1′-羟基咪达唑仑的含量测定方案.pdf

11-羟基咪达唑仑的含量测定方案一一、前前言言细胞色素 P450 酶(CYP)是混合功能氧化酶超家族，对各种内源性及外源性物质进行生物转化，且在外源性化合物的 I 相代谢中起着主要作用，它参与50%药物的 I 相代谢。CYP450酶与发生 DDI 关联最紧密的即为其可诱导和可抑制性。在人类 CYP3A 亚家族中，CYP3A4 含量最丰富而且是人类药物代谢酶中最重要的酶。咪达唑仑常作为 CYP3A4 体内外研究和指导原则所推荐的 CYP3A4 的探针底物之一，1-羟基咪达唑仑是其主要的代谢产物，因此，以1-羟基咪达唑仑的生成量为指标，研究药物、药用辅料或食物等对 CYP3A4 的作用，对临床合理用药具有重要的指导意义。它的结构式为 1-羟基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并1,5-1,4苯并二氮杂(图 1)。本试验的目的是采用人肝微粒体作为体外模型来评价受试药对 CYP3A4 酶的抑制作用。利用LC-MS/MS检测以抑制剂酮康唑浓度为0时探针底物咪达唑仑的代谢产物1-羟基咪达唑仑的生成量为 100%，计算酮康唑在不同浓度时相对应的代谢产物 1-羟基咪达唑仑的生成百分数，最终计算出酮康唑对 CYP3A4 酶的抑制率或 IC50 值来评价对 CYP3A4 酶的抑制作用。图 1：1-羟基咪达唑仑结构式2二、设计依据二、设计依据由于 LC-MS/MS 检测具有专属性、灵敏性、稳定性及准确性等优势。本方法采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（LC-MS/MS），测定体外酶抑制体系中 1-羟基咪达唑仑的浓度。样本使用量为 40 L 0.1mg/mL 人肝微粒体磷酸钾缓冲液，采用蛋白沉淀方法进行样品提取，定量范围为 10.0-2000 ng/mL。根据中国药物相互作用研究技术指导原则2021 版的要求，在体外实验研究过程中，应建立经验证且可重复的分析方法测定原型或代谢产物的浓度，因此建立体外实验的原型或代谢产物的定量分析方法尤为重要。本方案依据中国药典2020 版四部生物样品定量分析方法验证指导原则及 LC-MS/MS 检测的优势进行方案设计。三、设计三、设计方案方案1.仪器设备与试剂（1）仪器设备LC-MS/MS（AB SCIEX API5500），液相系统（岛津 LC-30AD），分析天平，恒温培养振荡器，纯水仪，涡旋，高速冷冻离心机，pH 计，移液器等。（2）标准品及试剂信息表 1类型名称厂家抑制剂酮康唑SIGMA-ALDRICH探针底物咪达唑仑中国药品生物制品检定所代谢产物1-羟基咪达唑仑*Beijing Fei Long Rui Co,Ltd内标6-Hydroxytestosterone-d7CORNING基质人肝微粒体Corning试剂DMSO成都市科隆化学品有限公司甲醇SPECTRUM乙腈SPECTRUM甲酸阿拉丁辅酶NADPH/缓冲盐磷酸二氢钾成都市科隆化学品有限公司磷酸氢二钾广东光华科技股份有限公司*:1-羟基咪达唑仑的批号为 F846244，分子量为 258.4，含量为 95%；6-Hydroxytestosterone-d7 的批号为 9343002，分子量为 311.47，含量为 97%32.质谱的方法（1）利用 AB SCIEX API5500 仪器对 1-羟基咪达唑仑进行质谱方法的开发，通过全扫描模式寻找 1-羟基咪达唑仑分子离子峰及碎片离子峰，优化仪器参数（主要是 DP和CE），使 仪 器 达 到 最 佳 响 应。表 1 为 1 -羟 基 咪 达 唑 仑 及 其 内 标 6-Hydroxytestosterone-d7 的质谱条件，1-羟基咪达唑仑的母离子和子离子典型质谱图见图 1 和图 2表 2 质谱方法质谱仪QTRAP5500离子源ESI离子化模式Positive采集时间3.5 minResolution Q1UnitResolution Q3UnitCADMediumCUR30 psiGS155 psiGS260 psiTEM550 CIS5500 VEP10 VCXP13 V分析物MRMDwell time(msec)DP(V)CE(V)1-Hydroxymidazolam342.1/202.5509035IS-6-Hydroxytestosterone-d7312.1/276.1508020图 11-羟基咪达唑仑的母离子典型质谱图4图 21-羟基咪达唑仑的子离子典型质谱图（2）液相方法1-羟基咪达唑液相方法如下：表 3色谱柱Waters XSelect HSS T3,3.0*50 mm,2.5 m柱温40C自动进样器温度10C流动相 AH2O（含 0.1%FA）流动相 BMeOH进样器清洗液ACN:MeOH:H2O=4:4:2（V:V;另加 0.1%FA）进样器清洗程序Rinse Type:ExternalRinsing Speed:35 L/secSampling Speed:5.0 L/secRinsing Volume:200 LRinse Mode:Before and after aspirationRinse Dip Time:5 secRinse Method:Rinse Port onlyRinse Time:2 sec泵梯度Time(min)A(%)B(%)Flow rate(L/min)0.0070305000.1070305000.2035655001.7015855002.4015855002.4170305003.507030500运行时间3.50 min5进样体积2 L（根据需要进行调整）3.溶液配制（1）精密称取探针底物、抑制剂、代谢产物和内标标准品，用甲醇或 DMSO 配制咪达唑仑、酮康唑和 1-羟基咪达唑仑浓度分别为 5 mM、0.3mM 和 10mM 的储备液，-20C冰箱中保存待用。用 DMSO 配制 6-Hydroxytestosterone-d7 氘代内标，浓度为 10 mM 的储备液，-20C 冰箱中保存待用，使用时再用乙腈稀释至一定浓度。（2）抑制剂酮康唑工作液配制：取 5 L 酮康唑 0.3mM 储备液，加入 45 LACN:H2O(1:1)，作为浓度最高点，然后往下 3 倍稀释一系列浓度，总共 7 个浓度点，一个溶剂对照；孵育体系抑制剂的终浓度见下表：表 4CYPs抑制剂储备液浓度 mM终浓度M3A4酮康唑0.30.3、0.1、0.0333、0.0111、0.00370、0.00123、0.000412、0.00（3）探针底物储备液及反应体系终浓度见下表：表 5CYPs探针底物储备液浓度 mM终浓度M3A4咪达唑仑55（4）20M 咪达唑仑工作液配制：取适量体积的咪达唑仑 5mM 储备液，加入适量体积的 0.1 M 磷酸钾缓冲溶液，混匀。（5）0.1 M 磷酸钾缓冲溶液（pH=7.4）的配制0.1 M 磷酸二氢钾溶液：称取一定量磷酸二氢钾，用超纯水将其超声溶解，使浓度为0.1 M。0.1 M 磷酸氢二钾溶液：称取一定量磷酸氢二钾，用超纯水将其超声溶解，使浓度为0.1 M。0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH=7.4）：将 0.1 M 磷酸二氢钾溶液缓慢加入到 0.1 M 磷酸氢二钾溶液中，当 pH 达到 7.4 时停止。（6）NADPH 溶液的配制预孵过程中的 NADPH 溶液，称取一定量 NADPH 供试品，用缓冲溶液配制成浓度为 8 mM的 NADPH 溶液。（7）人肝微粒体稀释液HLM（0.2 mg/mL）：取适量体积的 20 mg/mL 人肝微粒体加入到适量体积的磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀。6（8）内标工作溶液的配制取适量体积的 6-Hydroxytestosterone-d7 内标储备液，用乙腈稀释一定倍数后成一定浓度的氘代内标工作液，待用。磷酸钾缓冲液、探针底物工作溶液、NADPH 溶液配制完成后即放置于孵育箱中预热，内标工作溶液则至于冰箱中预冷。（9）定量标曲的配制1-羟基咪达唑仑标准曲线工作溶液和质控工作溶液配制：表 6Source Solution Used 所用溶液DiluentsolventWorking Solution Prepared 工作溶液配制稀释溶剂(ACN)Solution IDConcentrationVolumeVolumeVolumeConcentrationSolutionID溶液编号浓度（nM）体积(L)体积(L)体积(L)浓度（nM）溶液编号stock-110,000,0001514851500100000stock-2stock-2100000400600100040000WSTD8stock-2100000360640100036000WSTD7stock-2100000240760100024000WSTD6WSTD8400001206808006000WSTD5WSTD624000808809602000WSTD4WSTD5600080520600800WSTD3WSTD42000160640800400WSTD2WSTD420001009001000200WSTD1stock-2100000320680100032000WHQCWHQC320001508109605000WMQCWMQC50001208801000600WLQC1-羟基咪达唑仑标曲和质控样品配制：表 7Working solution 工作溶液Blank Matrix 空白基质Sample 样品ID.编号Conc.浓度（nM）VolumeVolumeLo.NO.IDConc.浓度(nM)工作溶液体积（L）基质体积（L）批号样品编号WSTD120010190*HLM blankmatrixSTD110WSTD240010190STD220WSTD380010190STD340WSTD4200010190STD4100WSTD5600010190STD53007WSTD62400010190STD61200WSTD73600010190STD71800WSTD84000010190STD82000WHQC3200020380HQC1600WMQC500020380MQC250WLQC60020380LQC30*取适量体积的 20mg/mL 人肝微微粒体，加入适量体积的磷酸钾缓冲液，配制成终浓度为 0.1mg/mL 的人肝微粒体空白基质，沸水浴 10min 灭活。4.实验步骤在 96 浅孔板中酮康唑不同浓度点的位置中加入 30 L 0.2mg/mL 的人肝微粒体混合溶液，每个浓度点平行做三孔，然后再加入 4 L 抑制剂酮康唑工作液和 15 L 20M 的咪达唑仑工作液，37C 预热 10 min 后，加入 15 L NADPH 溶液（8 mM）或者加入 15 L 磷酸钾缓冲液（0.1M），启动反应，孵育 5 min 后，取 40L 孵育样品到 96 深孔板中，加入120 L 预冷的 ACN（含氘代内标），涡旋离心，取 100 L 上清加入到 150 L 超纯水中，进样分析。5.数据处理（1）计算软件：GraphPad Prism 5.01以抑制剂酮康唑浓度为 0 时代谢产物的生成量为 100%，计算不同浓度时相对应的代谢产物生成百分数，最终计算出化合物的抑制率或 IC50值来评价药物对酶的抑制作用。（2）计算公式：%Inhibition=(1-(N+inh/Nveh)*100N 为探针底物代谢产物的浓度值并假定 0 min 时有或无抑制剂组的代谢产物均为 0。N+inh为加抑制剂组代谢物浓度，Nveh为不加抑制剂组代谢物浓度3）以抑制百分比为纵坐标，抑制剂浓度为横坐标，使用 Graphpad 软件中的 loginhvs(normalized)response variable slope 进行非线性回归拟合，计算得到受试药及各阳性抑制剂的 IC50值。当待测物最大浓度（50 M）抑制率小于 50%时，无法准确拟合曲线，IC50以50 M 表示。6.实验结果根据以上优化的条件及方案利用 LC-MS/MS 技术对体外酶抑制体系中 1-羟基咪达唑仑的浓度进行测定结果如下:表 8 标准曲线定量结果标准曲线浓度（ng/mL）102040100300120018002000检测浓度（ng/mL）8均值（ng/mL）CV（Bias（%）表 9 质控定量结果质控浓度（ng/mL）302501600检测浓度（ng/mL）均值（ng/mL）CV（%）Bias（%）满足标准曲线至少有 6 个标准点满足接受标准。标准曲线工作范围内，标准点浓度CV(%)15%，Bias(%)15%（LLOQ：浓度 CV(%)20%，Bias(%)20%)。表 10酮康唑对 CYP3A4（咪达唑仑）酶活性的影响（n=3）浓度（M）平均抑制率(%)SD0.3000.1000.03330.01110.003700.001230.0004120.00IC50(M)表 11 酮康唑对人肝微粒体中 CYP3A4（咪达唑仑）的抑制率浓度（M）代谢物 1-羟基咪达唑仑浓度（nM）抑制率(%)0.3样品-01样品-02样品-030.1样品-01样品-02样品-030.0333样品-01样品-029样品-030.0111样品-01样品-02样品-030.00370样品-01样品-02样品-030.00123样品-01样品-02样品-030.000412样品-01样品-02样品-030.00样品-01样品-02样品-03四、设计小结通过设计 1-羟基咪达唑仑在体外酶抑制体系中的含量测定方案，将理论知识应用到实践中。LC-MS/MS 检测技术具有灵敏性、准确性、可靠性等优势。本方案利用LC-MS/MS 技术初步建立了体外酶抑制体系中 1-羟基咪达唑仑浓度的定量分析方法，为评价药物对人体代谢酶的影响提供数据支持。对药物含量测定方法有了进一步的了解和认识。五、参考资料1 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京，中国医药科技出版社，2020.2 药物相互作用研究技术指导原则（试行），NMPA，2021.3 朱学慧，娄建石.细胞色素 P450 CYP3A 选择性探针药物的评价J.中国，临药理学与治疗学，2004，9(4):365369.4 孙鲁宁,吴春勇,赵舜波,刘瑞娟,王雷,丁黎,王永庆.药物对人肝 CYP450 酶诱导和抑制作用体外评价体系的建立与验证J.药学学报,2017,(第 12 期).