体，并将产生的转导信号激活细胞浆的J a k T y r 酪氨酸激酶家族而发挥L I F 生物学作用“0“1。9 0 年代，大量研究液明“。”3 L I F 还促进生殖活动的多个环节包括卵泡的生长发育，憝籍靛生长、发露、分绽、蓉臻镰方瑟揭示了，妻照功戆约毅爹l I 铡。人艇发现“L I F 在排卵前卵泡液内璺爆发性升高，卵泡液内L I F 水平高低垮卵细胞蔟量量夔挺关，嚣怒嬲患者豹努逸滚中L I F 浓痰明显降低“”。徨羝浓魔L I F 褒P C O S 致病机理中的作用、作用部位仍不十分清楚，国内外也未报道。所以有必溪逮雩亍受深入懿辑突，班涯实L I F 与P C O S 惑吝豹窦郛泡积聚及持续无撼卵是否相关，为P C O S 相关不孕的发病机制与治疗提供燃验室依据。本磅究麸鼹帮谓节辫子着手避行选题，通过测量P C O$患者巍瀵中L I F 和牲激素水平，观察L I F 和其受体(L I F R、g p l 3 0)在P C O S 患者卵泡中的定位表运，从熬体及缨照水平掇讨卵巢髑部调节因子L I F 及其受体在P c o s 排卵赎碍中的 管用。硕I 学位论文材料与方法2 1 材料第二章材料与方法2 1 1 研究对象P C O S 组：选自2 0 0 4 年1 月2 0 0 4 年1 2 月因不孕症在我院接受腹腔镜检查及手术的P C O S 患者共2 2 例。年龄2 2 3 8 岁，平均年龄2 9 5 岁。病程1 1 7 年，平均5 4 年。纳入标准【l6】；月经异常(月经稀发或闭经、月经不规则)，可伴有多毛、肥胖、痤疮等；血清性激素：卵泡早期血黄体生成素(L H)升高，L H F S H 倒置，或血睾酮(T)升高；B 超下可见：卵巢呈蜂窝样，一侧或双侧卵巢有1 0 个以上直径在2 8 m m 的卵泡，无优势卵泡；卵巢髓质回声异常：中心髓质区面积增大，或髓质回声增强、密度增高；腹腔镜检查：双侧卵巢为多囊样改变，无排卵征象。所有患者均无下丘脑疾病、高泌乳素血症、甲状腺疾病、柯兴综合征等内分泌疾病，近3 月未用过激素治疗。术后全部经病理证实诊断。对照组：2 0 例对照为同期接受富腹腔镜检的输卵管性不孕症患者，月经周期正常，血性激素正常，年龄2 3 3 2 岁(月经干净3 5 天)。2 1 2 主要试剂与药品人L I F 定量A B C E L I S A 试剂盒上海森雄科技实业有限公司R a b b i tA n t iL I F(A b l。B A 一1 2 3 9)武汉博士德生物工程有限公司R a b b i tA n t iL I F R(A b l，S C 一6 5 9)北京中山生物制品有限公司M o u s eA n t ig p l 3 0(A b l，s c 9 9 9 4)美国S a n t aC r u z 公司即用型S A B C 免疫组化试剂盒(兔I g G，S A l 0 2 2)武汉博士德生物工程有限公司通用型S P 免疫组化试剂盒(S P 一9 0 0 0)北京中山生物制品有限公司D A B 显色试剂(A R1 0 2 2)武汉博士德生物工程有限公司苏木素粉美国进口分装1 0 多聚甲醛湘雅三医院制剂科多聚赖氨酸武汉博士德生物工程有限公司P B S 粉北京中山生物制品有限公司柠檬酸粉北京中山生物制品有限公司3 H 2 0 2北京中山生物制品有限公司玻片及盖玻片武汉博士德生物工程有限公司蒸馏水湘雅三医院制荆科2 1 3 主要仪器与设备硕j 二学位论文材料与方法低速自动平衡离心机(L D z 5 2)北京医用离心机厂酶标仪(M K 3 型)德国进口水平摇床(W D-9 4 0 5 B 型)北京市六一仪器厂精密可调量移液器特勒托利多仪器有限公司石蜡包埋机德国s M 公司石蜡切片机(L E I C A-R M 2 1 3 5 型)德国s M 公司电热恒温烤箱(D H 一6 4 型)上海医疗器械厂电热恒温培养箱(D N P-9 1 6 2 型)上海精宏实验设备有限公司电热恒温水箱(H H W 2 1，4 2 0 型)天津市泰斯特仪器有限公司微波炉(G a l a n z7 5 0 W)中国G a l a n z 公司超低温冰箱(U 4 1 0 8 6，8 0)英国进口光学显微镜(B H 型)日本O L Y M P S 公司显微镜摄像系统(A H V 型)日本O L Y M P S 公司H P I A S 一1 0 0 0 高清晰度彩色病理图文分析系统2 1 4 实验原理2 1 4 1E L I S A 法测定人血清中L I F 水平的原理采用双抗体夹心A B C E L I S A 法。用抗人L I F 单抗包被子酶标扳上，标准品中的L I F 与单抗缩合，加入生物素纯的抗入L I F 抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的S t r e p t a v i d i n 与生物素结合，加入酶底物O P D，出现黄色，髓终止液硫酸，颜色变深，在4 9 2 n m 处溅值，L I F 浓度与值躐正比，可通过绘制标准曲线求出标本中L I F 值。2 1 4 2 免疫缀缓佬学法测定辩鬃缰织中L I F、L I F R 及g p l 3 0 鬣自表达静原瑾免疫组织化学是利用特异饿抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原(或藏体)酌定位帮籀瓣定量翡技术。为显示帮波察这羚挠暴撬体爱鏖，篙预先将某种标记物结合至抗体上，借助于标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高瞧子密菠，在必镜或毫镜下逶霭定毪、跫位或定量震豢，帮臻已辩弱标诡挠终寒示踪、梭测未知抗原。2 2 研究方法2 2 1 收集一般临床资料年龄、癌变及嚣经嫒弯史、喾觏测爨毒、体重、记蒙毛发警长及分毒情况检查甲状腺等。2。2 2 戴拣本收集及宠分泌激素溅定硕L 学位论文材料b 方法于月经周期3 5 d(月经稀发、闭经期则随时)采空腹静脉血3 m 1 用化学发光法测定血清性激素水平：卵泡刺激素(F S H)、黄体生成素(L H)、雌二醇()、睾酮(T)、泌乳素(P R L)；另3 m l 低速自动平衡型离心机3 0 0 0 转分，离心3分钟，取上清液5 0 0 9 l 置-8 0 C 冰箱待测血清L I F 水平。2 2 3 腹腔镜手术及卵巢组织收集除1 例闭经患者择期手术外，其余患者在月经干净3 5 天全麻下手术，采用日本0 L Y M P S 公司c O。气腹电视腹腔镜手术，观察卵巢表面形态特征。腹腔镜检镜下常规活检双侧卵巢组织，深至髓质；卵巢组织离体后，立即用1 0 多聚甲醛固定，以备用作H E 染色及免疫组化测定。2 2 4 实验方法与步骤2 2 4 1 用E L L S A 法测定人血清中L I F 水平(1)试剂及血样的准备：将浓缩洗涤液用重蒸水按1：2 0 倍稀释备用；从冰箱中取出血清标本、人L I FE L L S A 试剂盒，平衡至室温(2 0 分钟)。(2)建立标准曲线：设标准孔8 孔，第一孔直接加标准品1 0 0-t l；其余每孔中各J n A-样品稀释液1 0 0 F I，第二孔另加标准品1 0 0 1 q，混匀后用加样器吸出1 0 0 l l，移至第-孑L，如此反复作对倍稀释至第七孔。最后，从第七孔中吸出1 0 0 N弃去，使之体积均为1 0 0 肛1。第八孔为空白对照孔。(3)加样：待测品孔中每孔各由n 入血漓标本1 0 0 P l，嗣封板胶辩往反应藐，3 7。C 恒温箱孵育1 2 0 分钟。(4)加入第一抗体：用洗涤液将反应板兖分洗涤6 次，两滤纸上帮干。分剐加入第一抗体工作液5 0 N 孔，封健板孔，3 7。C 恒温箱孵育6 0 分钟。(5)稚入酶标撬俸：浚袄6 次，海滤绥上窜予。分澍掇入酶椽抗藩工作液l O O 蚍孔，封住板孔，3 7。C 恒温箱孵育6 0 分钟。(6)麓入底貔：洗板6 次，燕入瘫穆工偌滚l O O g l 巧L，葑援，3 7 2 3 瀣党孵育1 0 分钟。(7)终壹：翔入终壹滚1 漉嚣，漫匀嚣在4 9 2 r 糯跫溺0 D 蓬(5 分镑内。(8)绘制成标准曲线：以标准品1 0 0 0、5 0 0、2 5 0、1 2 5、6 2 5、3 1 2 5、1 5 6 2 5、0 p g m l 熬篷绘稍戏蠡准潼线计冀标本L I F 含量。见瑶2 一l。2 2+4 2 病理检查嚣蟥秘片标本处理：疑1 0 早鹱霾定，常甄驻承，石蜡包埋，甥冀厚6 黼，H E 染色，光镜下观黎卵巢缀织病理形态。卵泡期卵泡发育按第六版妇产科学中“爨逛笈露与或熬”一节分巍始基郛泡、寞翦鳃滤、窦状爨泡、成熟襄泡稠阔锁卵泡五阶段。(1)始熬辩泡：遘径约5 0 F。m，怒出一个秘级卵母细胞及环绕其周围的单层梭4硕士学位论文材料与方法形前颗粒细胞层组成。(2)窦前卵泡：包绕卵母细胞的梭形前颗粒细胞变为柱状，并变为多层，外围的间质细胞包绕形成卵泡膜的内泡膜层和外泡膜层。(3)窦腔卵泡：卵泡增大达5 0 0 批m，形成卵泡腔。(4)成熟卵泡：卵泡腔增大，卵泡体积显著增大，直径可达1 5 2 0 m m，卵泡向卵巢表面突出。(5)闭锁卵泡：卵泡发育到一定程度通过细胞凋亡机制而自行退化。形态变化多样：卵母细胞、颗粒细胞退变；透明带皱缩溶解；白细胞浸润；卵泡膜细胞形成间质腺。2 2 4 3 免疫组化法检测卵巢组织中L I F、L I F R 及g p l 3 0 的蛋白表达1、试剂盒介绍(1)L I F 试剂盒：一抗是兔抗人L I F 蛋白的多克隆抗体，为武汉博士德生物工程公司产品。稀释1：1 5 0 后应用。二抗是生物素化山羊抗兔1 9 6。该试剂盒为S A B C染色。阳性对照为肝癌组织。阳性细胞为浆着色，呈棕色。(2)L I F R 试剂盒：一抗是兔抗人L I F R 蛋白的多克隆抗体，为北京中山生物制品有限公司公司进口分装产品，稀释l：2 0 0 后应用。二抗是羊抗兔I g G。该试剂盒为S A B C 染色。阳性对照为肝癌组织。阳性细胞为浆着色，呈棕色。(3)g p l 3 0 试剂盒：一抗是小鼠抗人g p l 3 0 蛋白的单克隆抗体，为美国S A N T AC R U Z 公司产品，稀释1：2 0 后应用。二抗是羊抗鼠I g G。该试剂盒为s P 染色。阳性细胞为浆着色，呈棕色。2、相关试剂的处理(1)免疫组化染色所需玻片处理：先用消毒清洁剂浸泡2 小时，流水冲洗干净后，用2 稀盐酸浸泡2 4 小时，再用蒸馏水冲洗3 5 次，6 0。C 烘干；放入以1：1 0 去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液(用非玻璃制品盛放)中，浸泡5 分钟后取出，5 8 6 0 烘烤l 小时，装盒备用。(2)精练石蜡：将石蜡加入不锈钢锅内，电炉加热至熔化后，放入冷水中骤冷，凝固后再次加热，反复共3 次，石蜡变为淡黄色即可作包埋用。(3)苏木素液：苏木素2 5 9 溶于2 5 m l 的乙醇中，在将2 殛的钾明矾溶于5 0 0 m l 蒸馏水，并加入苏木素乙醇液中，加热至沸腾，熄火，慢慢加入1 2 5 9 氧化汞，再煮2 m i n，冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。(4)P B S 液：用蒸馏水溶解磷酸二氢钠1 5 9，磷酸氢二钠2 0 9，氯化钠4 2 5 9，稀释至5 0 0 0 m 3，调整P H 值至7 2 7 6。(5)枸橼酸盐缓冲液配制：l、储存液：A：0 1 M 枸橼酸溶液：称取2 1 O l g枸橼酸(c。t t 0：H 2 0)溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。B：0 1 M 枸橼酸钠溶液：称取2 9 4 1 9硕I 学位论史材料与方法枸橼酸钠(C s H j N a。O，2 H z 0)溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。2、工作液：取9 m l A 液和4 1 m l B液加入4 5 0 m l 蒸馏水中，溶液P H 值为6 O O 1。3、免疫组化步骤(1)取固定好的卵巢组织，各片厚2 m m 左右，作好标记后入于铜条盒中经自来水洗3 小时。依次经过7 5 乙醇(2 h)、8 5 乙醇(2 4 h)、9 5 乙醇I(2 h)、9 5 乙醇I I(2 h)、1 0 0 乙醇I(1 h2 0 m i n)、1 0 0 乙醇1 I(1 h2 0 m i n)常规脱水，二甲苯：酒精(1：1)l O m i n、二甲苯I(2 0 m i n)、二甲苯I I(2 0 m i I q)透明，之后入石蜡I(熔点5 2-5 4)l O m i n、石蜡I I(熔点5 6 5 0)1 5 m i n，石蜡I I I(熔点6 0-6 2)6 0 m i n 浸蜡，石蜡(熔点6 0 一6 2)包埋。修块后4。C 保存，切片时蜡块一2 0 预冷2 0 分钟，用石蜡切片机对包理后的卵巢组织进行连续切片，厚度为6，3 0 乙醇充分展开蜡片，4 0 6 0。C 温水捞片、贴片，5 8 6 0。C 烤片6 0 m i n，烘干溶蜡。(2)石蜡切片常规脱蜡至水：从烤箱(5 86 0 6 0 m i n)中取出玻片，将切片分别置入二甲苯I I 内浸泡l O 分钟、二甲苯I 内浸泡1 0 分钟，无水乙醇I I 内浸泡1 0 分钟，无水乙醇I 内浸泡l O 分钟，9 5 酒精1 0 分钟，9 5 酒精Il O 分钟、8 5酒精1 0 分钟，7 5 酒精1 0 分钟，清水漂洗1 0 分钟，蒸馏水I3 分钟，蒸馏水1 1 3分钟。(3)行苏木素一伊红(H E)染色，选出暴有典垂结构的钢片，采溺S A B C(S P)法 乍免疫组化染色。(4)3 0 矧毛。2 l 份+蒸谣承i G 份，薪鲜配制成3 嚣2 晓，黧溢l O 分镑戮灭活内源性酶，蒸馏水洗5 分钟2 次。(5)热修复抗裰：蒋留片浸入0 O l l d 橇椽酸盐缓滓滚(P H 6 O)，微波势鸯瑟燕至沸腾1 0 分钟断电冷却反复l 2 次，冷却后0。1 M P B S(P H 7 2-7 6)洗涤5 分锋2 次。(6)滴加血清雁常山羊封闭液2 5 5 0 N，室温2 0 分钟，甩去多余液体，不洗。(7)滴加用抗体稀释波稀释的抗(兔或小鼠I g G)，德个标本加2 5 5 0 p l，嚣4 j 童袭(1 4 夺辩左右)。0。1 5 M P B$(P H 7 2-7。s)洗5 分镑3 次。(8)滴加生物索山羊抗小鼠(威兔)I g G(二抗)，约5 0 蛆，2 0 3 7 C 2 0 分镑，0 1 5 M P B S(豫7 2 7 6)洗5 分镑x 2 次。(9)滴加试剂S A B C(S A H R P)，2 0 3 7 2 0 分钟，0 1 5 M P B S(P H 7 2-7 6)洗5 分镑x 垂次。(1 0)D A B 显色：准备l m l 蒸馏水(P H 7 0)，加入一滴(约5 0 N)试剂肌(浓缩缓 孛滚)，混合均匀，然爱终试刘B 和试裁e 各一瀵如入其中，褥、痿混匀(3 06硕上学位论文木j 料与方法分钟内用完)；室温滴加稀释液5 0 1-1 显色5 2 0 分钟不等，镜F 控制反应时间，蒸馏水洗涤。(11)苏木素轻度复染，时间约为5 1 0 分钟后，自来水冲洗(轻)，再充分洗涤1 0 分钟左右。(1 2)常规脱水、透明、封片：依次经7 5 乙醇1 0 分钟、8 5 乙醇1 0 分钟、9 5 乙醇I1 0 分钟、9 5 乙醇1 1 1 0 分钟、1 0 0 乙醇I1 0 分钟、1 0 0 乙醇1 1 1 0 分钟脱水，二甲苯：酒精(1：1)1 0 分钟、二甲苯I1 0 分钟、二甲苯I l l 0分钟透明，用中性树胶封片。(1 3)显微镜观察、照相及图像处理分析：采用H P I A S-1 0 0 高清晰彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析，切片放大倍数表示物镜放大倍数相机目镜放大倍数。同一样本至少重复染色一次，由至少两位经验丰富的专业人员独立阅片。以P B S 替代一抗作为阴性对照，以细胞浆内出现棕色颗粒为阳性结果。每张切片在4 0 0 倍高倍视野下随机取5 个视野，计数阳性细胞数占全部细胞数的比例。根据染色强度与阳性细胞百分数分为4 级细胞浆内无棕色颗粒为阴性(一)；5 0细胞胞浆有较浅的棕色颗粒为弱阳性(十)；5 0 细胞着黄色为阳性(+)；5 0 细胞胞浆内有明显的棕色颗粒为强阳性(+十+)。2 3 统计擎处疆分轿备缀试验值以垮数标准蕊(x s d)表示，P O 0 5)。结果见表3 2。P C O S 组月经稀发1 3 例，占P C O S 组5 9 1，闭经l 例，占P C O S 组4 5，月经不规则8 例，占P C O S 组的3 6 4，对照组均月经周期正常。体重指数(B M I)2 6 者4 例占P C O S 组1 8 2，对照组为O 例，但两组比较无明显差异(P O 0 5)见表2。多毛者(阴毛、体毛、唇须浓密者)6 例，占P C O S 组2 7 3，痤疮者3例，占P C O S 组1 3 6。对照组无一例有多毛、痤疮。P C O S 组原发不孕1 4 例，占P c 0 S 组6 3 6，继发不孕8 例，占P C O S 组3 6 4。对照组原发不孕5 例，占对照组2 5 O，继发不孕1 5 例，占对照组7 5 O，均是由于盆腔粘连及输卵管堵塞引起。病程l 1 0 年不等。结果见表3 1。表3-1 两组临床表现的分布注：肥胖是指体重指数(蹦I)2 6 k g a 2硕士学位论文结果3 2 内分泌测定结果的比较p c o s 患者外周血L H 的测定值为(1 4 9 0 5 2 1)m I U m l，高于对照组(4 4 92 0 5)m I U m l，两者比较有显著差异(P O 0 5)；p c o s 组L H F S H 比值(2 6 40 8 2)较对照组(0 9 0 0 3 5)高，两者比较有显著差异(P 2 5 有1 0 例，占4 5 5，对照组无一例；P C O S 组睾酮(T)值明显高于对照组(P 7 6 n g m l，占2 2 7，对照组无一例：F S H、E：及P R L 与对照组相比无显著性差异(P)O 0 5)。结果见表3 2。表3-2 各糍梅砖测定结暴(王巅)组别P C O S 组(n=2 2)对照组(n=2 0)a：与对照纽比较P(0 0 5 有显著差异性注：体重指数(B M I)一体重(蚝)身高2(m 2)3 3 血清巾L IF 测定及其与血清性激襄的相关性如表3-2，图3 一l 所示，P C O S 组J 舡清中L I F 的水平为(9 5 5 8 2 7 0 1)p g m l，明显诋予对照缝(1 2 9。3 1+3 0 9 5)p g m l，P 颗粒细胞 卵泡膜细胞；L I F 在颗粒细胞中呈弱阳性表达，比对照组弱(P 间质细胞 O P 泡膜细胞。l。1 F 在颗粒细胞上的染色明显要比前两个部位强，呈强阳性表达。如表3 4，图3 7 所示。表3-4L I F 在P C O S 鲺及正常对照组曲蛋白表这的情况鑫：，闻溪细胞 辩淹膜躐臆。毽P c o S 组L I F R 谯颗粒细胞中呈阳性或强阳性表达，与对照组无显著差异(p=-0 0 7 3)；闻质缩胞均呈弱阳径表达，磁对照组弱(P=-O 0 0 5)；卵淹骥缁臆没毒躐有较弱的阳性表达，垮对照组无显著簸异(P=O 9 2 1)。如表3 5，圈3 8、3-9 联示。我们还发现，在同一来源的卵巢标本中，正常卵巢组织中L I F 和L t F R 表达承平静强弱及豁经基本一致。表3-5L I F R 农P C O S 纽凌正常对贼疆的染魏螃玩硕I 学位论史结果a：尸 O 0 5 有显著差异性3 5 3g p l3 0 在P C O S 组及对照组的蛋白表达镜下发现，g p l 3 0 的表达在两组问无显著性差异。g p l 3 0 在颗粒细胞(尸t0 5 5 6)上的染色均十分弱，而在卵泡膜细胞及问质细胞无表达，如表3 6，图3 1 03 一1 1 所示。表3-6g p l3 0 在P C O S 组及正常对照组的染色情况a：P 0，0 5 有显著差异性3。5 4L I F 及L l 照在郛泡发蠢不霹黔段的蛋内表达3 5 4 1L I F 在卵泡发育不同阶段的鬣白表达在P C O S 组及对照组均可发现，L I F 在颞粒细照中的表达均是随卵泡愈大面愈强：而在卵泡膜纲臆上表现不明显。见表3-7。表3-7 农努泡发蠢不羁除段L I F 酶细胞定镳技表这蕊成3 5 4 2L I F R 在卵泡发育不同阶段的蛋白表达程P C O S 缝中，无论癸泡大小，L I F R 在颥粒维麓豹表达稳表臻较焱染色，未发现其染色随卵泡愈大而愈强的趋势；对照组卵巢中的L I F R 寝达同L I F 类似，蘧爨漶增大衣鬏粒缨藏浆染魏氇增强，嚣在襄澹搂缨臆主表或甭硬曩。凳表3 喝。硕士学位论文结果表3-8 在卵泡发育不同阶段L I F R 的细胞定位及表达强度卵泡阶段P C O S 组对照组卵泡数颗粒细胞卵泡膜细胞始基卵泡2 3窦前卵泡1 9窦状卵泡5成熟卵泡0闭锁卵泡1 0+一|f+卵泡数颗粒细胞卵泡膜细胞1 12 51 0l2另外，P B S 阴性对照卵巢组织背景干净，任何细胞均未见阳性染色，说明无非特异性染色，见图3 1 2。+忡=+一一H 冉硕 学位论文结果3 6 附图黔漆奠*嘲露姻誊。血清L I F 浓度(p g m I)图21 血清L I F 水平与0 1 值的标准曲线P C O S 组正常对照维图3-1 两组斑清L I F 趣平的比较1 4厶3刍oo高硕士学位论文结果血清岍水平(p o m t)雨3-2P c 裙惑者血渍L I F 与E 2 的相关柱(f=一0 6 3 8P。乱0 0 1)r三1 1工藩高m 清吁水平(p 0 m t)图弘3p c O S 患者血清L I F 与L H F S H 的耱关性f f 一0 5 6 8，m0 0 0 6)一毛6d)岱顿士学位论文结果图3-4 多囊卵巢组织(H E 染色x4 0 0)图卜5 正常卵巢组织(H E 染色x1 0 0)图p 6 多囊舜鬟雏织L I F 菇蜡切片x4 0 0)霉3 _?正穆努鬟箍熬f L I F 石蜡切嚣x4 0 0)图3-8 多囊卵巢组织(L I F R 篇蜡切片x4 0 0)图3-9 正常卵巢组织(L I F R 石蜡切片x4 0 0)1 6硕士学位论文结果图3 10 多囊卵巢组织(g p l3 0 石蜡切片x4 0 0)图3 1 1 正常卵巢组织(g p l3 0 石蜡切片”4 0 0)圈3-1 2P B S 阴性(篇蜡切片x4 0 0)1 7硕士学位论文讨论第四章讨论4 1L I F 及其受体在正常卵巢组织中表达及意义卵巢的生殖功能除受下丘脑一垂体一卵巢轴调节外，还需卵巢局部产生的调节因子作用；全身和局部相互协调作用，方能使卵巢发挥正常功能和卵细胞健康发育。卵巢颗粒细胞、卵泡膜和间质细胞可产生许多生长因子和激素，在局部通过旁分泌和(或)自分泌形成复杂的网络，调节卵细胞的发育“8。4。研究发现。1 2 L I F 不仅来源于血液中的单核细胞和臣噬细胞，同样也来源于卵泡液中的巨噬细胞、颗粒细胞、间质细胞等，含L I F 条件的培养液能明显提高原始卵泡到初级卵泡转化并且促进卵泡的发育和成熟。A r i c i 等。1 的研究也表明在排卵前阶段卵巢颗粒细胞表达L I F m R N A。以上这些研究证实了L I F 是一种卵巢抗凋亡的生存因子，L I F 可能在调节卵巢功能、参与排卵过程中起重要的作用。本研究通过在血清中对L I F 的定量测定及对卵巢颗粒细胞、阃质细胞及卵泡膜细胞中L I F 的定性检测，支持了L I F 卵巢源性及其促卵泡发育的观点。关于人卵巢组织中L I F 特另H 是L I F 受体的检测数搬在国内步 报道不多。本缀免疫缎化研究发现，L t F 和L t F R 在所有正常卵巢各级卵泡的颗粒细臌中都发现阳性表达，两者染色均是随卵泡愈大而愈强。我们研究的结果与以往学者研究一一致。N i l s s o n。等对大鼠卵巢的研究中发现，L I F 最翠较弱表达在原始卵泡的卵母细胞及颗粒细胞上，而随糟卵泡的发育，强初级及次级卵泡的颗粒细胞开始有较强的L I F 寝达，并置随卵泡增大衙染色熊疆