菌根真菌感染墨兰与建兰根状茎对呼吸速率和几种氧化酶活性的影响.pdf

热 带 亚热 带植 物 学 报 2 0 0 2，】0(】)：4 6 5 0 J o T ropi c a l a n d s曲 叩 t 嘶 菌 根真菌感染墨兰与建兰根状茎对 呼吸速 率和 几种 氧化酶活性的影 响 潘超 美 陈汝 民 李玲 广州中医药大学 中药学院，广东 广州 5 1 0 4 0 7；2华南师范大学生物系，广东 广州 5 1 0 6 3 1)摘 要：用 从野 生 建 兰根 部分 离的 菌根 真 菌 P】5菌 株感 染 墨兰 rub i d i u m x i a e n x e和建 兰 mb i d l u m n t 的根状 茎后，使 寄主的呼吸速率 细胞 色素 C氧化酶、过氧化物酶活性 明显增 高，而感 染前后 1 AA氧化酶活性变化不明显。两个品种相 比较，建兰根状茎的呼吸速率、细胞色素 C氧化酶和过氧化物酶 活性 均 比墨 兰 的高 但 墨 兰的 根状 茎 I AA氧 化 酶活 性 则高 于建 兰。关键 词：菌根 真 菌；墨兰；建 兰；根 状茎；氧化 酶 类；呼吸 速率 中图分 类号：Q9 4 5 】9 文 献标 识 码：A 文 章编 号：1 0 0 5 3 3 9 5(2 0 0 2)0 1 0 0 4 6-0 5 Effe c t o f M y c o r r h i z a l I nf e c t i o n o n Re s pi r a t i o n a nd Ac t i v i t i e s o f S o me Ox i d a s e i n R h i z o me o f C y mb i d i u m s i n e n s e a n d c I e n s if o l i u m P A N C h a o m ei C H E N R u m i n LI Li n g (I 如 o fP h a r m u G u w z h t d z,e i t y T r a d z tJ m a l C h i s e M e d i i n e Ou a n g z h o u 5 1 0 4 0 7 C h i n a；2 De p t u n t B i f ll【S o u t h C h i n a N o u n al n 叭 m Gu n g z h o u 5 1 0 6 3 0 Ch i n a)Ab s t r a c t：E n d o p h y t i c my c o r r h i z a I fi mg u s P1 5 i s o l a t e d fr o m t h e l o o t S o f wi l d C y mb i d i u m e if o l i u m wa s u s e d t o i n f e c t the n o a my c o r r h i z a l r h i z o me s o f C s i n e n e a n d c if o l i u m A ma r k e d i n c r e a s e i n r e s p i r a t o r y,r a t e，c y t o c h r o me C o x i d a s e a c t i vi t y，a n d p e r o x i d a s e a c t i vi wa s s h o wn i n the fl i z o me s o f t wo i nf e c t e d s p e c i e s，wh i l e the c h a n g e i n I AA o x i d a se a c t i vi ty wa s s I i g h t Th e l e v e l s of r e s p i r a t o r y r a t e，a c t i v i t i e s o f c y t o c h r o me C o x i d a s e a n d p e r o x i d a s e i n t h e r h i z o me s o f c e n s if o l i u m,v are a l l h i g h e r tha n tho s e o f C n P r e b e f o r e o r a l t e r i n f e c t i o n b u t t h e I AA o x i d a s e a c t i v i ty s h o we d the c o n t r a w Ke y wo r d s：My c o r r h i z a l f u n g i；c y 啪s i n e r c e；C y mbi d i u m P l i um；Rhi z o me；Ox i d a s e s；Re s p i r a t o r),r a t e 兰科 植物 是菌根植 物，在 自然 条件 下其胚 细胞 不能 形成酶 系统来 满 足萌 发过程 的营养 所 需 l。近年来 的一 些研究 结 果表 明，菌根真 菌 能够 吸收多种 无机 和有 机化合 物满 足 兰科 植 物体 生长 的需 要；菌丝入侵到植物细胞 内被同化，同时真菌菌丝也能激发寄主植物体内的一系列生理变化，从而 促进了寄主植物体内的生理代谢活动。细胞色素氧化酶是植物体呼吸链中的末端氧化酶，它调控 着植物 细胞 的呼 吸速率，并 直接关 系 到 A T P的生 成；而 I Ab 氧化 酶和过 氧化 物 酶与植 物细 胞的生 长和抗逆性有密切的联系 一直为研究者所关注。目前有关菌根真菌与兰科植物共生感染后的 生理研 究报 道不 多见。本试 验 以墨兰(C y mb i d i u m s n e)和建 兰(c e n s 蜘f u m)的根 状茎为材 料，探讨 菌根真 菌感染 对 兰科植物 根状茎 的呼 吸速率 和 对细胞 色素 C氧化 酶、I AA 氧化酶 和 过氧化 物 收稿 日期：2 0 0 l 一 0 3 2 3 接受 日期：2 0 0 1 0 8 2 0 基金项目：广东省“九五 重点科投攻关项 日(0 4 9 7 1 1 9 6 1 1 0 1 维普资讯 http:/ 第 1 期 潘 超 美 等：菌根 真 菌感 染 墨兰 与建 兰 根状 茎对 呼 吸速率 和 几 种氧 化 酶活 性 的影 响 4 7 酶活性 的影响 为 围 兰的快 速 繁殖 生 产提供 部分科 学依据 1 材 料和方法 实 验材料 由华南 师范 大 学 国兰研 究 中心提 供 墨兰(C y mb i u m s i n e n s e)无菌 根状 茎。建 兰根状 茎从广东新 丰县采 集野生建 兰(c e F t if o l l u m)的种子，经无菌 培养 后获 得。根状 茎在 1 2 MS+2mgL。NAA+2mgL 6-B A+I O C M(椰乳)+1 蔗糖 的生长 培养 基 中继 代培养保 存。菌丝滤液的制备 菌根真菌 P 1 5 号菌株从野生建兰根段上分离、纯化后获得。把 P 1 5号菌 株接 种 到含 有 麦麸 5 0 gL 、葡萄糖 2 0 gL-。、KH：P O 1 5 gL 、维 生素 B 1 0mgL-。的液 体培 养基 中 2 8 c 下 摇床 1 0 0 1 2 0 r mi n 振荡培养两周，待菌丝体 充分生长后，将 菌丝体取出、捣碎、过滤，滤液 备用。根状 茎感 染真 菌 的培 养 选 取继 代培 养 3 0 d、生 长 旺盛、体 积 大小 较 一致 的根状 茎 2 g 转 到含 有 3mI 菌丝滤 液 和 1 0 0ml 感 染 培养 基(I MS+2mgL。NAA+2mgL 6-B A+1 O C M+1 羧甲基纤维素+0 1 葡萄糖)中 2 8 自然光照下，摇床 1 0 0 r mi n 振荡培养 3 5 d。每周一次将根状 茎转移到 不含 菌 丝滤 液 的感 染 培养基，以防止菌 丝生长 过盛。以未感染 的根状 茎作 为对 照。在感 染 培养开 始后 每 隔 3 d(后 期 隔 5 d)取 样一 次作相 关 的生 理指标 分析。呼吸速率的检测 呼吸速率用 wa r b u r g 微量呼吸测压仪测定。每个 Wa r b u r g小瓶 内放人 1 0 g鲜重的根状茎，加入 2m1 0 2mo l L磷酸盐缓 冲液(p H 7 0)，小烧瓶 内室放 置一张吸附了 0 2 ml 2 0 K O H的小滤纸 2 h内每隔 2 0 m i n 记录一次读数。测定温度为 2 5。呼吸速率以每克鲜重 的根状 茎每 小时 吸氧 的微升数 表示。五个重 复测定，取 平均值。酶 液的提 取 准确 称取 2 0 g根状 茎 置 于玻璃 研 钵 上，迅 速冷 冻(I C一 1 0 )1 0 mi n。加 入 1 0ml 0，1 mo l F L p H7 0磷 酸盐 缓 冲液，置 冰浴 中研磨 成匀浆，于 4 下 7 1 6 2 x g离心 2 0mi n，上 清液 为粗 酶液。细胞 色素 c氧化 酶 活性测 定 参 照陈 良碧 的方 法 取 1 0 l 粗 酶 液置 于 1 1 2 m 的 比色杯 中，加入 0 2mo l L，p H 7 0的磷酸缓冲液 2 6ml，0 0 4 细胞色素 c 0 2ml，0 4 二 甲基对 苯二胺 盐酸溶液 0 1 ml，置 3 7 水浴保温 3 0 mi n 立即冰浴冷却 迅速在 5 1 0 r i m波长下测定 O D值 的变 化。酶 活性 OD mg F W mi n 表示。每样 三个重 复，取平均值。过 氧化 物酶 活性测 定 参照 张志 良 7 1 的方 法。取粗酶 液 1 0 1 置 于 1 m比色杯 中，加 人反 应混 合 液(0 2mo F L磷 酸缓 冲液 p H6 0 5 0ml，3 0 H O 0 0 2 8ml，愈创 木 酚 0 0 1 9m1)3ml，立 即开 启秒表记录时间，于 4 7 0 n m波长下 读取 1 mi n时的 O D值。以煮沸 5mi n的酶液作对照。每样三 个重 复。酶 活性 以 O D mg。F W mi n。表示 I AA氧 化酶 活性 的测 定 参 照张 志 良 l 和徐如 捐等 的方法。取 粗酶 液 2 ml，加 入 4 ml 冷 丙酮，置 冰 箱 中 沉 淀 过夜 后 去掉 丙酮 用 4ml 0 0 2mo l L的磷酸 缓 冲液溶 解沉 淀。再 经 1 6 1 1 4 x g 离心 1 5 mi n后加 3 ml 反应试剂(1 9 8 gMn C I ，1 6 3 g 2,4 d i c h l o r o p h e n o l，2 0 0 gI A A，用磷酸缓冲 液配制)2 5 下黑暗保温 1 5 h后 取保温液 0 5 m1 加 2ml S a l k o ws k i 试剂(将 0 1 3 5 gF e C I 溶解 于 5 0 ml 3 5 的 HCI O 中)，同样 条件下 再 放置 3 0 mi n 5 3 0 r i m 比色测定 溶 液 中 I AA 的含量，以煮 沸 5 mi n晌酶液作对照 用每克鲜重材料每小时内分解破坏 1 A A的微克数表示酶活力大小。每样 三个重 复，取平 均值 维普资讯 http:/ 热 带 亚热 带 植 物学 报 第 1 0卷 2 结果 和分 析 2 1 菌根真 菌对 墨兰 和建兰 根 状茎呼 吸速 率 和细胞 色素氧化 酶活 力 的影 响 无 论是 否被 菌根真 菌感 染，建兰 的呼吸速 率要 比墨 兰高得 多(图 1)。与菌根 真菌感 染 的墨兰和 建兰 根状茎 相 比(图 1)，在感 染 3 0 d的过程 中，对照 根状 茎呼吸 速率 变 化不大，只在 开始 缓慢 地持 续上 升，到 了第 1 0天后 趋于较 平稳状 态。被菌 根真菌 感染后 的根状 茎 呼吸速率 始终 高于未感 染 的 对照 分别 在第 9天 和第 2 0天 出现 了两个 氧吸 收的高 峰。一般来说，真菌侵 染寄 主后 1 0 d左右 细 胞 内的菌丝 团就 开始消解】。在前一 实验 中，我们 观察到 Pl 5号菌株 的菌 丝 团的初次解 体发生 在侵 染寄主的第 9 1 1 天之间。所 以，推测第一个高峰 出现可能是寄主细胞 内菌丝团开始消解的时候，由于菌丝 团在寄 主细胞内解体，释放出能被寄主细胞利用的营养物质，从而刺激 了寄主细胞的物 质代谢，使呼吸速率产生跃升。菌丝团消解后的细胞可以再次被相邻的菌丝重新感染，在细胞 内又 形成新的菌丝团，一段时间后菌丝 团再次解体：或者也可 能是其它感染区域的细胞群的菌丝 团解 体使 呼吸速率 再 次跃 升，即出现在 2 0 d时的 高峰。细胞色素 C氧化酶是植物呼吸链 中的末端 氧化酶，位于线粒体膜 中，催化将电子从细胞色素 c(c y t c)传到 o 的反应 在 控制 电子传递 中起 着很重要 的作 用。从 图 2看 出 真菌感 染过程 中，墨兰 和建 兰根 状茎 的细胞 色 素 C氧化 酶 活性 皆提高，表 明感染后 的共 生体 系 比未感 染前 的根 状茎本 身 具有更强的代谢能力。两个品种比较 未感染建兰的细胞色素 C氧化酶活性高于墨兰的活性 但从 感 染后 的变 化 幅度看，墨 兰酶 活 性 的增 值 幅度 为 3 3 一 1 5 0，平 均 增加 比率 为 9 1；而 建 兰的增值 幅度为 2 6 8 一 8 2，平均增加比率 为 3 9 6。从整个培养过程来看，酶活性呈持续升高趋势 在第 9 天出现高蜂，以后缓慢下降，到 2 0 d时再次出现高峰 这与呼吸速率的变化基本一致。3 I 2 l I l l 灯 蔓 瞄染后 王散 D a y s a f t e r i n f e c t j o n 图 l茁根真苗感染后两种兰花根状茎 图 2 苗根真菌感染扁l两种 兰花根状茎 呼吸速率的变化 细胞色隶 C氧化酶活性 的变化 Fig l Ch a ng e s i n n s p i r a t o r r a t e of a nd Fi g 2 Ch a n g e s i n c y t o e h r o me C o xi d a s e a c t i v i t y o fC c if,1 I u m r h i z o me s a f t e r my c o r r h i z a i i n f e e t i o n a n d c ,u rn r h i z o me s a i i e r my c o r r h i z a l i n f e c t i o n 未 感染 建 兰 Unln c kd 肺扣n ：口 感染 后 建 兰 I n f e c t e d c l i u m；未感 染墨 兰 Un i n f e c t e d i u e n s e；0感 染后 墨 兰 f e c t e d c i a e q e c l-u l E 芒一 e。_】一，一 !日 一 0 0 _ g L I u D 0 掣烬蕾 慵 0*脚普 再 m 啪 -秘 柚 一 l-I I芒l-口 苫 3 o 一 芒 o=J l 嚣 童 昏 瞥 维普资讯 http:/ 第 1 期 潘 超 美 等：菌根 真菌 感 染墨 兰与 建 兰根状 茎对 呼 吸速 率 和几种 氧 化酶 活 陛的 影 响 4 9 2 2 菌根真菌感染过程中 I AA氧化酶和过氧化物酶活性的变化 在 菌根真 菌感 染 过程 中，I AA 氧化酶 活性 变化 幅度 不 大(图 3)，基 本维 持在 相对 稳定 的水平 墨兰 的 I AA 氧化 酶 活性 比建 兰高 一般认 为 I AA含量 与其酶活 性之 间存在 着 反 比关 系，I AA氧 化酶活性高，使 I A A含量减少，生 长速度慢。在本实验条件下，墨兰根状茎的生长也稍 比建兰慢些 但 I A A氧化酶活性容易受环境因子的影响，如低温和水分胁迫都会增加 I A A氧化酶 的活性，I AA 含量随之降低 从本实验结果来看 真菌的介人，对 I AA氧化酶活性的影响不大，同一品种感染前 后 的酶活-眭水平差 异不 大，感 染 后 I AA酶 活性在 第 1 0天 和第 2 5天时稍 有波 动，这 可能是 由于胞 内菌丝体解 体导致 其它代谢 活 动加 强，相互 影响所 致 而过 氧化物酶 活性 的变化(图 4)则有 所 不同。在感染后 的第一天，被菌根 真菌感染 后 的两种 根 状茎 的过氧 化物酶 活性 高 于对 照 感 染的初期，酶 活性 不断 上升，第 7天 达到 了高 峰，随后 逐渐 下 降，到培 养后期(3 0 d)，酶活性 水平 已接 近来感染根状 茎 的水平。兰科 菌根 真菌是 能与 兰科植 物形 成共 生关 系 的内寄 生菌 但 对于非 兰科 植 物却是 致病性 很 强 的腐 生菌，尤 其是 Rh i z o c t o n i a s o l a n i，能引起许多植物根腐病。有关学者认为，致病性感染对寄主呼吸和各种氧化酶活性增高的影响可 能与毒素的释放有关H】。Ma x w e l l 和 B a t e ma n在用 R s o t a n i 感染莱豆幼苗时，发现植株在生长中期 和结实的成熟阶段，组织中的多酚氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素 C氧化酶才显著升 高，而不 是发生 在感染初 期的幼 苗阶段 在 这些 氧 化酶 升高 的同时，寄 主组织细胞会 出现严重损 伤 或 坏多 E；而 用 菌根真 菌感 染 兰科 植 物 的过 程却 是一个 形成 共 生联 合 体 的过程，在 这 个过 程 中酶 活 性 的增加，尤其 是过 氧化物 酶，在感 染 的初期 就可检测 出来“】。本 实验 中观 察到 被感染 后 的根状 茎 的寄主组织 细胞生长 正常，没有 发生褐变 和坏死，可 以证实是 共生感染，区别于致 病感染。童 至 兰 3 6 9 1 2 1 S 1 日 2l 24 27 3O 3 3 瞎 染 后 天 数0a ys a f tar I nf o e ti o n 图 3 苗根 真 曲感 垫后 l曲种 兰 花根状 茎 I AA氧化 酶 活性 变化 圉 4 曲根真 菌感 垫后 _嗍种 兰花 根状 茎过 氧化 物 酶活 性 的变化 Fi g 3 C h a ng e s i n T AA o x i d a s e a c t ivi t y o fC，a n d Fi g 4 C h an g e s i n p e r o xlda s e a c t i vi ty ofC x i n en e a n d c f r h i z o m e s a fte r m r r hi z a l i nf e c t i o n e l i u m r h i z ome s a ft e r m y c or r h i l i n f e c t i on 一束感染建兰 U n i n f e c t e d c r,if o h u m；口感染后建兰 n fe c d C P 扣l i n m；束感染墨兰 u n i n c t e d c r：0感染后墨兰 I n f e c t e d c 3讨论 本实验 中，两个兰花品种的根状茎被菌根真菌感染后，细胞色素 C氧化酶、过氧化物酶活性显 维普资讯 http:/ 热带 亚 热带 植物 学 报 第 1 O卷 著增加(图 2，4)。过 氧化 物 酶的第 一 次活性 高 峰发生 在第 7天，比呼吸 速率、细胞 色 素 c氧 化 酶、L A A氧 化 酶活性 的高 峰 出现 时 间(第 9天)要 早些，这 与 B 1 a k e ma n等 的结果 基 本一 致，他 认 为在 兰科植 物 与真菌 的共生体 系中，过 氧化物 酶(P OD)活性 增加是 生长发 育 的特 征。植物 体 内 P OD 的 作用底 物很 多，如 H O 以及 酚酸化 合物 等一 系列 其他物 质，因此 P OD是 一种多 功能 的 酶，它不仅 可 以将 体 内某些 有 害 的代谢 副产物 转 变 为无害物 质，而且 可 以促进体 内某些 中间物 质 的转 化，从 而对植物生 长、发育和提高抗性起积极作用 有学者认为，P O D活性的提高可能是植物对逆境反 应 的 自我 节 有 助 于植物 的生长。菌 根 真菌 与墨兰 和 建兰根 状茎 形 成共生 体 系后，刺激 了植 物体 内一 系列 的生物 代谢 活动，其 结果是呼吸速率、细胞色素 c氧化酶和过氧化物酶活性都显著提高，这些指标说 明了真菌与其兰 科 寄 主 的共生 发育过 程 是互 为有 利 的，兰花 与真 菌的共 生联合 体 比未感 染 的植株 具有更 强 的代谢 能力。但 接 种与 否则对 I A A 氧 化酶影 响不 大(图 3)，其原 因不明，还有 待进一 步 了解。参 考文献：I l J H a r l e y J L S mi t h S E My c o r r h i z a l S y mb i o s is(M_ L o n d o n：A c a d e mi c F r e s s，I 9 8 3，2 6 8 2 9 5 2 _Ha d l e yG+Or c h i dmy c o h i z a(AI n：A r d i t t i J Or c h i d Bi o o g 3 MJ I t h a c a Ne wYo r k：Co,n e l l Un i v e r s i t y P r e s s,1 9 8 2 8 6-l 1 8 叫 3 B o l d u e R，C h e r r y J B L a i r B i n c r e a s e i n I A A o x d a s a c t i v i t y o f w i me r w h e a t b y c o l d t r e a n e n t a n d g i b b e r e l l i c a c i d(J 1 P l a n t P bys i o ，1 9 70 45：4 61 _4 64 f 4 B l a k c m a n J P，Mo k a h e l M A，H a d l e y G E ff e c t o f m 2 c c o r r h i z a in f e c t i o n O t l r e s p i r a t i o n a n d a c t i v i t y o f s o me o x i d a s e e n z y me s o f o r c h i d p r o t o e o r r n s_ J 1 Ne w P h y t o l 1 9 7 6，7 7：6 9 7 7 0 4 f 5 A I B a r a z i Z，S c h w a b e W W T h e p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f p o l y p h e n o o x id a s e a n d t h e a u x i n o x d a s e s y s t e m i n r o o t f o r ma t i o n and d e v e l o p me n t i n c u t t i n g s o f m l M l J J _ J Ho n S c i，1 9 8 4，5 9(3)：4 5 3-4 6 1 _ 6 J 徭趟美 陈汝民，I I l 庆生苗根真菌在兰属 ru b i d i u m)墨兰和建兰根部中的感染持扯及其生删特扯 f J _ 土壤与环境，1 9 9 9，8 f 4)：2 8 72 8 9 【7 张志 良+植物生理学实验指导【MJ北京 高等教育出版杜，1 9 9 0，I 3 1【8】陈良碧杂交水稻种子生 特点与耐储藏性研究 l J 1 _ 补子 1 9 9 4，(4)：1 9-2 1，2 4 【9】棣如涓，赵毓橘表油 菜隶内酯刘黄瓜幼苗下胚轴过氧 化物酶 和 I A A氧化酶 活性的影响 f J l植物生理学报，1 9 8 9，1 5(3)：2 6 3 2 67 【l 0 l 郭 秀珍 毕国昌 林木菌根及臆用技术【M】北京 中国林业出版社，1 9 8 9，1 3 1 一 I 4 0 维普资讯 http:/