细菌个数的测定.docx

对返排液杀菌效果的测试方法
实验原理：推测返排液主要的细菌为硫酸盐还原菌、铁细菌和腐生菌。通过加入不同杀菌剂，测量加入前后细菌含量，得出不同杀菌剂的杀菌率，优选效果最好的杀菌剂。
实验仪器：
1) 硫酸盐还原菌（SRB）测试瓶；
2) 铁细菌（IB）测试瓶；
3) 腐生菌（TGB）测试瓶；
4) 注射器：1ml；
5) 恒温培养箱；
6) 电热消毒器。
实验步骤：
1) 将测试瓶排成两组，并编号；这是二次重复法，三次重复法方法类似，不过要把测试瓶分为三组。
2) 用120℃消毒20min的无菌注射器取1.0ml水样注入第一组1号瓶内，充分震荡；
3) 用另一只无菌注射器从第一组1号瓶中取1.0ml水样注入第一组2号瓶；
4) 再更换无菌注射器从第一组2号瓶取1.0ml水样注入第一组3号瓶；
5) 以此类推一只稀释到最后一瓶为止。根据细菌含量决定稀释瓶数，一般稀释到7号瓶；
6) 将杀菌剂加入到所测试的水样，用无菌注射器去1.0ml杀菌后的水样注入到第二组1号瓶内；
7) 用另外一只无菌注射器从第二组1号瓶去1.0ml水样注入第二组2号瓶；
8) 以此类推。根据细菌含量决定稀释瓶数，一般稀释到7号瓶；
9) 将上述测试瓶放入放入恒温培养箱中培养，温度控制在37℃，7d后读数；
10) 用下列公式计算杀菌率：
Y=B1-B2B1×100%
Y——杀菌剂的杀菌率，%；
B1——加杀菌剂前水样中细菌含量，个/ml;
B2——加杀菌剂后水样中细菌含量，个/ml。
备注：
一、注意事项
1) SRB测试瓶变黑或者有黑色沉淀，表示有硫酸盐还原菌；TGB测试瓶由红变为黄或浑浊，表示有腐生菌；IB测试瓶出现棕红色沉淀，表示有铁细菌。
2) 杀菌剂的加量为50mg/L;
3) 在室温下向水样注入杀菌剂，杀菌时间为4h；
4) 腐生菌的培养时间是5d~7d；铁细菌的培养时间是7d~14d，硫酸盐还原菌的培养时间是14d~21d。
5) 测试瓶大概为3元/瓶。
二、读数方法：
1.生长指标的确定原则：
1) 全部呈阳性反应的最后一列平行样应为生长指标的第一位数。
2) 同一平行样，有X个阳性反应瓶，生长指标即为X。
2.级数的确定原则：
1) 全部呈阳性反应的最后一列平行样的瓶号数减去1，即为级数n，以10n表示。
2) 1号瓶的2或3个平行样未全部发生阳性反应时，级数为0，即为100。
3.细菌测试瓶测试方法及结果报告示例
例：做三个平行样重复试验，每个样稀释5个梯度：
1
2
3
4
5
1′
2′
3′
4′
5′
1″
2″
3″
4″
5″
即分别在1、1′、1″号瓶中注入1ml水样，摇匀后取出1ml再分别注入2、2′、2″号，摇匀后取出1ml再分别注入3、3′、3″瓶中，以此类推直至注入到5、5′、5″号瓶。
在恒温下放置一段时间后，观察测试瓶阳性（变色）反应个数。
即：

1+
2—
3—
4—
5—
1′+
2′+
3′+
4′—
5′—
1″+
2″+
3″—
4″—
5″—
所以读数为：321；级数：100（1-1=0）
此生长指标为321，级数为100。通过查表可知，321对应的细菌量为15个/ml，此系列报告结果为：15× 100=1500个/ml。
1+
2+
3+
4+
5+
1′+
2′+
3′+
4′—
5′+
1″+
2″+
3″+
4″—
5″—
此生长指标为312，级数为102（3-1=2）。通过查表可知312对应的细菌量为11.5个/ml。此系列报告结果为：11.5×102=1173个/ml。
1+
2+
3+
4+
5+
1′+
2′+
3′+
4′+
5′+
1″+
2″+
3″+
4″+
5″+
3 0 0
此生长指标为300，级数为104（5-1=4）。通过查表可知，300对应的细菌量为2.5个/ml。此系列报告结果为≥2.5×104=2600个/ml。

例子1
1列
2列
3列
4列
5列
+
—
—
—
—
+
+
—
—
—
+
+
+
—
—
此生长指标为321，级数为100（1-1=0）。通过查表可知，321对应的细菌量为15个/ml。此系列报告结果为15×100=1500个/ml。
例子2
1列
2列
3列
4列
5列
+
+
+
—
—
+
+
+
—
—
+
+
+
+
+
此生长指标为311，级数为2（3-1=2）。通过查表可知，311对应的细菌量为7.5个/ml。此系列报告结果为7.5×102=765个/ml。
例子3
1号瓶
2号瓶
3号瓶
4号瓶
5号瓶
+
+
—
+
—
+
+
+
—
—
此生长指标为211，级数为1（2-1=1）。通过查表可知，211对应的细菌量为13个/ml。此系列报告结果为13×101=1313个/ml。
例子4
1号瓶
2号瓶
3号瓶
4号瓶
5号瓶
—
+
—
—
—
+
—
+
—
—
此生长指标为111，级数为0（1-1=0）。通过查表可知，111对应的细菌量为2.0个/ml。此系列报告结果为≤2×100=200个/ml
注：
a) 做几个平行样对应查几次重复计数表（即生化检测方法中的MPN表）。
b) 计算公式为发生阳极反应瓶号数-1=级数，即在结果后应×10n。如1号瓶级数为0级，即在结果后×100；2号瓶级数为1级，即在结果后×101.
c) 如果第一列（1、1′、1″）未全部发生阳性反应，报告结果应注明“≤”；
d) 如果至最后一列（5、5′、5″）全部发生阳性反应，报告结果应注明“≥”，此情况下说明细菌量大，应增加测试瓶个数以求得较准确的结果。
e) 测试瓶注入水样后应用力摇晃，以保证结果的准确性；逐级稀释水样时，应更换无菌注射器，以保证结果的准确性。
附录
细菌量统计表
1.稀释法三次重复菌量统计见表1：
表1 稀释法三次重复菌量计数表
生长指标
细菌量；个/ml
生长指标
细菌量；个/ml
生长指标
细菌量；个/ml
000
0.0
201
1.4
302
6.5
001
0.3
202
2.0
310
4.5
010
0.3
210
1.5
311
7.5
011
0.6
211
2.0
312
11.5
020
0.6
212
3.0
313
16.0
100
0.4
220
2.0
320
9.5
101
0.7
221
3.0
321
15.0
102
1.1
222
3.5
322
20.0
110
0.7
223
4.0
323
30.0
111
1.1
230
3.0
330
25.0
120
1.1
231
3.5
331
45.0
121
1.5
232
4.0
332
110.0
130
1.6
300
2.5
333
140.0
200
0.9
301
4.0

2.稀释法二次重复菌量统计见表2：
表2 稀释法二次重复菌量计数表
生长指标
细菌量；个/ml
生长指标
细菌量；个/ml
生长指标
细菌量；个/ml
000
0.0
110
1.3
211
13.0
001
0.5
111
2.0
212
20.0
010
0.5
120
2.0
220
25.0
011
0.9
121
3.0
221
70.0
020
0.9
200
2.5
222
110.0
100
0.6
201
5.0

101
1.2
210
6.0