大剂量维生素C对急性肺损伤的保护作用.pdf

第2 6卷第4期2005年8月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a lo fX i a nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l.2 6N o.4A ug.2 0 0 5大剂量维生素C对急性肺损伤的保护作用孙秀珍,张德信,刘 昀(西安交通大学第二医院呼吸内科,陕西西安 7 1 0 0 0 4)摘要:目的 观察大剂量维生素C(5 0 0m g/k g)对油酸诱导的家兔急性肺损伤的预防和治疗效果。方法 3 0只家兔分为4组:对照组(C G),油酸组(O G),预防组(P G)及治疗组(T G)。于油酸注入前(0)及后3 0、9 0、1 5 0m i n采各组动物颈总动脉血测P a O2、超氧化物歧化酶(S O D)活力、血浆丙二醛(MD A)。实验末右肺测湿质量,取支气管肺泡灌洗液(B A L F)后烤箱烘干得湿干质量比值,留少许左肺标本甲醛固定做切片。结果 油酸注入3 0m i n后,P G组和T G组P a O2及S O D明显高于O G组(P0.0 1);而MD A明显低于O G组(P0.0 1)。实验末P G组和T G组B A L F中总蛋白、肺湿干质量比较O G组低(P0.0 5);肺组织病理切片显示损伤较轻。结论 大剂量维生素C对油酸所致的家兔急性肺损伤,通过清除氧自由基而发挥保护作用。关键词:大量维生素C;肺损伤;氧自由基中图分类号:R 5 6 3.8 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 1-8 2 5(2 0 0 5)0 4-0 3 4 5-0 4P r o t e c t i v ee f f e c t o f l a r g ed o s e so fv i t a m i nCo na c u t e l u n g i n j u r yS u nX i u z h e n,Z h a n gD e x i n,L i uY u n(D e p a r t m e n to fR e s p i r a t i o n,S e c o n dH o s p i t a l o fX i a nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X i a n7 1 0 0 0 4,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T oi n v e s t iga t et h epr o t e c t i v ea n dt h e r ape u t i ce f f e c to f l a rged o s e so fv i t a m i nCo nt h ea c u t e l u ngi nXu ryi nt h em o d e lo fr a b b i t s i n d u c e dbyo l e i ca c i d.M e t h o d s At o t a lo f1 8r a b b i t sw e r ed i v i d e di n t of o u rgr o upr a n d o m ly:c o n t r o lgr o up(C G);o l e i ca c i dgr o up(OG);pr e v e n t i v egr o up(P G)a n d t r e a t m e n tgr o up(T G).O xy ge npr e s s u r e i na r t e r i a lb l o o d(P a O2),s upe r o x i d ed i s m u t a s e(S OD)a n dm a l o n d i a l d e hyd e(MDA)i nb l o o dw e r em e a s u r e di n0,3 0,9 0a n d1 5 0m i n,r e spe c t i v e ly.A l lt h ea n i m a l sw e r ek i l l e di n1 5 0m i nl a t e r.T o t a lpr o t e i ni nb r o n c h o-a l v e o l a r l a v agef l u i d(B A L F)a n dw e td ryw e igh tr a t i oo ft h er igh t l u ngw e r em e a s u r e d,a n dt h el e f t l u ngs a mpl ew a s t r e a t e dbyf o r m a l d e hyd ef o rpa t h o l ogi c a l t e s t.R e s u I t s P a O2,S ODi nP Ggr o upa n dT Ggr o upw e r es ign i f i c a n t lyh igh e r t h a nt h a t i nOGgr o up(10.0 1),a n d MDAs ign i f i c a n t lyd e c r e a s e d(10.0 1)3 0m i na f t e ro l e i ca c i di nXe c t i o n;B A L Fa n dl u ngw e t-d ryw e igh t r a t i o i nP Ggr o upa n dT Ggr o ups ign i f i c a n t lyd e c r e a s e d(10.0 5)c o mpa r e d w i t hi n OGgr o up;H Es t a i n i ngs h o w e dt h a tt h el u ngi nXu ryi nP Ggr o upa n dT Ggr o upw a si mpr o v e d.C o n c I u s i o n L a rged o s e so fv i t a m i nC(5 0 0mg/kg)h a spr e v e n t i v ee f f e c to na c u t e l u ngi nXu ry.K E Y WO R D S:v i t a m i nC;a c u t e l u ngi nXu ry;o xy ge nf r e er a d i c a l收稿日期:2 0 0 4-1 2-2 9 修回日期:2 0 0 5-0 5-0 7作者简介:孙秀珍(1 9 5 1-),女(汉族),教授,硕士生导师.E-m a i l:b o c-l y.s o h u.c o m 急性肺损伤(a c u t el u n gi n j u r y,A L I)是急性呼吸窘迫综合征(a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e,AR D S)的早期阶段,是由于多种原因引起的肺毛细血管炎症性损伤;通透性增加,继发急性高通透性肺水肿和进行性缺氧性呼吸衰竭。它是许多内外科危重病的常见并发症,病情危重,虽然现代治疗技术和设备都有了很大的提高,但它仍然是构成死亡的主要原因1。对于A L I的治疗,除早期机械通气有一定效果外,目前的诸多治疗方法均难获效。A L I的发病机制非常复杂,1 0 0多种疾病可以并发A L I。而活性氧自由基在A L I发病机制中的作用已得到实验证实2。所以,在急性肺损伤时给予氧自由基清除剂就为A L I的治疗提供了一种新的有效方法3。而维生素C是一种经典的抗氧化剂,它参与体内的氧化还原反应,具有强抗氧化性。我们通过家兔的急性肺损伤模型,观察大剂量维生素C(5 0 0m g/k g)对A L I的预防和治疗效果。1 材料与方法1.1 实验材料 实验动物:健康家兔,雌雄不拘,体质量2.02.5k g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。主要试剂和药品:油酸(天津市河东区红岩试剂厂);维生素C(天津药业焦作有限公司);超氧化物歧化酶(S O D),丙二醛(MD A)及支气 西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第2 6卷管 肺 泡 灌 洗 液(b r o n c h o-a l v e o l a r l a v a g e f l u i d,B A L F)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。2 0m g/g(2 0%)乌拉坦(上海曹杨第二中学制剂厂)。1.2 实验仪器 全自动血气分析仪(瑞典A V L 9 9 0);全自动可见光分光光度计(U LT R O S T E C 2 1 0 0,AM D R-S HAM公司)。1.3 实验方法 分组:家兔3 0只,随机分为4组,C G组6只,每只给0.1 2m L/k g的生理盐水;O G组8只,油酸致伤前后不予干预;P G组8只,油酸造模前1 0m i n给予大量维生素C(5 0 0m g/k g);T G组8只,造模后3 0m i n给予大量维生素C(5 0 0m g/k g)。方法:2 0m g/g(2 0%)乌拉坦1.0g/k g麻醉动物,行颈总动脉分离插管术,并采动脉血作为0m i n标本。家兔耳缘静脉注入油酸0.1 2m L/k g,制作家兔急性肺损伤的模型;后分别在3 0、9 0、1 5 0m i n取动脉血,分别测各相应时点的PaO2、血浆S O D活力及MD A含量。各组家兔在1 5 0m i n后放血活杀,取左肺做肺病理切片标本,右肺称肺湿质量后,作支气管-肺泡灌洗术,测B A L F中总蛋白含量。烤干后得肺湿/干质量比值。1.4 观察指标 PaO2:各时间点动脉血PaO2的变化。S O D活力及MD A含量:用比色法测各时点血浆S O D活力及MD A量。B A L F中总蛋白含量:各组家兔在1 5 0m i n后放血活杀,取右肺行支气管肺泡灌洗,注入生理盐水9m L/k g,反复灌洗3次,每次冲洗3遍,确保回收率在8 0%以上。收集支气管肺泡灌洗液并4 0 0 0 r/m i n离心,取上清液,用比色法测上清液总蛋白含量。0肺脏湿/干质量比值:右肺脏灌洗前称湿质量,后在6 0烤箱中烘烤3d,测干质量,得湿/干质量比值。2病理检查:取少许左肺组织,经1 0%(体积分数)甲醛固定、常规脱水、包埋、切片,经苏木精-伊红染色,置光镜下观察组织形态并显微照相。1.5 统计学方法 所有数据输入电脑,采用S P S S 1 0统计软件处理数据,两组之间比较采用t检验,以P0.0 5为有统计学意义。2 结 果2.1 油酸致伤后不同时间点血浆P a O2的变化 油酸致伤3 0m i n后各时间点,O G组P G组、T G组较C G组P a O2均有显著降低(P0.0 5,表1)。而O G组在9 0m i n后下降最明显(P0.0 1v s.P G;P0.0 5v s.T G)。T G组较P G组又显著降低(P 0.0 5)。表1 油酸致伤后不同时间点血浆P a O2的变化T a b l e1 P a O2a td i f f e r e n t t i m ea f t e rb e i n g i n j u r i e db yo l e i ca c i d(k P a,*/0)G r o u pn0m i n3 0m i n9 0m i n1 5 0m i nC G61 3.1 4 70.9 1 21 2.6 8 81.0 7 21 2.2 6 90.7 1 11 2.6 6 20.9 0 3O G81 2.9 1 90.6 6 41 0.5 6 70.8 6 48.2 5 01.1 7 17.8 2 70.9 6 1P G81 3.1 3 60.4 6 21 1.7 6 60.4 2 749.9 6 60.7 8 0449.6 9 11.2 8 644T G81 2.6 7 50.9 2 19.7 2 70.9 8 4*9.2 6 20.4 8 14*8.6 4 60.4 7 64*P0.0 5,P0.0 1v s.C Gg r o u p;4P0.0 5,44P0.0 1v s.O Gg r o u p;*P0.0 5P Gg r o u pv s.T Gg r o u p2.2 油酸致伤后不同时间点血浆中S O D活力的变化 同C G组比较,油酸致伤3 0m i n后,O G组、P G组、T G组S O D明显下降(P0.0 5,表2),但P G组和T G组较O G组各时间点总体保持较高水平(9 0m i n后均P0.0 5)。而P G组9 0m i n后又高于T G组(P0.0 5)。表2 油酸致伤后不同时间点血浆中S O D活力的变化T a b l e2 S O Da td i f f e r e n t t i m ea f t e rb e i n g i n j u r e db yo l e i ca c i d(u/m L,*/0)G r o u pn0m i n3 0m i n9 0m i n1 5 0m i nC G67 4.5 0 76.7 6 77 7.4 5 93.5 4 77 4.6 4 25.9 4 97 8.1 1 05.1 2 5O G87 7.9 7 34.6 0 46 8.2 5 54.4 6 15 4.3 3 07.2 7 04 7.8 8 56.4 6 1P G87 8.3 9 96.3 5 27 3.2 5 33.4 1 046 6.5 0 13.8 8 0446 4.3 8 47.5 5 744T G87 7.9 2 87.4 8 46 7.5 9 95.1 1 2*6 1.1 2 45.1 2 24*5 4.9 3 25.1 1 24*P0.0 5,P0.0 1v s.C Gg r o u p;4P0.0 5,44P0.0 1v s.O Gg r o u p;*P0.0 5P Gg r o u pv s.T Gg r o u p2.3 油酸致伤后不同时间点血浆中MD A的变化 同C G组比较,油酸致伤3 0m i n后,O G组、P G组、T G组的MD A明显升高(P0.0 5,表3),但P G组和T G组 较O G组 各 时 间 点 总 体 保 持 较 低 水 平(9 0m i n后均P0.0 5)。而P G组9 0m i n后又低于T G组(P0.0 5)。6434期孙秀珍,张德信,刘 昀.大剂量维生素C对急性肺损伤的保护作用表3 油酸致伤后不同时间点血浆中MD A的变化T a b l e3 MD Aa td i f f e r e n t t i m ea f t e rb e i n g i n j u r i e db yo l e i ca c i d(n m o l/m L,*/0)G r o u pn0m i n3 0m i n9 0m i n1 5 0m i nC G62.2 7 70.8 7 32.4 8 20.1 2 62.1 7 00.3 1 619 9 70.5 0 6O G82.6 7 90.9 6 23.3 6 20.4 8 14.3 1 30.7 9 44.8 3 40.2 9 3P G82.4 1 10.6 7 02.8 4 80.3 8 043.1 5 10.4 2 7443.5 0 90.7 3 144T G82.1 4 30.2 6 83.2 9 10.4 3 8*3.6 0 10.3 8 64*4.2 3 60.6 0 14*P0.0 5,P0.0 1v s.C Gg r o u p;4P0.0 5,44P0.0 1v s.O Gg r o u p;*P0.0 5P Gg r o u pv s.T Gg r o u p2.4 B A L F中蛋白含量及肺湿/干质量比变化 油酸致伤后O G组、P G组及T G组B A L F中蛋白含量均明显高于C G组(P 0.0 1,表4);而P G组与T G组又明显低于O G组(P 0.0 5),P G组与T G组也有显著性差异(P 0.0 5)。肺湿/干质量比变化同前。2.5 病理变化 肉眼观察C G组肺组织无明显病理改变。O G组家兔肺组织肿胀,表面有广泛暗红色斑片状出血灶,切面有较多的淡红色或白色泡沫样液体溢出。P G组及T G组肺组织在外观上出血点较少,切面溢液也较少。光镜下C G组无明显病理改变(图1)。O G组可见肺泡腔内有大量伊红色水肿液、少量中性粒细胞、淋巴细胞及吞噬细胞渗出。肺泡壁明显增宽(图2)。P G组及T G组光镜下渗出少,病理改变程度比O G组轻(图3、4)。而P G组又较T G组病理改变轻。表4 B A L F中总蛋白含量和肺湿质量/肺干质量比的变化T a b l e4 T o t a lp r o t e i ni nd i f f e r e n tB A L Fa n dl u n gw e t-d r yw e i g h t r a t i o(*/0)G r o u pT o t a lp r o t e i ni nB A L F(g/L)W e t/d r yC G1.4 2 10.4 0 74.8 6 30.7 2 0O G2.9 9 60.5 6 37.3 8 00.2 0 1P G2.1 8 70.1 6 3445.9 7 70.5 6 044T G2.4 7 50.3 2 54*6.7 3 50.6 4 34*P0.0 1v s.C G g r o u p;4P0.0 5,44P0.0 1v s.O Gg r o u p;*P0.0 5P Gv s.T Gg r o u p图1 对照组的正常肺组织结构F i g.1C o n t r o l g r o u ps h o wt h en o r m a l l u n gs t r u c t u r e HE4 0 0图2 油酸组可见肺泡壁明显增宽,肺泡腔内有大量渗出的伊红色水肿液和少量炎性细胞F i g.2O l e i ca c i dg r o u ps h o wt h i c k e n e da l v e o l a r s e p t u m,f o r m a t i o no f h y a l i n em e m b r a n e s a n d t h e e x i s t e n c eo f i n f l a mm a t o r yc e l l si na l v e o l a rs p a c e s HE4 0 0图3 预防组水肿液及炎性细胞较少,结构改变较轻F i g.3P r o t e c t i v eg r o u ps h o wl e s se d e m aa n d i n f l a mm a t o r yc e l l s i na l v e o l a rs p a c e s HE4 0 0图4 治疗组炎性改变介于油酸组和预防组之间F i g.4T r e a t m e n tg r o u ps h o wt h e i n j u r yb e t w e e nt h eo l e i ca c i dg r o u pa n dp r o t e c t i v eg r o u p HE4 0 03 讨 论对于A L I治疗,临床上虽然没有大的突破,但依据其发病机制的研究成果而提出的治疗方法无疑对临床有积极的指导意义。如针对A L I时氧合障碍而采取的呼气末正压通气;保护性通气概念的提出4;吸入合适 浓 度 的NO以 扩 张 肺 血 管 床,减 轻 肺 水肿5;肺表面活性物质减少而采用的替代疗法等。其中机械通气应用最广且效果肯定6。氧自由基在A L I中的作用机制被证实后,抗氧化剂治疗就成为743 西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第2 6卷另一条治疗A L I的有效途径。维生素C在对抗氧自由基的临床应用方面已经有了广泛的研究。较为肯定的就是在病毒性心肌炎治疗方面。有研究表明,心肌体外培养时,在培养基中加入维生素C,培养基的MD A含量降低,病毒滴度下降,心肌活力增强,死亡减少7。基于氧自由基在急性肺损伤时的作用,我们应用大剂量维生素C在防治家兔实验性油酸型急性肺损伤时,证实有一定的效果。3.1 氧自由基的产生及在肺损伤中的作用机制 油酸作为一种损伤性理化因素进入动物机体后,使血管内皮系统产生大量的次黄嘌呤。在黄嘌呤氧化酶的作用下产生O-2、H2O2、OH-等氧自由基,同时刺激机体产生补体5 a。后者趋化多核白细胞在肺内聚集并被激活发生“呼吸爆发”,使氧自由基大量产生,并通过多种机制损伤肺脏毛细血管内皮细胞8,引起肺微血管急性炎症并激活凝血系统,导致血栓形成、血管痉挛、局部缺血,由此导致灌注不足,弥散障碍及通气/血流比例失调,引起肺泡-动脉血氧分压差及肺内分流升高和动脉血氧分压下降。同时,氧自由基作用于质膜引起脂质过氧化反应,产生大量脂质过氧化物及分解产物如MD A。MD A可与核酸、蛋白质、粘多糖等发生交联而引起变性,使组织损伤加重。氧自由基还通过对肺泡-毛细血管膜损害引起通透性增大而导致肺水肿、肺出血等损伤。3.2 本实验中大剂量维生素C的疗效评价 生物体内有天然的氧化和抗氧化平衡系统,急性肺损伤时大量氧自由基产生使氧化和抗氧化平衡失调。如果补充外源性的抗氧化剂,如维生素C,则可以平衡紊乱,以减轻肺损伤。在本实验中,我们通过大剂量维生素C的应用观察到:P G组和T G组同O G组相比,各时间点 的PaO2下降幅度 较 小,S O D活 力 较 高,MD A生成较少;虽然油酸致肺脏损伤后各组B A L F中总蛋白、肺湿质量/肺干质量比值与C G组比较均有明显升高,而与O G组比较,P G组和T G组升高幅度均较小(前者P0.0 1,后者P0.0 5),病理切片损伤 程 度 也 较 轻;P G组 比T G组 升 高 幅 度 更 小(P0.0 5),病理切片损伤程度更轻。以上结果均可证明:大剂量维生素C对油酸所致的肺损伤有一定的保护作用;预防的效果要好于治疗。对于已经造成的损伤,治疗的效果欠佳。这一过程的机制可能为维生素C在NA DH作用下生成半脱氢抗坏血酸,并在还原酶的作用下生成抗坏血酸自由基,后者成为脱氢抗坏血酸,在还原酶的作用下又可被还原成抗坏血酸,在这一过程中可提供两个H+使自由基还原,减少了自由基的量,从而减轻自由基对机体的损害。所以对于急性肺损伤,大剂量维生素C的作用重在预防。这和临床上对于急性肺损伤治疗原则一致。维生素C是人体血浆中最有效的水相抗氧化剂9,被吸收后分布于细胞内外,对于自由基所造成的损伤,维生素C在细胞内外均可发挥作用,而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化酶等清除剂的防御作用仅限于细胞内。虽然有研究表明摄入过量的维生素C并不能加强其抗氧化作用1 0,1 1,但目前尚无明确的量的范围。所以维生素C对于肺脏的保护程度和量的关系,有待于进一步的研究参考文献:1T a s a k aS,H a s ega w a N,U s h i z a k a A.P h a r m a c o l og yo fa c u t el u ngi nXu ryJ.P u l mP h a r m a c o lT h e r,2 0 0 2,1 5:8 3-9 5.2 刘和亮,赵金垣.活性氧自由基在ARD S发病机制中作用的实验研究 J.中国工业医学杂志,2 0 0 3,1 6(2):7 2-7 5.3 江凌,李元桂.内皮素致大鼠急性肺损伤中脂质过氧化物含量的变化 J.内科危重病杂志,2 0 0 2,8(3):1 2 9-1 3 1.4H i r v e l aE R.A d v a n c e s i nt h em a n age m e n to fa c u t er e spi r a t o ryd i s t r e s s syn d r o m e:pr o t e c t i v ev e n t i l a t i o nJ.A r c hS u rg,2 0 0 0,1 3 5(2):1 2 6-1 3 5.5G e r l a c hH,P ap pe r tD,L e w a n d o w s k iK,e ta l.L o ng-t e r mi n-h a l a t i o nw i t he v a l u a t e dl o wd o s e so fn i t r i co x i d ef o rs e l e c t i v ei mpr o v e m e n to fo xy ge n a t i o ni npa t i e n t sw i t ha d u l tr e spi r a t o ryd i s t r e s s syn d r o m eJ.U n t e n s i v eC a r e M e d,1 9 9 3,1 9(8):4 4 3-4 4 9.6 邵换璋.保护性机械通气治疗重症胸外伤并ARD S1 0例 J.郑州大学学报医学版,2 0 0 4,3 9(4):7 3 3-7 3 4.7 张福明,张淑琴,王相峰.维生素C、E对病毒感染细胞活性的影响 J.营养学报,1 9 9 6,1 8(4):4 8 9-4 9 1.8 高晓玲,刘卓拉.氧自由基在急性肺损伤发病中的作用 J.国外医学呼吸系统分册,2 0 0 2,2 2(6):3 1 0-3 1 5.9F r e iB.A s c o r b a t e i sa no u t s t a n d i nga n t i o x i d a n t i nh u m a nb l o o dJ.P r o cN a t lA c a dS c iU S A,1 9 8 9,8 6(8):6 3 7 7-6 3 8 1.1 0L e v i n eM,W a ngY,P a d aya t tyS J,e ta l.An e wr e c o mm e n d e dd i e t a rya l l o w a n c eo fv i t a m i nCf o rh e a l t hyyo u ngw o m e nJ.P r o cN a t lA c a dS c iU S A,2 0 0 1,9 8(1 7):9 8 4 2-9 8 4 6.1 1P a d aya t tyS J,K a t zA,W a ngY,e t a l.V i t a m i nCa s a na n t i o x i-d a n t:e v a l u a t i o no f i t sr o l ei nd i s e a s epr e v e n t i o nJ.Am C o l lN u t r,2 0 0 3,2 2(1):1 8-3 5.(编辑 韩维栋)843