AQP4在幼年大鼠感染性脑水肿中的作用机制.pdf

当代医学2 0 0 9 年7 月第1 5 卷第1 9 期总第1 7 4 期C o n t e mp o r a r y Me d i c i n e，J u 1 2 0 0 9，V o 1 1 5 No 1 9 I s s u e N o 1 7 4 A Q P 4 在幼年大鼠感染性脑水肿中的作用机制 李玉勤金胜利凌亚平【摘要】目的 观察内毒素致幼年大鼠感染性脑水肿后水通道蛋白4(A Q P 4)的表达变化。方法将5 0 只幼鼠随机分为内毒素组(4 0 只)和对照组(1 0 只)。建立内毒素致大鼠感染性脑水肿模型，于术后6 h、1 2 h、2 4 h 和4 8 h 处死动物，分别行脑组织含水量血脑屏障通透率的测定，以伊文思兰含量 判定血脑屏障通透率，并应用免疫组织化和 T-P C R 技术检测脑组织内A Q P 4 蛋 白 和m B N A 的表达水平。结果 内毒素组脑组织含水量和伊文思兰含量明 显高于对照组。在内毒素注射后6 h 时，脑组织d A Q P 4 的表达明显增加，1 2 h 时达高峰，各时间点与对照组比较均有显著性差异(尸 0 0 1 o结论 感染 性脑水肿后脑组织中 A Q P 4 的表达增加，且与脑组织含水量和B B B 的破坏呈正相关。【关键词】水通道蛋 白 4；脑水肿；内毒素 A b s t r a c t O b j e c t i v e T o o b s e r v e t h e e x p r e s s i o no f a q u a p o r in-4(A Q P 4)ini n f la m ma t o r yb r a i n e d e ma b y i n j e c t in g e n d o t o x i nin t o i n f a n t r a t s Me t h o d s A t o t a l o f 5 0 i n f a n t r a t s w e r e d i v i d e d in t o e n d o tox i n(I l=；4 0)a n d c o n t r o l g r o u p(1 1=1 O)r a n d o m l y F i r s t l y,we e s t a b l i s h e d a b r a i n e d e ma mo d e l b y e c t i n g e n d o t o x i n in t o i n f a n t r a t s T h e b r a int i s s u e w a t e r c o n t e n t a n d E v e n s b l u e c o n t e n t w e r e d e t e c t eda t 1 2 h，2 4 h，a n d 4 8 ha ft e r i n j e c t i o n,and i mm u n o h is to c h n i s l r y a n d R T-P C Rwe r e u s e dt oinv e s t i g a t e AQP 4 e x p r e s s i o nint h e b r a inti s s u e Resu l t s B r a i nwa t er c o n t e n t andE v e n s b l u e c o n t e n t we r e mu c hh i g h erin e n d o tox i ng r o u p s t h a n c o n t r o l g r o u p T h e l e v e l o f A Q P 4 s i g n i fi c a n t l yin c r e a s ed at 6 h a f te r e c t i n g e n d o tox i n,a n dth e p e a kti me o f i t w a s at 1 2 h The d i ff e r e n c eb e t w e e n the l e v e l o f AQP 4ine n d o tox i ng r o up s andt h e c o n l r o l g r o up h a d s t a t i s ti c s i g n i fi c ance at e v e r yti me p o int Co n c l usi o n T h e r e s u l ts s u g g e s t t h a t t h el e v e l o f AQP 4 inc r e a s ed in i n f l a mma tor yb r a i nede mab ye n d o tox i ninto i n f a n tr a ts Andith a sp os i ti v er e l a t i o n s hipwi th theb r a in tis s u ewa t e r c o n t e n t 【K e y WO r d s】Aq u a p o r i n 一 4；B r a i n e d e ma；L i p o pol y s a c c h a r i d e 水通道蛋 t(A Q P s)是最近发现的一组与水通透性有关的细 胞膜转运蛋白，已经证实水通道蛋 白4(AQP 4)在脑组织水平衡 作者单位：2 1 2 0 0 1 江苏大学附属医院儿科(李玉勤金胜利凌亚平)的调节中起重要作用。研究发现在细胞毒性脑水肿模型中敲除 AQP 4 基因大鼠水肿程度和颅内压明显减轻。而血管源性脑水 肿模型中敲除AQ P 4 基因大鼠水肿程度和颅内压明显增高。从 群体，关注她们的生殖和身 健康是党和政府工作重点之。本次对长安区已婚妇女普查结果显示，农村已婚妇女生殖健 康状况不容乐观。资料反映，生殖道感染率4 5 7 6，占总患病率 为6 7 2 1，其中宫颈炎、阴道炎、盆腔炎和官颈息肉为主。本研究调查结果显示，RTI 的患病与年龄有很大关系，发现 3 0-3 9 岁组患病率最高，为5 8 3 6 其次为4 0 4 9 岁组5 2 8 3 原因可 能是此两年龄段妇女上有老下有小，承担家庭和社会的负担较大，丈 夫常外出 打工，加之务农的劳作，所以常常忽视了自 身健康。此研究结 果还显示，2 0 2 9 岁组与 5 哕 组之间差异无统计学意义 O 0 5)。其 衰退，体内雌激素水平明显下降，阴道粘膜变薄，上皮细胞内 糖原减 阴道内 I 隹黼，多为5 0-7 0，嗜酸性的乳酸菌不再为优势菌，局部抵抗力降低，其f Ii 国嫡菌迂 渡 繁殖容易 侵引起炎症。3 1 与生殖道感染有关的危险因素本调查发现，R TI 的患病 与文化程度低、孕育次数多、不良的卫生行为和生活习惯、健康意识 差等因素存在密切相关性。在正常状态下，虽然阴道内有多种细菌 存在，但由于阴道与这些菌群之间形成生态平衡并不致病。其中乳 酸杆菌、雌激素和阴道 值起重要作用。若I 生 交，尤其经期性交，体 内雌激素水平下降，阴道灌洗等均可使阴道p H 值升高，不利乳酸杆 菌生长，可使其他致病菌成为优势菌，引起炎 u。研究表明，阴道冲 洗会造成阴道内菌群的紊乱。本调查发现，阴道冲洗者R T I 患病率 5 1 9 8，此卫生行为成为I I 的突出 危险因素。其原因是农村妇女文 化低，更易受到各种媒体和市场上宣传的各式各样阴道冲洗用品的 误导，误将阴道冲洗是种好的卫生健康习惯。即 临床专业医生告 知此做法是错误的，仍坚持冲洗，并认为不会造成什么严重后果删。此外，农村生活卫生居住条件较差，洗浴不方便，多数人又无清洗外 阴的习惯。有人自 感下 生殖道不适，有的羞于就诊，有的因家务或农 活，迟迟不去诊治，以至延误疴隋，酿成严重不良后果。3 2 RT I 的防治 通过本次调查，RT I 仍是农村妇女生殖健 康的一大难题，采取有效干预措施预防和控制R T I 的发生和流行，仍是今后工作的重点。首先，应坚持三级预防，以一级预防为主的 原则。运用多种方式向广大农村妇女宣传R TI 的危害f生和可预防 性，普及RT I 的防治知识，提高她们对生殖健康的保健意识，让她 们积极主动参与妇女病普查，指导患者及时就医，遵从医嘱，控制 疾病传播。其二，积极引导农村妇女建立健康的生活方式，增强防 病能力。其三，计生部门应与卫生、妇联等部门密切配合，定期进 行普查普治工作，加强随访，了解RTI 患者的治疗和预后情况，提 高R TI 复诊率，尽量减少R TI 的不良后果发生。其四，建立农村妇 女健康档案，以便正确掌握各地域不同时期危害妇女生殖健康的 主要疾病，为政府制定政策和防治措施提供理论依据。团 参考文献【1】乐杰 妇产科学 M】第7 版 北京：人民卫生出 版社，2 0 0 8：2 3 6 2 2 A n d r i s t L c V a g i n a l h e a l t h a n d i n f e c t i o n s J J 0 b s t e t G y n e c o l N e o n a t a l N u r s，2 0 0 1，3 O(3)：3 0 3 嘲 N e s s P B，H i l li e r S L，R i c h t e r H E，e t a 1 W h y w o m e n d o u c h e a n d w h y t h e y m a y 0 1 m a y n o t s t o p J S e x T r a n s m D is 2 0 0 5，3 o(i)：7 1 7 4 【4】孙晓筠，张爱国，单宝德，等 山东省妇女生殖健康状况及防治 对策 J 中国妇幼保健，2 0 0 3，1 8(9)：5 6 0 5 6 1 2 当代医学2 0 0 9 年7 fl第1 5 卷第1 9 期总第1 7 4 期C o n t e mp o r a r y Me d mi n e，J u 1 2 0 0 9，Vo 1 1 5 No 1 9 I s s u e N o 1 7 4 基因敲除的模型研究中可以看出AQP 4 蛋白具有双向水转运功 能。不同病因和类型的脑损伤、脑水肿，AQP 4 的表达及时限 不尽相同，目前有关AQ P 4 与感染性脑水肿形成中的作用报道 较少。本实验通过内毒素致幼年大鼠感染性脑水肿模型，探讨 AQ P 4 在感染性脑水肿中的作用机制，旨在为临床治疗提供新 的理论依据。1 材料与方法 1 1 动物模型的制作和标本的制备 实验动物为健康1 月龄大 鼠，体重8 0 1 0 0 g，由郑州大 学实验动物中心提供。随机分为对照组即生理盐水(n o r ma l s o d i u m，NS)组(N=5)和实验组即内毒素(L P S)组(N=4 0)，L P S 组按注入L P S 后不同时间点又分为4 个亚组(6 h、1 2 h、2 4 h、4 8 h)，每组1 O 只，分别进行脑组织含水量测定、E B 含量的测 定及免疫组化和RT-P C R法分别行AQ P 4 蛋白和A QP 4 mRNA的 表达量的测定。参照湖南医科大学脑水肿动物模型的制作方法，成功建立L P S 感染模型后，经右颈外静脉近心端注入2 伊文思 兰(E v e n s b l u e，E B)(2 ml k g)，推注时间1 2 mi n。NS 组用同 法注射等量的灭菌生理盐水及E B。均有5 只不注射伊文思兰，以便进行免疫组化染色。对照组和造模成功的大鼠分别到预定时间后，行开胸术 暴露心脏，用 1 2 号灌注针头沿左心室插入主动脉，迅速剪破 右心耳，同时用冰生理盐水约2 0 0 ml 经左心室主动脉灌注冲 洗血液，至右心耳流出淡红色液体后用4 含4 多聚 甲醛的 0 1 mm o l L 磷酸缓冲液(p H 7 4)2 5 0 ml 快速灌注固定，至头、颈、躯干及尾 巴变硬即可。取左侧视交叉处大脑组织浸入上 述 固定液中固定2 44 8 h。常规石蜡包埋，连续切片，片厚 5 mm。以备苏木素、伊红(HE)染色和免疫组化染色。每组注 射E B的5 只大鼠于预定时间后，断脊髓处死，取脑所用器械、耗材均经高温或DE P C处理。留取左侧大脑组织视交叉前后约 5 ram厚，置入1 5 ml 的E P 管中，迅速于7 0 V冰箱里保存。称取 左侧大脑约3 0 0 mg 备测量E B 含量。1 2 检测方法 1 2 1 免疫组化方法检测AQP 4 石蜡切片常规脱蜡，S P 染色，重氮氨基苯(d i a z o a mi d o b e n z e n e，D AB)显色时间统一 限定为2 0 mi n。免疫组化染色对照：同一组玻片分别用正常山 羊血清和P B S 代替兔抗AQ P 4 孵育，其余步骤同上，用以检查 AQ P 4 免疫反应的特异性。图像采用B i o S e n s D i g i t a l 图像分析系 统处理。1 2 2 RTPCR检测AQP 4 mRNA的表达 AQP4 引 物 通过 基 因 库查 找 基 因序 列，设 计 引 物序 列 为：上 游 5 一TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC一3；下游 5 一 cC AGCAGTGAGGT TTCC ATG-3 ，扩增片段为2 1 9 b p。D-a c t i n g 物上游5 一CCAc AGTCC ATGCCATCAC T3 ；下游5 _ TCCACCACCCTGTTGCTG TAG-3 ，扩增片段 为4 3 0 b p(以上引物 由上海生物工程技术研究所合成)。取约 4 0 mg 脑组织用T r i z o l 试剂盒提取总RNA，采用一步法进行RT P C R 反应，反应条件：5 0 逆转录3 0 mi n，9 4 逆转录酶失活 2 mi n，9 4 变性4 5 s、5 7 E退火4 5 s、7 2 延伸2 mi n、循环次数 3 0 次，末次循环后7 2 延伸8 mi n I D-a c t i n 作为 内参，反应条 件：5 0 逆转录3 0 mi n，9 4 逆转录酶失活2 mi n，9 4 变性4 5 s、6 2 退火4 5 s、7 2 延伸2 mi n、循环次数3 0 次，末次循环后 7 2 C延伸8 mi n。PC R产物电泳后用凝胶成像分析系统紫外分光 成像，记录积分光密度值。用 p-a c t i n mRNA为内参照进行校 正，各样本的基因表达量用该样本扩增后产物在凝胶上条带的 光密度值与 p a c t i n 基因条带的光密度值之比半定量表示。1 2 3 脑组织含水量测定 应用干湿重法测定感染性脑水肿后不同时间点脑水肿的程 度。依据公式：脑组织含水量()=(湿重一 干重)湿重 1 0 0。1 2 4 血脑屏障通透率 以伊文思兰作为示踪剂监测血脑屏障的损伤程度。用甲酰 胺法测定脑组织E B 含量，判断B B B破坏程度。1 2 5 将同一时间点的脑组织含水量与E B 含量进行相关 分析。1 2 6 将同一时间点的脑组织A QP 4 蛋白含量与E B 含量进 行相关分析。1 2 7 将同一时间点的脑组织A Q P 4 蛋白含量与AQ P 4 mRNA 表达量进行相关分析。1 3 统计学分析 采用国际通用统计分析系统S P S S 1 1 0 统计软件处理，多组 样本均数间比较采用单因素方差分析，使用前先行方差齐性检 验，进行组间两两比较，L P S 组脑组织含水量与AQ P 4 蛋白含量 行p e a r s o n 相关分析，以c【=0 0 5 作为检验水准，所有数据采用 均数士标准差 )表示。2 结果 2 1 形态学变化 肉眼观察注射E B 的NS 组和L P S 组实验 动物全身粘膜蓝染，L P S 组开颅取脑可见脑组织蓝染，左侧较 右侧肿胀明显，体积增大，脑沟变浅，脑回增宽，脑膜紧张。对照组无明显变化。脑组织病理形态学变化为脑组织切片经 HE 染色，L P S 组与对照组比较：皮质和髓质边界不清晰，均可 见弥漫性灶性水肿区，血管扩张，炎性细胞浸润，胶质细胞肿 胀，神经元空泡变性、核坏死。2 2 脑组织含水量变化和E B 含量变化L P S 注入6 h 后脑 组织含水量及E B含量已开始增加，1 2 h 达到高峰，2 4 h至4 8 h 逐 渐下降，4 8 h 时仍高于NS 组水平。各时间点均较NS 组高，差异 有统计学意义(P 0 0 1)(见表1)。2 3 各组大鼠脑组织AQ P 4 含量的变化(见表l，图1)光 镜下可见NS 组脑组织AQ P 4 表达成弱阳性，阳性细胞主要为胶 质细胞及血管周围，神经元未见着色。L P S 组注射L P S 后6 h，L P S 组脑组织AQP 4 表达就增加，于 1 2 h 达高峰，在血管周表 达强烈，成深棕黄色，2 4 h 至4 8 h 时渐减少，但仍明显高于NS 组。图像分析系统测定阳性区面积百分比，L P S 组各时间段与 Ns 组比较，差异有统计学意义 0 0 1)(见表1)。2 4 各组大鼠脑组织AQ P 4 mRNA表达变化(见表1)R T _ P C R反应后，琼脂糖凝胶电泳2 1 9 b p 处可见清晰亮度不同的条带，与NS 组比较L P S 组脑组织AQ P 4 mRNA表达水平在不同时间段 均显著升高，1 2 h 达高峰，此后逐渐下降，4 8 h时仍高于NS 组(见图 2)。L P S 组各时间段与N S 组差异有统计学意义(P 0 0 1)。2 5 实验组与对照组脑组织含水量、E B 含量、AQP 4 表达 量、AQ P 4 mRNA表达量之间的相关性分析 脑组织含水量和 E B含量呈正相关(r：0 8 2 9，P0 0 1)，脑组织AQ P 4 表达水平 3 v 当代医学2 0 0 9 年7 H第l 5 卷第l 9 期总第1 7 4 期C o n t e mp o r a r y Me d i c i n e，J u 1 2 0 0 9，V o 1 1 5 N o 1 9 I s s u e No 1 7 4 表l 脑组织含水量(，士 )，E B 的含量(g g，士 )及A Q P 4 阳性区面积百分比，)的改变 注：L P S 组含水量与NS 组比较 P O O 1，L P S 组E B 含量与NS 组比较 P 0 0 1 L P S 组E B 含量与NS 组比较”P 0 0 5，免疫组化AQ P 4 阳性区百分比L P S 组与NS 组比较“P 0 0 1 l R T P C R AQ P 4 mR NA 灰度值与NS 组比较 P 0 0 5 RT P C R A Q P 4 n 1 R N A灰度值与N S 组比较“P 0 0 1。图l 耄 6 l 2 4 h 4 5 h 时 6 h l 2 h 2 4 h 4 戢 I 咔 闷O 0 濑 一l|恻匾 图1 各组大 鼠不 同时间点脑组织AQP4 表达变化 图2 各组大鼠不同时问点脑组织A Q P 4 mR N A变化 与E B含量呈正相关(r=0 8 0 8，P 0 0 1)。AQP 4 在蛋白水平与 mR NA 水平表达量呈正相关(r=0 8 7 8，P 0 0 1)3 讨论 Z y o r k l a t z o t 4 1 把脑水肿分为两大类：血管源性脑水肿和细胞 毒性脑水肿。中枢神经系统感染后激活的自身破坏过程，包括 水肿、炎症反应、局部缺血、生长因子、细胞因子、再灌注、C a 溢出及过氧化基团异常变化等对脑组织产生的毒害作用，将引起血脑屏障破坏，血管内皮的选择性和渗透性受到影响而 促进血管性水肿的形成，表现为在血管外间隙内聚集富含蛋白 的血浆样液体。脑组织中水通道蛋白含量丰富，其中A Q P 4 的分布和表达 最为广泛。AQ P 4 主要功能为介导水跨细胞膜转运，并对水代 谢和渗透调节起主要作用。AQ P 4 富含于脑和脊髓表面的软 膜，靠近蛛网膜下腔的胶质细胞，脑室和中央管的室管膜细胞 及位于血管周围的胶质细胞表面上，在脊髓毛细血管内皮细胞 也有着广泛的分布。血脑屏障(B B B)是存在于血液与中枢神经 系统之间的一种调节界面，主要包括三层结构：毛细血管 内皮 细胞、基底膜和包绕在脑毛细血管周围的星形胶质细胞足突。微血管的内皮细胞是构成BB B的基本框架，有星形胶质细胞的 足突组成的一层坚韧的胶质膜覆盖了脑毛细血管周围8 5 左右 的面积，星形胶质细胞对于B B B 的完整性有诱导和维持的作用。解剖学研究发现，随着大脑生长发育的成熟脑内AQ P 4 表达水平 逐渐升高，而且其水平的高低与B B B的完整性紧密相关，本试验 结果显示了AQP 4 在感染性脑水肿中表达的动态过程：注射L P S 后6 h 脑组织含水量增加、B B B 破坏已经发生，与对照组比较差异 具有统计学意义(P 0 0 1)，随着时间延长水肿逐渐加重、B B B 通 透率逐渐增加，1 2 h 达高峰，4 8 h 逐渐恢复，且脑组织含水量与E B 含量呈高度正相关。注入L P S 后AQ P 4 在毛细血管周围胶质细胞 上表达明显上调。脑组织水含量和E B 含量呈正相关，提示感染性 脑水肿发生的早期，即伴有血脑屏障的开发，脑水肿和那个高峰 期时血脑屏障破坏最严重，此时A QP 4 表达也达高峰。AQ P 4 表达 在参与形成B B B 的星形胶质细胞足突处，感染性脑水肿发生时，AQ P 4 表达上调，水转运能力增强，推测毛细血管周的AQ P 4 表达 上调可能引起毛细血管通透性增加，对小分子的通透性增加，使 大量水液进入脑组织，当胶质细胞肿胀破裂时，引起B B B的破坏，导致血管源性脑水肿发生。P a p a d o p o u l o s TM 等人研究发现在脑肿瘤模型产生的单纯血 管源性脑水肿模型中，AQP 4 基因敲除小 鼠的颅 内压和脑组织 含水量显著增加，可能是由于AQP 4 介导的水分子经细胞转运 机制破坏，影响水肿液的吸收。本实验中，AQP 4 在蛋白水平 与mRNA水平表达量呈正相关，表明AQP 4 的表达在蛋白和 mRNA水平是一致的。1 2 h 后脑内A QP 4 水平逐渐降低，产生的 机制可能是细胞间隙中增高的K、H 以及谷氨酞胺等一些兴奋 性氨基酸浓度上升，由此胶质细胞激活细胞内信号传导系统，导致蛋白激酶C活性升高，对AQ P 4 进行磷酸化反应，使其生物 活性丧失，从而在一定程度上减少 由破环的血脑屏障进人脑组 织细胞间隙，以及经胶质细胞膜进入细胞内的水分子的量，延 缓血管源性脑水肿的形成，但随着AQ P 4 表达降低，水转运功能 下降，导致液体在间质积聚，从而也加重了细胞毒性脑水肿。本研究结果提示AQP4 在调节脑 内水液平衡中起重要作 用，但AQP 4 在感染性脑水肿中精确的作用机制还需进一步研 究。对A Q P 4 表达及功能调节的深入研究，将为临床治疗脑水 肿提供新的策略。团 参考文献 1 Z a d o r z，B l o e h 0 Y a o X，e t a 1 A q u a P o r in s：r o le i n c e r e b r a l e d e m a a n d b r a i n w a t e r b a la n c e J】P r o g B r a i n R e s，2 0 0 7，1 6 1：1 8 5-1 9 4 2】M a n l e y T，F u j i m u r a M i k i，e t a i A q u a e o d n-4 d e l e t i o n i n m ic e r e d u c e s b r a i n e d e m a a f t e r a c u t e w a t e r i n t o x ic a t io n a n d is c h e m i c s t r o k e J】N a t u r e M e d ic i n e，2 0 0 0，6(2)：1 5 9-1 6 3 【3】P a p a d o p o u lo s M C，M a n e ly G T，K r is h n a s，e t a 1 A q u a p o r in-4 f a c i l it a t e s r e a s o r p t i o n o f e x c e s s f l u id i n v a s o g e n ic b r a i n e d e m a J】F A S E B J，2 0 0 4，I 8(2)：1 2 9 7-1 2 9 3【4】K l a t z o 1 N e u r o p a t h o l o g i c a a s p e c t s o f b r a i n e d e m a J】J N e u r o p a t h o l E x p H e u r o 1 1 9 6 7，2 6：1-1 4【5】R a s h J E，Y a s u m o r a J，H u d s o n C S D i r e c t i m m u n g o l d l a b e l i n g o f a q u a p o ir n-4 i n s q u a r e a r r a y o f a s t r o c y t e a n d e p e n d y m o c y t e p l a s m a m e mb r a n c e i n r a t b r a i n a n d s p i n a l c o r d J P r o c N a t l A c a d 8 c i U S A i 9 9 8，9 5：1 f 9 8 j l 1 9 8 5【6】N i c e B，F r ig e r i A，N i c c h i a G P，e t a 1 R o le o f a q u a p o r in-4 c h a n n e l i n t h e d e v e lo p m e n t a n d a n d in t e g r i t y o f t h e b l o o d r a i n b a r r i e r J】J C e l l$c i，2 0 0 1，1 I 4(7)：1 2 9 7-1 3 0 7 4