双波长法快速测定蛋白质含量.doc

苏州医学院学报 2000 ;20 (1)


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朱华亭　刘继明　殷昌硕　张学光
(苏州医学院免疫学研究室 ,苏州 ,215007)

　　摘要　目的　为了建立一种快速而灵敏的蛋白质检测方法。方法　在考马斯亮兰法测定蛋白质含量时 ,通过
采用 590nm和 450nm双波长代替单波长检测 ,并以酶标检测仪取代紫外 -可见分光光度计作为检测仪。结果　
此种改进不但提高了考马斯亮兰法检测蛋白质的灵敏度 ( 0. 127μg/ ml)和检测范围 ( 0. 127～31. 25μg/ ml) ,而且使
大量标本的检测可在一次检测过程中完成。标准直线相关系数 r2 = 0. 9965 ,表明在检测限内 A595 / A450和蛋白质
浓度 C呈良好线形关系。结论　双波长法可作为一种快速、敏的蛋白质检测方法。
关键词　蛋白质 ;定量 ;双波长 ;考马斯亮兰
中图法分类　R392 - 33

Rapid Two - colorimetric Assay for Protein Quantities

Zhu Huating , L iu Ji ming , Yin Changshuo , et al
(Depart ment of Immunology Suzhou Medical College ,Suzhou ,215007)

Abstract　Objective　To improve t he sensitivit y of t he Coomassie brilliant blue protein assay.
Methods　The Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590
and 450nm. To linear wit h protein concent ration by t he ratio of t he absorbance ,590 nm over 450 nm ,

toreader as t he detecting equipment . Results　This simple process increases t he accuracy and improves

sions　This assay can be as sensitive and rapid a met hod for protein quantities.
Key words　Protein quantit y ; two - colorimet ric ; Coomassie brilliant blue

　　考马斯亮兰蛋白质定量法 ,也被称为 Bradford本 ,能减少系统误差。本实验拟用双波长代替单波
测定法[ 1 ]。该方法具有易开展 ,快速和对蛋白质特长 ,并用酶标仪代替紫外 -可见分光光度计提高检
异性好 ,所以被广泛用于蛋白质的测定[ 2 ]。但该方测灵敏度。
法也有其局限性 ,首先其检测灵敏度较低 ,只能检测
mg级水平的蛋白质 ;其次 ,考马斯亮兰检测的线性 1　材料和方法
范围窄 ,在 2～ 10μg/ ml之间 [ 3 ]。鉴于其有上述缺 1. 1　试剂 :考马斯亮兰 G - 250和结晶牛血清白蛋
点 ,是否能通过方法上的改进 ,拓展考马斯亮兰法的白 (购自 Sigma)。其它所用试剂为分析纯 ,去离子
应用范围。在酸性条件下 ,考马斯亮兰染料呈红色 ,双蒸水作为溶剂。
[2 ]
亮兰染料和考马斯亮兰 -蛋白质结合物有不同的吸 50ml 95 %乙醇中 ,再加入 100ml的浓磷酸 ( 85 %
光系数。传统考马斯亮兰法利用考马斯亮兰 -蛋白 W/ V) ,最后加蒸馏水至 200ml ,此染料于 4℃避光
结合物最大吸收波长 595nm时的吸收度 A来反映可存放 6个月。临用前 1∶稀释。
蛋白质的浓度 ,而忽略了游离考马斯亮兰染料在此 1. 3　吸收光谱测定 :将染料 1∶稀释并过滤 ,在干
波长下也有一定的吸收度。在 EL ISA检测和 M T T净试管内加入 0. 8ml稀释好的染料 ,再加入 0. 2ml
测定中 ,常利用双波长法来消除杂吸收的影响从而的待测样本 ,对照品为蒸馏水 ,反应时间至少 5min ,
提高检测的灵敏度[ 4 ]。酶标仪可一次检测大量标但不超过 30min。用紫外 -可见分光光度计 (上海

3国防科技预研项目 ( Y5573162)

双波长法快速测定蛋白质含量 3
but not t he absorbance of 590nm ,and replace t he UV/ V IS spect rophotometer wit h t he microplate au2
t he sensitivit y of t he assay about 20 - fold ,also make a lot of samples be detected in one cycle. Conclu2
而当它与蛋白质结合时变成兰色
。因此考马斯
1. 2　染料的配制 :将 100mg考马斯亮兰溶解在
灵
5
5

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分光光度计厂 , 752C)在 460～ 700nm波长内 ,每
10nm检测样品的透光率 ,换算成吸收度 ,根据吸收
度 -波长绘制吸收光谱图。
1. 4　蛋白质测定 :方法同上 ,样品和染料用量减少
1/ 4。用酶标仪 (Bio - Rad ,model550)代替紫外 -可
见分光光度计作为检测仪 ,酶标检测板作为反应池 ,
检测特定波长下不同蛋白浓度产生的吸收度。

2　结果
2. 1　吸收光谱 : 0. 8ml稀释的染料加入 0. 2ml
5mg/ ml的牛血清蛋白 ,使考马斯亮兰完全与蛋白
结合 ,在 360～700nm内每相隔 10nm检测待定样品
的吸收度。根据吸收度 -波长绘制考马斯亮兰 -蛋
白质结合物吸收光谱 (图 la) ;以稀释的染料为待测
样本 ,绘制游离考马斯亮兰染料的吸收光谱 (图 lb)。


ACTA ACADEMIA E MEDICINA E SU ZHOU 2000 ;20 (1)

从吸收光谱图可知 ,考马斯亮兰 -蛋白质结合物的
最大吸收波长为 590nm ,考马斯亮兰染料的最高吸
收波长为 460nm ,590nm波长下游离考马斯亮兰染
料也有较高的吸收度 ,而 460nm处染料 -蛋白质结
合物无吸收度。
2. 2　蛋白质检测的线性范围 :为了适合酶标仪滤光
片的检测 ,以 595nm和 450nm作为检测波长 ,将 BSA
从 1mg倍比稀释至 240pg/ ml ,以检测样品在各浓度 C
时的吸收度。分别以 A595 - C ,A450 - C和 A595/ A450 -
C作图 ,观察单波长吸收度和双波长吸收度之比与蛋
白质浓度的线性关系。由图 2可知 ,A595和 A595/ A450
在一定范围内和蛋白质浓度成正比关系 ,A450和蛋白
质浓度无正相关。A595/ A450在线性范围内随蛋白质
浓度的变化比 A595灵敏。为了明确 A595/ A450双波长
法检测范围 ,通过局部放大作图 3。

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从图 3a、3b可知 ,A595/ A450双波长法最高检测上限
的蛋白质浓度为 32. 25μg/ ml ,最低检测下限为
0. 122μg/ ml ;同理作图 3c、3d ,A595单波长检测上限
为 7. 81μg/ ml ,最低检测下限为 0. 976μg/ ml。
2. 3　标准曲线 :在检测限范围内 ,以蛋白质浓度 C
为横坐标 ,吸收度 A为纵坐标作标准曲线图。A595/
A450 - C直线关系为 y = 0. 2011x + 1. 0395 ,相关系
数 r2 = 0. 9965 ;A595 - C直线关系为 y = 0. 0258x +
0. 4859 ,相关系数 r2 = 0. 9951。表明单、双波长测
定法在检测限内其吸收度与蛋白质浓度呈良好线性
关系。
的人为影响因素。而采用酶标仪作检测仪 ,所需样

3　讨论
本实验结果证实 ,在考马斯亮兰法测定蛋白质
含量时 ,采用双波长测定法其灵敏度可提高至0. 122
μg/ ml ,为单波长测定法灵敏度 ( 0. 976μg/ ml )的 8
倍。虽然单波长和双波长法之间线性相关系数差别
不大 ,但双波长测定法比单波长测定法具有更宽线
性测量范围。双波长测定法比单波长测定法定灵敏
度高 ,主要是由于双波长法不但反映了考马斯亮兰
-蛋白质结合物的吸收度 ,而且也反映了游离染料
的吸收度。在测定过程中随着蛋白质浓度的增加 ,
游离考马斯亮兰染料逐渐减少 ,因此在蛋白质浓度
发生改变时 ,不但染料 -蛋白质结合物在 595nm的
品仅 100μl或更少 ,而且一次可检测大量的标本 ,过
程自动化程度较高 ,适用于样品体积较少和大量样
品的检测。单波长 -酶标法灵敏度为 0. 976μg/ ml ,
而传统考马斯亮兰灵敏度为 2μg/ ml ,可见减少误差
会提高实际测量的灵敏度。
本实验室多次使用证实 ,通过双波长和酶标法相结
合应用于考马斯亮兰蛋白质定量 ,不但克服了传统
考马斯亮兰蛋白定量灵敏度低、线性范围小 ( 2～
10μg/ ml)缺点 ,而且使定量过程更加快速、简单和
重复性好。这种方法上的略为改进 ,使考马斯亮兰
法可广泛适用于各种要求的蛋白质定量检测。

吸收度发生改变 ,而且游离考马斯亮兰染料在
参
考
文
献

595nm的吸收度也要发生变化 ,所用单采用 595nm
波长的吸收度不能确切反映染料 -蛋白质浓度的变
化。在 450nm波长时 其吸收度 A在一定范围内随
蛋白质浓度呈负相关 ,主要是因为随着蛋白质浓度
的增加 ,游离染料逐渐减少 ,所以 A595/ A450随蛋白
质浓度变化的灵敏性比 A595更明显 (图 4)。
在传统考马斯亮兰测定蛋白质含量时 ,通常以
可见 -紫外分光光度计作为检测仪[ 2 ]。其检测池
所需样品体积至少 1ml ,因此所需的检测样品较多 ,
浪费较大。传统分光光度法在检测过程中 ,需不断
清洗样品池和重复检测过程 ,其重复性劳动性多 ,易
出现操作错误 ,增加了实验的系统误差和可能出现
1　Kirazov L P , Venkov L G , Kirazov EP. Comparison of t he
Lowry and t he Bradford protein assays as applied for protein
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