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临床儿科杂志 第 34 卷第 1 期 2016 年 1 月 J Clin Pediatr Vol.34 No.1 Jan.2016 29 川崎病患儿淋巴细胞亚群及免疫球蛋白的变化丁艳尹薇王瑞耕孙东明夏琨武汉市儿童医院风湿免疫科(湖北武汉430016)摘要：目的探讨检测川崎病(KD)患儿淋巴细胞亚群及免疫球蛋白的临床价值。方法入选 388 例 KD 患儿，160 例感染发热性疾病患儿，85 例健康体检的正常对照儿童；采用流式细胞仪检测 T 淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞(NK细胞)和 B 淋巴细胞绝对值和百分比，速率散射比浊法检测血清 IgG，IgM，IgA 和补体 C3、C4水平。结果与感染发热性疾病患儿及正常对照儿童相比，KD 患儿 B 细胞、补体 C3和 CD4/CD8 比值显著升高，而 CD8+T 细胞和 NK 细胞百分比下降，CD3+T 细胞的绝对值升高，差异均有统计学意义(P 均 0.05)。结论淋巴细胞亚群和补体可作为鉴别KD 和了解 KD 发病机制的实验室指标。关键词：川崎病；免疫球蛋白；儿童Changes in lymphocyte subsets and immunoglobulin in children with Kawasaki diseaseDING Yan,YIN Wei,WANG Ruigeng,SUN Dongming,XIA Kun (Department of Rheumatology and Immunology,Wuhan Childrens Hospital,Wuhan 430016,Hubei,China)Abstract:ObjectiveTo explore the clinical value of the analysis of lymphocyte subsets and immunoglobulin in children with Kawasaki disease(KD).MethodsThree hundred and eighty-eight children with KD,160 children with infectious febrile disease and 85 normal children for well child visit were enrolled.The absolute value and percentage of T lymphocyte subsets,natural killer cells(NK cells)and B lymphocytes were detected by flow cytometry.The serum levels of IgG,IgM,IgA,and com-plement C3,C4 were assessed by velocity scatter turbidimetry.ResultsCompared with infectious febrile children and normal control children,the levels of B cells,complements C3 and ratio of CD4/CD8 cells were significantly increased,the percentage of CD8+T cells and NK cells significantly decreased,and the absolute values of CD3+T cells significantly increased in children with KD(all P 0.05).ConclusionsLymphocytes subsets and complements might be used as laboratory index to identify KD and understand the pathogenesis of KD.Key words:Kawasaki disease;immunoglobulin;childdoi:10.3969 j.issn.1000-3606.2016.01.008川崎病(Kawasaki diseases，KD)，又称黏膜皮肤淋巴结综合征，是一种发生于儿童的自身免疫性血管炎综合征1。东亚地区儿童的KD发病率明显高于世界其他地区2。其主要病理变化是全身性非特异性的血管炎，主要累及中小血管尤其是冠状动脉，并且可能形成冠状动脉瘤，引起血栓性栓塞和狭窄，导致心肌梗死和猝死3。KD的主要危险因素是心脏并发症，目前KD所致的冠状动脉并发症已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要原因，并且可能成为成人后缺血性心脏病的危险因素之一4。虽然KD的发病机制尚未完全阐明，但在疾病的急性期往往能观察到免疫系统的高度激活和/或功能基金项目：武汉市卫计委临床医学科研项目(No.WX13A11)；武汉市“黄鹤英才(医疗卫生)计划专项 经费资助”项目(武人才办 201410 号)通信作者：尹薇电子信箱：障碍，因此感染性病原体被认为与KD疾病的发病有关5,6。基于最近的研究结果，KD的发病机制很可能类似急性风湿热的发病机制。KD发病机制的假说如下7：某一未知的病原体感染后，产生的致病物质传播并结合到中小血管内皮细胞上，为了控制这些致病物质的反应，免疫细胞被激活。首先，非特异性T细胞和非特异性抗体参与这一反应，然后过度活化的免疫细胞产生各种细胞因子，进而导致与内皮细胞进一步损伤相关的细胞因子失衡。炎症反应损伤血管后，特异性T细胞和抗体释放以对抗致病蛋白，然后组织损伤停止，免疫细胞的修复反应开始。因此，从假说中推测在KD患儿中淋巴细胞水平应该不论著临床儿科杂志 第 34 卷第 1 期 2016 年 1 月 J Clin Pediatr Vol.34 No.1 Jan.2016 30 同于健康儿童和发热感染性疾病患儿。然而，KD患儿的T、B淋巴细胞，自然杀伤（NK）细胞和免疫球蛋白的变化仍不明确，不利于KD及时正确地诊断治疗，也缺乏有助于鉴别诊断的实验室检测方法6,8-10。因此我们检测免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、补体C3、C4和T、B淋巴细胞及NK细胞在KD中的变化，以探讨免疫因素在KD发病机制中可能的作用，及其对诊断和鉴别诊断的价值。1对象与方法1.1研究对象选取2010年8月至2013年4月住院治疗的KD患儿作为研究对象。KD患儿入选标准：年龄2个月14岁；KD的诊断标准依据美国心脏病协会定义的标准11；既往体健，病程在10 d以内；近2周内未使用激素及其他免疫抑制剂治疗；除外自身免疫性疾病患儿。选取同期住院的呼吸系统感染发热的患儿作为发热对照组，如急性支气管肺炎、急性支气管炎、急性扁桃体炎等，年龄、性别与KD患儿相匹配；既往无免疫性疾病病史；近2周内未使用激素及其他免疫抑制剂治疗。选取同期健康体检的儿童、择期行包皮环切术和腹股沟斜疝手术的儿童作为正常对照组，年龄、性别与KD患儿相匹配；除外感染性疾病及免疫性疾病。研究程序均遵循医院医学伦理委员会所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准，均取得受试对象的知情同意并签署知情同意书。1.2方法1.2.1标本采集所有 KD 患儿在发热第 510 天接受静脉用丙种球蛋白（IVIG）治疗，于 IVIG 治疗前抽取 4 m1 静脉血分装于一促凝管和一 EDTA 抗凝管。于 8 h 内进行免疫球蛋白和淋巴细胞亚群检测。1.2.2流式细胞仪检测50 l 全血反向吸入 Tru-count 管中，加入20 l荧光抗体(CD4-APC、CD8-PE、CD3-FITC、CD19-APC、CD16CD56-PE，美国BD公司)，室温避光20 min后加入450 l溶血素(美国BD公司)，再于室温下静置15 min 后上机检测(FACS Calibur 流式细胞仪，美国 BD 公司，配置氩离子激光器，激发波长为 488 nm)。采用 MultiTEST自动软件获取和分析淋巴细胞亚群，得到各群细胞绝对计数及相对百分含量。1.2.3免疫球蛋白检测采用速率散射比浊法，仪器为西门子公司生产的 BN-特种蛋白测定仪。1.2.4多普勒超声心动图(UCG)检查采用飞利浦IE33 型彩色多普勒超声心动图仪，探头为 S8-3 型儿童专用心脏探头，专人操作。1.3统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数标准差表示，三组间差异的比较采用单因素方差分析(ANVOA)，进一步两两比较行Student-Newman-Keuls q检验。以P0.05)。2.2KD 组、发热组与正常组间淋巴细胞亚群比较三组间CD3、CD4、CD8、CD16CD56、CD19的绝对值及CD4/CD8比值的差异均有统计学意义(P均0.01)。三组间CD3、CD4、CD8、CD16CD56、CD19百分比的差异也均有统计学意义(P均0.01)。见表1。CD3、CD4、CD8、CD16CD56的绝对值均以发热组最高，CD3、CD4的绝对值KD组次之，正常对照组最低；CD8、CD16CD56的绝对值正常对照组次之，KD组最低；CD19、CD4/CD8比值则以KD组最高，发热组次之，正常对照组最低。其中，KD组与发热组间，CD3、CD8、CD16CD56、CD19、CD4/CD8比值的差异有统计学意义(P均0.05)；KD组与正常对照组间，CD3、CD4、CD19、CD4/CD8比值的差异有统计学意义(P均0.05)；发热组与正常对照组间，CD3、CD4、CD8、CD19、CD4/CD8比值的差异有统计学意义(P均0.05)CD3、CD8、CD16CD56的百分比均以正常对照组最高，发热组次之，KD组最低；CD4、CD19的百分比以KD组最高，发热组次之，正常对照组最低。其中，KD组与发热组间，CD3、CD8、CD16CD56、CD19的差异有统计学意义(P均0.05)；KD组与正常对照组间，CD3、CD4、CD8、CD16CD56、CD19的差异有统计学意义(P均0.05)；发热组与正常对照组间，CD4、CD8、CD16CD56、CD19的差异有统计学意义(P均0.05)。临床儿科杂志 第 34 卷第 1 期 2016 年 1 月 J Clin Pediatr Vol.34 No.1 Jan.2016 31 2.3KD 组、发热组与正常组间免疫球蛋白比较三组间IgG、C3、C4的差异均有统计学意义(P均0.01)。见表2。IgG、C4水平均以发热组最高，正常对照组次之，KD组最低；C3水平以KD组最高，发热组次之，正常对照组最低。其中，KD组与发热组间，IgG、C3、C4的差异均有统计学意义(P均0.05)；KD组与正常对照组间，C3的差异有统计学意义(P0.05)；发热组与正常对照组间，IgG、C3的差异均有统计学意义(P均0.05)。3讨 论1967年川崎病首次在日本报道，它可以影响所有种族，但在亚洲和太平洋岛国儿童中最常见。迄今为止，由于KD的病因不明，且没有明确的可用于诊断或鉴别诊断的实验室检测项目，因此目前对KD的诊断仍为临床诊断，但在临床工作中，部分临床表现不十分典型的病例易与其他感染发热性疾病混淆，难以正确诊断、及时治疗，存在误诊或漏诊的情况，从而导致对昂贵药品(人血丙种球蛋白)的不合理使用而增加患儿家庭的经济负担或是错过最佳治疗时机而增加冠状动脉病变（CAL）的发生率，因此对KD的及时正确诊断至关重要12。由此分析相关实验室检测数据，找出具有诊断及鉴别诊断意义的实验室线索十分必要。KD为一免疫性疾病，其发病机制涉及细胞及体液免疫功能改变，本研究结果表明，与正常组和发热对照组相比，KD患儿的某些免疫细胞数量有显著差异。在KD及发热性疾病中，CD4细胞的绝对值和百分比均升高，提示辅助性T细胞随着体温的升高而激活。而CD8细胞在发热组升高，但在KD组降低，这表明CD8细胞的变化可能是KD和感染发热性疾病之间特征性的区别。此外，在KD、感染发热患儿与正常儿童之间，CD4/CD8比值显示出更大的差异。KD组中NK细胞呈现下降的趋势，尤其是NK细胞的百分比。而KD患儿的CD19细胞百分比和绝对值都显著升高，甚至高于感染发热性疾病组，这表明升高的B细胞可能是鉴别KD、正常儿童和感染发热患儿的特征之一。对KD患儿免疫球蛋白和补体的变化的研究表明，感染发热组IgG明显高于其他两组，但IgM和IgA并没有这样的改变，表明在感染发热性疾病中主要是IgG抗体的升高。感染发热组补体C4水平明显高于KD组，而KD组C3水平显著高于其他两组，这表明补体C3和C4在KD和感染发热疾病中发挥着不同的作用，C3水平升高有助于对KD的诊断。本研究显示，KD与正常儿童和感染发热患儿最显著的差异是B细胞、补体C3水平和CD4/CD8细胞组别例数CD3CD4CD8CD16CD56CD19CD4/CD8KD 组(绝对值)388217813611)2)13619152)6954921)3122911)12198031)2)2.271.131)2)发热组(绝对值)160268021052)149611792)106912202)42943010478642)1.630.712)正常组(绝对值)851766656 890364 7252993692335402581.250.30F 值 11.132 12.028 15.205 7.501 27.339 52.771P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001KD 组/%38856.210.51)2)35.19.32)18.16.51)2)8.25.41)2)32.911.31)2)发热组/%16062.111.3 34.79.12)24.19.32)10.25.62)25.310.52)正常组/%8564.16.9 32.04.726.54.913.55.919.75.0F 值 31.757 4.372 71.892 34.294 70.333P 0.001 0.013 0.001 0.001 0.001注：1)与发热组比较，P0.05；2)与正常组比较，P0.05 表 1三组间淋巴细胞亚群的比较(xs)组别例数IgGIgMIgAC3C4KD 组388 7.133.001)1.290.640.770.49 1.280.241)2)0.270.091)发热组160 8.022.932)1.280.530.750.58 1.140.282)0.300.13正常组 85 7.211.481.150.440.630.34 1.010.210.280.09F 值 5.766 2.001 2.764 49.824 4.945P 0.003 0.136 0.064 0.001 0.007注：1)与发热组比较，P0.05；2)与正常组比较，P0.05 表 2三组间免疫球蛋白及补体的比较(xs)临床儿科杂志 第 34 卷第 1 期 2016 年 1 月 J Clin Pediatr Vol.34 No.1 Jan.2016 32 的比值，CD8+T细胞和NK细胞的百分比也表现出差异，结果提示KD免疫改变的关键点可能是B细胞、补体C3和CD4/CD8比值，以及CD8+T细胞和NK细胞的百分比。迄今为止，KD的病因及发病机制还不十分明确。病因学研究表明，某些单核苷酸多态性可能与KD的遗传易感性有关，包括FCRIIA位点和ITPKC基因的功能多态性13。ITPKC基因是一种T细胞活性调节剂，这表明T细胞活性调节可能是决定KD易感性和病情严重程度的潜在机制6。我们的研究也显示KD组CD3+细胞的绝对值以及CD4/CD8比值与其他组相比存在差异，进一步证实了T细胞在KD发病中的作用。我们的研究还表明B细胞和补体C3也与KD发病有关。最近的研究还发现，KD患儿免疫反应中黏膜表面的IgA浆细胞占主要优势，并且童年时期患感染性疾病也是其共同特征8,14,15，由此推测，一小群遗传易感患者暴露于一个或多个环境诱因发生的免疫反应是KD主要的发病机制。但到目前为止没有研究证实病原的存在16。我们的研究发现，KD患儿的B细胞和补体C3明显高于正常儿童和感染发热性疾病患儿，这表明，感染可能仅仅是一个触发因素，关键的机制还是免疫系统的紊乱，明显增加的B细胞和C3水平表明KD中占主导地位的可能是体液免疫，并且由于细胞免疫的紊乱及补体持续增高而引起疾病。本研究结果表明KD患儿与感染发热性疾病患儿及正常儿童之间最典型的差异是B细胞、补体C3、CD4/CD8比值，CD8+T细胞和NK细胞的百分比，以及CD3+T细胞的绝对值。淋巴细胞亚群和免疫球蛋白可能是鉴别KD和其他感染发热性疾病以及正常儿童的实验室检测指标。参考文献：1 Burns JC.The riddle of Kawasaki disease J.N Engl J Med，2007，356(7)：659-661.2 Uehara R，Belay ED.Epidemiology of Kawasaki disease in Asia，Europe，and the United States J.J Epidemiol，2012，22(2)：79-85.3 Scuccimarri R.Kawasaki disease J.Pediatr Clin North Am，2012，59(2)：425-445.4 Onouchi Y.Genetics of Kawasaki 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