免疫固定电泳操作SOP.doc

免疫固定电泳操作规程

一、项目名称
免疫固定电泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION）
二、检验方法名称
琼脂糖凝胶免疫固定电泳
三、方法学原理
血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于β-球蛋白和γ-球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤：
1、蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。
2、电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。
3、使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。
4、将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。
为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它（们）与抗血清，γ(IgG)、α(IgA)、μ(IgM)重链和κ、λ轻链（游离和非游离）反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。
四、方法学溯源
自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。
五、仪器
（一） 型号 ：SEBIA HYDRASYS (PN1210)
（二） 分析和计算参数：
1、处理量：约18个样本/小时
2、所需样本量：10ul
3、检验时间：约55分钟
4、重复性：有良好的批内和批间重复性
5、电泳参数：电压0－300V（可选至3000V）
电流0－500mA
功率0－100W
六、试剂及配套品
一）试剂
1、HYDRAGEL 1 IF试剂盒
HYDRAGEL 2 IF试剂盒
HYDRAGEL 4 IF试剂盒
HYDRAGEL 9 IF试剂盒
（1） 商标：SEBIA
（2） 包装规格：10测试/20测试/40测试/90测试
（3） 货号：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309
2、脱色液
（1） 商标：SEBIA
（2） 包装规格：Pack for 10×100ml
（3） 货号：PN4540
（4）成分：柠檬酸
3、洗涤液
（1） 商标：SEBIA
（2） 包装规格：Pack for 10×80ml
（3） 货号：PN4541

（4） 成分：叠氮钠
4、稀释剂
（1） 商标：SEBIA
（2） 包装规格：Pack for 1×5ml
（3） 货号：PN4587
（二） 配套品
IF试剂抗体
（1） 商标：SEBIA
（2）包装规格：Pack for 5×1ml
（4） 货号：PN4315
七、操作步骤
（一）开机，启动电泳仪。
（二）将1只（用于1，2IF），2只（用于4IF）或3只(用于9IF)点样梳置于整表面，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加10ul样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。
电泳/免疫固定泳道
孔号 ELP GAM K L Kf Lf
Hydrasys 1 IF 1 2 3 4 5 6
Hydrasys 2/4 IF
1或3号样本 2 3 4 5 6 7
2或4号样本 9 10 11 12 13 14
Hydrasys 9 IF
1,4或7号样本 1 2 3 4 5 6
2,5或8号样本 7 8 9 10 11 12
3,6或9号样本 13 14 15 16 17 18
（三）选择相应的“IF”电泳程序
（四）从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加200ul蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。
（五）自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，1、2IF的点样梳置于支架6号位，4IF的2只点样梳则分别置于3号和9号，9IF的3只点样梳则分别置于2，6号和10号，注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。
（六）电泳仪自动发出蜂鸣声，提示电泳结束，进行免疫固定操作。打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，移走两支架，用湿纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要求将动物血清抗体加入抗体加样条：
1、Hydrasys 1 IF用6孔抗体加样条：每孔加8μl抗体
2、Hydrasys 2/4IF用15孔抗体加样条：2人份每孔加8μl抗体，4人份每孔加12μl抗体
3、Hydrasys 9 IF用18孔抗体加样条：每孔加8μl抗体
4、固定好抗体加样架，将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖，按“Start”键开始免疫固定。
（七）10分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，提示“PAPER BLOTTING” ，移走抗体加样架，弃去抗体加样条，放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶表面， 左手固定好滤纸，右手手指用力的摩擦滤纸表面，注意勿将滤纸移动，关闭电泳舱盖，按“Start”键开始凝胶表面多余抗体的吸收。
（八）3分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，移去滤纸，关闭舱盖，按“Start”键开始凝胶片的干燥。
（九）6分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，取出凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板，将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查洗液瓶中是否有400ml洗液，染色液瓶内是否有300ml染色液，脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后，菜单上选择染色指令，按“Start”键开始染色。
（十）在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将烘干的胶片取下。
八、临床意义
对多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤、轻链病、重链病等研究有重大意义
九、标本要求
（一）取新鲜血清进行分析，根据临床实验室对各种试验所使用的操作程序进行血清样本的采集，样本置于冰箱内（2～8℃）可保存一周，若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血清样本加入0.02g/dl的叠氮钠可以增加其存放稳定性。
（二）为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如下稀释，并混匀。
泳道 血清(ul) 稀释剂(ul)
蛋白电泳 (ELP)和其他免疫球蛋白固定泳道 30 60
IgG免疫固定泳道 20 100
（三）特殊情况
1、当总免疫球蛋白的水平＞20g/L，稀释剂量加倍（除了ELP泳道）
2、当总免疫球蛋白水平＜5g/L，稀释剂量减半（除了ELP泳道）
3、冷藏或冰冻后，某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下，加25ul液化剂于75ml血清中，混匀15秒。然后按规定程序继续进行。
4、某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下（i）准备1％β－巯基乙醇（这种还原剂可在室温于未封闭微管内保存1周）（ii）加25ul还原剂于75ul血清中（iii）混匀并令其反应至少15分钟（至多3小时）后按规定程序继续进行。
（四）避免使用血浆标本。
十一、操作注意事项
（一）为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。
（二）用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。