毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度.pdf

DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.01161毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度连冬生*?张相年?贺宝霞?赵树进?韩丽萍(广州军区广州总医院药剂科,广州 510010)摘?要?以已知浓度的 DNA M arker为标准样品,常规压力进样,电动进样,柱头场放大及联合使用基质场放大和柱头场放大等方法进行 CGE?UV 分析,对比不同进样方法的检测灵敏度。以聚合酶链式反应(PCR)后的高盐 DNA样品验证方法的可靠性。当 DNA 样品稀释达 40万倍,与电动进样和压力进样相比,在对峰形和峰宽无明显影响下,将电动进样的时间延至 420 s,三羟甲基氨基甲烷?盐酸缓冲液(TE)浓度降低至 1.5%,柱头场放大灵敏度分别提高了约 28和 90倍;联合使用基质场放大和柱头场放大后,灵敏度分别提高 3760和12000倍。DNA的检出限达 0.1?g/L(S/N=3,CGE?FASI?UV)。同时以本法分析 PCR 后的 DNA 产物获得了极高的灵敏度(分别比普通的压力进样和电动进样提高 50477倍和 33354倍)。本实验采用基质场放大和柱头场放大联用,方法操作简单,灵敏度高,适用于高盐微量的 DNA样品分析。关键词?脱氧核糖核酸;毛细管电泳;基质场放大;柱头场放大;聚合酶链式反应产物?2009?09?03收稿;2010?01?30接受*E?mai:l mytough 1?引?言1981年,Jorgenson等 1使用第一根熔融石英毛细管进行 CZE分离并获得 4?105理论塔板的高效率。1994年,W oolley等 2首先报道了使用芯片 CE分离 DNA 之后,CE分析技术因其具有微量、自动化、快速及高通量等优点得以迅速发展 3,应用范围日益扩大。然而在核酸分析方面,由于 DNA双键较弱的紫外吸收值,常规的紫外检测器的灵敏度难以满足低浓度 DNA的分析要求,影响了 CE 技术在DNA分析的应用。荧光检测虽能极大提高灵敏度,但存在荧光检测器价格较贵、样品需荧光标记或嵌合荧光染料等问题,还难以在实际分析中普及应用。近年来,提高 CE分检测灵敏度的研究取得了良好的进展如场放大电动堆积注射(FASI),大量样品堆积(LVSS),p H 介导的样品堆积 4,5,临界移动化学反应边界方法 6,动态 p H 接合 7,临态等速电泳浓集 8,无限量样品电动堆积注射 9和 Sweeping浓集 10等技术,极大地提高了常规 CE?UV检测灵敏度,如使黄素单核苷酸,黄素腺嘌呤二核苷酸的检测灵敏度提高 1200倍 11,可使麦斯明和新烟碱的检测灵敏度提高 1400倍 12。特别是场放大进样技术,操作简便,应用于检测多奈哌齐 13、苏灵大及其在血浆中的代谢物 14,尿液单氨酸 15,草酸盐 16等,均能大幅度提高检测灵敏度。应用于核酸分析,检出限也达到 7 mg/L 17最近,Chen等 18以 EB为嵌合染料,将 DNA的检出限降至 0.09?g/L(CGE?tI TP?LIF)。而本实验将基质场放大和柱头场放大技术结合,应用于 DNA片段的分析,进一步提高了灵敏度。仅使用 CGE?UV,将检出限降至 0.1?g/L,与 LIF接近,为 CE?UV进行微量核酸的分析提供了可行的方法。2?实验部分2.1?仪器与试剂P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman公司);涂层毛细管(内径 100?m,总长度 64 c m,有效长度53.8 cm);聚合酶链式反应仪(PCR,美国 PE公司);PCR管,紫外分光光度计(Beckman公司)。0.5 g/L DNA m arker(Fer mentas公司);含 10个 DNA条带,分别为 100,200,300,400,500,600,700,800,900和 1000,各条带的含量分别为 40,40,40,40,115,45,45,45,45和 45?g/L。TE(10mmol/L tris?HC,l p H 8,1mmol/L EDTA)、凝胶和凝胶缓冲液(Beckman公司);所用水和凝胶缓冲第 38卷2010年 8月?分析化学(FENXIHUAXUE)?研究报告Chinese Journal ofAnalyticalChe m istry?第 8期1161 1166液均先通过 0.45?m 微孔滤膜除杂后,再通过 1 m in超声波除去气泡。DNA提取试剂盒(广州天根有限公司);Taq聚合酶(Takala公司);聚合酶链式反应(PCR)引物(F:5?CATCAGTTAGTAGACAGATGA?3?,R:5?GGTCCAAACAGGGAAGAAAT A?3?,上海英骏公司合成)。SspI内切酶(NEB公司);琼脂糖(广州威佳有限公司)。所用试剂为分析纯,水为去离子水。2.2?实验方法用移液枪取 1?L标准 DNA marker,配制浓度为 50000,5000,500,50,5.0和 1.25?g/L的供试品,根据实验需要用去离子水和 TE进行调整溶液的离子强度。PCR及酶切:(1)提取血液基因组 DNA(天根 DNA提取试剂盒),紫外分光光度计检测 DNA浓度及纯度;(2)PCR条件:50?L加入 10?PCR缓冲液 5?L,dNTP 4?L,上下游引物各 4?L,模板 DNA?图 1?PCR产物凝胶电泳图谱(a)和 PCR条带酶切图谱(b)Fig.1?Electropherogra m of poly merase chain reaction(PCR)product(a)and enzy me digestion(b)100 ng,Taq酶(Takara)0.25?L循环条件为 94,55和 72?各 1 m in,共 35个循环;(3)酶切条件:PCR扩增产物 17L,SspI缓冲液 2?L,SspI内切酶(NEB公司)1?L。37?水浴 4 h,4%琼脂糖凝胶电泳。PCR及酶切结果见图 1。PCR后取 1?L DNA样品(未经脱盐纯化)溶于水中稀释至 100?L,溶于 1.5%TE中稀释至 10mL。取 PCR后的酶切产物 1?L(未经脱盐纯化)溶于水中稀释至 100?L。CE分离电压为 200 V/cm,温度为 20?,分离时间为 38 m in。每次分离之后用凝胶缓冲液冲洗3 m in。紫外检测设在 254 n m,数据分析采用 Beck m an公司提供的 32Karat 7.0软件。所有的电动进样及分离采用反相电压,进样条件根据灵敏度需要进行调整。3?结果与讨论表 1?压力进样的检测参数(400,500和 600 bp DNA片断)Table 1?Parameters of pressure injection(400,500,600 bp as references ofthree different concentrations)浓度CDNA(g/L)进样条件Injection峰高Peak height(mAU)半峰宽Peak width at half?height(m in)0.53.47 kPa?10 s2.05,5.29,2.450.076,0.096,0.0760.053.47 kPa?50 s0.866,2.44,1.070.085,0.099,0.0903.1?3种进样方式的比较3.1.1?压力进样?DNA浓度降至50 mg/L,进样时间增到 20 s,可实现检测。进样时间增至 60 s,峰开始拖尾 和展宽。进 样压力选 择3?47 kPa,DNA浓度降至 5.0 mg/L时,时间延长到 90 s,仍未能检测?图 2?电动进样在 0.05 g/L(a)和 0.005 g/L(b)DNA 的毛细管电泳图Fig.2?Electropherogra m of0.05 g/L(a)and 0.005 g/L(b)DNAPeaks(1-10):100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000bp;Injection 10 kV?10 s.DNA。结果表明,压力进样方式的检出限为13 mg/L(S/N=3)。压力进样的检测参数见表 1。3.1.2?电动进样?DNA浓度降到 5.0 mg/L时,采用电动进样 10 kV?10 s,峰高由 2.03,4.95 和 2.39 mAU 降 至 0?27,0.78 和0.30mAU,噪声凸现(图 2),表明 5.0 mg/LDNA已接近检出限。3.1.3?柱头场放大?DNA处浓度为 5 mg/L,实施柱头场放大,并将电动进样时间延至210 s,DNA 检测灵敏度极大提高(分别由0?27,0?78和 0.30 mAU升至 5.79,12.0和6.68 mAU)。DNA浓度降至 0.5 mg/L,其检测灵敏度已降低(表 2)。1162?分 析 化 学第 38卷表 2?柱头场放大参数表Table 2?Parameters of head?column field?amplified injection样品溶液Conditions ofsampleDNA 总浓度DNA overallconcentration(mg/L)单个 DNA片段浓度(最低)Sing le DNAconcentration(lowest)(mg/L)进样条件Injection10 kV峰高Height of peak(mAU)半峰宽Peak w idth at half?he ight(min)100%Tris?HCl(TE)5.00.410 s0.267,0.781,0.3030.058,0.058,0.059100%TE5.00.43.47 kPa?20 sH2O,injection 210 s5.79,12.03,6.680.097,0.149,0.105100%TE0.50.0403.47 kPa?20 sH2O,injection 210 s0.850,2.19,1.0440.066,0.078,0.0673.2?联合使用基质场放大和柱头场放大保持柱头场放大条件不变(3.47 kPa?20 s水柱,10 kV?210 s进样),在 DNA浓度降低的过程中,逐步降低样品溶液离子强度(100%TE?1.5%TE)至 5?g/L,峰高明显降低。为提高灵敏度,改变进样时间,当进样时间为 420 s时,DNA总浓度降至 1.25?g/L,检出限为 0.1?g/L(S/N=3)。各浓度下的进样条件及检测参数见表 3。表 3?基质场放大结合柱头场放大的检测参数Table 3?Parameters of combination ofmatrix field?amplified and head?column field?a mplified injection样品溶液Conditions ofsampleDNA 总浓度DNA overallconcentration(?g/L)单个 DNA浓度(最低)Sing le DNAconcentration(lowest)(?g/L)进样条件Injection10 kV峰高Height of peak(mAU)半峰宽Peak w idth at half?he ight(min)50%TE500403.47 kPa?20 sH2O,injection 210 s1.6,3.75,1.950.070,0.096,0.0735%TE5043.47 kPa?20 sH2O,injection 210 s1.69,4.15,2.080.076,0.102,0.0831.5%TE50.43.47 kPa?20 sH2O,injection 210 s0.401,1.34,0.550.077,0.074,0.0761.5%TE1.250.13.47 kPa?20 sH2O,injection 420 s0.255,0.734,0.2870.059,0.063,0.065?图 3?DNA marker(a)、10 kV?10 s电动进样(b)和3?47 kPa?10 s压力进样(c)的毛细管电泳谱图F ig.3?Electropherograms of DNA marker(a),PCRproduct in 10 kV?10 s injection(b)and 3.47 kPa?10 sinjection(c)Peaks(1-4):100,200,300,400 bp.?PCR 产 物(未 经 脱 盐 纯 化)在 压 力 进 样(3.47 kPa?10 s)及电动进样(10 kV?10 s)的检测图谱见图 3。由图 3可见,此时峰高较小(电动进样及压力进样的峰高分别为 0.793和 0.524 mAU),灵敏度极低,接近检出限。表明 PCR后的样品溶液离子强度是很高的。用上述方法对 PCR产物实施场放大,结果及相应的检测参数见表 4。可见场放大方法能在 PCR产物具有高盐基质成分而不影响灵敏度下的情况,通过大量的样品稀释,实现对 DNA的微量分析。将 PCR后的 DNA 样品酶切消化,对消化后的DNA片段进行分析(图 4),进一步验证了场放大方法的效果。表 4?PCR产物场放大进样的检测参数表Table 4?Parameters of PCR product in field?a mplified injection样品溶液状态Conditions of sample稀释倍数D ilution进样条件Injection峰高Height of peak(mAU)半峰宽Peak w idth at half?he ight(min)1?L PCR 产物(Product)+99?L H2O10010 kV?20 s1.1910.0681?L PCR产物用 1.5%TE溶液逐级稀释至 10 mL(1?L PCR product wasdiluted to 10 mL by 1.5%TE)100003.47 kPa?20 sH2O,10 kV?420 s2.6450.0661163第 8期连冬生等:毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度考察?图 4?DNA marker(a)和酶切后的 DNA片段(b)的电泳图F ig.4?Electropherogra ms of DNA marker(a)and PCRproduct after enzy me digestion(b)3.3?柱头场放大和联用技术与电动进样及压力进样的放大倍数的比较3.3.1?柱头场放大与电动进样及压力进样的放大倍数?比较电动进样(10 kV?10 s)、压力进样(3.47kPa?50 s)和柱头场放大(10 kV?210 s)的低浓度(接近检出限)的图谱,以 500 bp的峰高评价检测灵敏度。柱头场放大的灵敏度是电动进样的 28倍(2188/781)?10(稀释倍数),是压力进样的90倍(2188/2435)?100(稀释倍数)。3.3.2?联用技术与电动进样及压力进样的放大倍数?比较电动进样(10 kV?10 s)、压力进样(3.47kPa?50 s)和基质场放大联合柱头场放大(3.47 kPa?20 s,10 kV?420 s,1.5%TE)的低浓度的图谱,以 500 bp的峰高评价检测灵敏度。比较进样检测灵敏度(以 500 bp峰为例,取其峰高评估,其余峰显示相近的趋势)。基质场放大联合柱头场放大的灵敏度约比电动进样提高 3760倍,比压力进样提高 12057倍。3.3.3?PCR产物分析的场放大灵敏度?以联用技术与压力进样及电动进样的检测效果进行比较,联用技术检测灵敏度是压力进样检测灵敏度的 50477倍(2645/524)?10000(稀释倍数),是电动进样的33354倍(2645/793)?10000(稀释倍数)。显示联用技术极高的灵敏度及 PCR产物分析的实用性。3.4?柱头场放大进样条件的影响3.4.1柱头水柱长度的影响?合理控制水柱长度是柱头场放大的关键。水柱长度过短,在进样期间样品溶液及凝胶缓冲液中的离子迅速进入水柱,施加分离电场时,提供的聚焦时间有限;水柱过长,不但占据毛细管的有限空间,且大量的水溶液滞留柱中降低了离子强度,水柱与凝胶分离缓冲液的不一致性加大,影响后续的分离过程。水柱长度(压力 3.47 kPa,进样 5,10,20和 30 s)的实验结果表明,进样时间低于 20 s聚焦不明显,20 s时开始显现出聚焦效应。大于 30 s虽然继续显示聚焦效应,但考虑水柱长度不宜过长,压力进样时间选择 20 s。3.4.2?柱头场放大进样时间的影响?保持柱头水柱(3.47 kPa?20 s),将电动进样(10 kV)时间延至180,210240和 270 s。结果表明,随时间延长,峰高增高,灵敏度提高,但峰形展宽及小部分重叠,出峰时间推迟,10个峰的出峰时间跨度缩小。尽管水柱在进样期间占据了大部分电场,但 BGE区域仍存有较弱的电场,随时间增加,堆积的 DNA区带向前泳动,区带展宽;进样区带所占据的毛细管空间加大,必然造成分离时有效长度减小,使 DNA样品筛分距离缩小,出峰的时间跨度缩小;随进样时间增加,更多的离子从样品溶液进入管中,在其它条件不变时,当由进样转至分离时,会造成毛细管中电场的相对弱化,延迟出峰时间。以 5?g/L DNA的图谱为例,进样时间从 210 s增至 420 s时,第一个峰出峰时间推迟 0.546m in,出峰跨度缩小 2.68m in。因此,当 DNA浓度高于 5?g/L,进样条件选择 10 kV?210 s;当 DNA浓度低于 5?g/L,可将进样时间延长为 420 s。3.4.3?样品溶液中 TE浓度的影响?保持柱头场放大条件不变,将样品溶液的三羟基氨基甲烷?盐酸缓冲液(TE)浓度从 100%逐渐降低至 1.5%。两种方法的效果累积,灵敏度不断提高,但当其降至 1%时,基质场放大和柱头场放大开始产生相互干扰,此时进样时电流波动幅度增大,其图谱峰形变差或出峰不规则。当样品溶液处于极低离子强度(0.11mmol/L)时,溶液的导电性已非常接近柱头水柱,当施加电压时,样品溶液和柱头水柱在电场分配上产生互相干扰,造成进样电流和电渗流的不规则,对 DNA样品的聚焦产生干扰。将样品的 TE浓度调高至 1.5%,上述现象消失,实验选 TE为 1.5%。3.5?两种方法结合的检测灵敏度由表 3可见,在同样柱头场放大条件下,将 100%TE逐步降为 1.5%TE,灵敏度不断提高,表明降低溶液离子强度提高了柱头场放大的灵敏度,这是由于提高了进样量。为验证柱头场放大是否具有提高基质场放大的效果,实验在其它条件相同时,将加水柱和移除水柱的效果进行比较,结果显示加水柱1164?分 析 化 学第 38卷具有更高的灵敏度(峰高 1674/760=2.2倍)。这是导电性极低的水柱增加了分配在样品溶液到 BGE前沿的场强,扩大了 FASI的效果。另外,在柱头施加一段水柱还可以大大延长基质场放大电动进样的时间,将场放大的界面向毛细管内部推移,避免 FASI过程中样品?缓冲液交界面区带扰动给场放大造成的影响(如造成峰展宽、电动时间受限制、灵敏度提高有限、结果的重复性不好等问题)19及毛细管进口端切口不平造成的浓集区带变形、展宽等效应。DNA浓度降至 5?g/L时,在实施场放大技术过程中,图谱在 200 bp峰附近,常出现杂质峰。通过实验验证,TE中物质引起了杂质峰。DNA处于较高浓度时,图谱未见杂质峰,且 TE中物质紫外吸收值极低,却在 DNA样品稀释 10万倍,离子强度降至 1.5%TE的聚焦过程中检测出来,间接表明此方法的高灵敏度。鉴于本实验的主要目的是考察 CGE?UV对 DNA的检测灵敏度,实验未对 TE中何种物质引起的杂质峰作深入考察。References1?Jorgenson JW,LukacsD K.Anal.Chem.,1981,53(8):1298 13022?W oolley A T,M athies R.A.Proc.N atl.Acad.Sci.,USA,1994,91(24):11348 113523?Gao Q F,ShiY N,Liu S R.Fresenius Anal.Che m.,2001,371(2):137 1454?Sanchez?V ega B.BiomedicalApplications,2005:95 1165?W ard EM,SmythM R,O?K ennedy R,Lunte C E.J.Phar m.Biomed.Anal.,2003,32(4?5):813 8226?HoqueM E,A rnett S D,Lunte C E.J.Chro matogr.B,2005,827(1):51 577?Zhao Y P,Lunte C E.Anal.Che m.,1999,71(18):3985 39918?LiM,Fan L Y,Zhang W,Cao C X.Anal.Bioanal.Chem.,2007,387(8):2719 27259?A rnett S D,Lunte C E.Electrophoresis,2007,28(20):3786 379310?Kubalczyk P,Bald E.Anal.Bioanal.Chem.,2006,384(5):1181 118511?GongM J,W ehmeyerK R,L i mbach P 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G.Anal.Sci.,2008,24(8):1031 1037Investigation of Capillary GelElectrophoresis?U ltravioletDetection Sensitivity for Deoxyribonucleic AcidLI AN Dong?Sheng*,Z HANG X iang?N ian,HE Bao?X ia,ZHAO Shu?Jin,HAN L i?Ping(ThePharmacy Department of GuangzhouM ilitary Region s ChiefH ospital,Guangzhou 510010)Abstract?To enhance the CGE?UV detection sensitivity forDNA,the experi m ent took the known concentra?tion of DNA as standard samples,normal pressure injection,electrokinetic injection,head?colu mn field?amplified injection and the combination ofmatrix field?amplified and head?column field?amplified injection as1165第 8期连冬生等:毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度考察?means for capillary gel electrophoresis(CGE)?UV analyses,contrasted the sensitivity efficiencies of differentinjection means.And thenwe validated themethod?s reliability by analyzing the PCR productw ithout purifica?tion.The results showed that the dilution of DNA reached 400 thousand folds,compared w ith electrokineticinjection and pressure injection,on the prem ise that w ithout deteriorating the w idth and shape of peaks,extended the electrokinetic injection to 420 s,the concentration ofT ris?HCl(TE)wasdecreased from 100%to1.5%,the sensitivities of head?column field?amplified were increased to 28 and 90 folds respectively;afterthe combination ofm atrix field?amplified and head?column field?amplified injection were used,the sensitivitieswere increased to 3760 and 12057 folds.The detection li m it of DNA reduced to 0.1?g/L(S/N=3,CGE?FASI?UV)that approx i mated theDNA detection li m it of 009?g/L reported in literature(CGE?tI TP?LIF).A tthe same ti me,the analysis of PCR product certified the extremely high sensitivity for the method(50477,33354 folds sensitivity elevation for nor malpressure injection and normal electrokinetic injection respectively).Thism ethod was suitable for the analysis of trace DNA.Keywords?Deoxyribonucleic acid;Capillary electrophoresis;M atrix field?a mplified;H ead?column field?amplified electrokinetic injection;Polymerase chain reaction product(R eceived 3 September2009;accepted 30 January 2010)2010中日韩分析化学研讨会征文通知(第一轮)(2010 China-Japan-Korea Symposium on AnalyticalChe m istry)?由武汉大学主办,中国国家自然科学基金委员会、日本分析化学会、韩国分析化学会及中日韩分析化学恳谈会后援的 2010中日韩分析化学研讨会定于 2010年 10月 31日 11月 2日在武汉召开。会议将邀请来自日本、韩国和国内的著名专家参会。会议主题为生物医药分析,会议语言为英语。凡未在刊物上公开发表和未在学术会议上宣读过的反映分析化学基础研究、新技术、新方法的发展和分析应用的论文或综述,均可向本次会议投稿。论文摘要直接通过本会网站投稿,论文截止日期 2010年 8月 31日。经会议学术委员会审查录用的会议征文,将收入大会论文集。会议英文摘要格式详见会议网站通知。没有论文只参加会议的各界人士,也请于 2010年 8月 31日前与会务组联系,以便继续为您寄发下一轮通知。本会热诚欢迎国内外分析仪器公司和厂商到会介绍和展出产品,有关具体事宜,请与会议秘书组联系。会议网站:http:/ chenz l ,?电话:[phone]?分 析 化 学第 38卷