胆固醇平衡调控.pdf

上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版)J O U R N A LO FS H A N G H A I J I A O T O N GU N I V E R S I T Y(A G R I C U L T U R A LS C I E N C E)V o l.2 4N o.3J u n.2 0 0 6第 2 4 卷 第 3 期2 0 0 6 年 6 月摘要：胆固醇在生物体内发挥着极其重要的作用。细胞主要通过调节胆固醇的合成、吸收、酯化及外流等途径之间的平衡以维持正常的胆固醇浓度。本文介绍甾醇调控元件结合蛋白(S R E B P,S t e r o l r e g u l a t o r y e l e m e n t-b i n d i n g p r o t e i n s)转录因子对胆固醇平衡的调控。S R E B P 主要调节胆固醇的合成、L D L 受体介导的胆固醇的吸收和脂肪酸的合成。S R E B P 前体是一内质网膜蛋白，S R E B P 经两次蛋白酶水解后释放出其 N端结构域，进入细胞核，激活靶基因的转录。随着对 S R E B P领域研究的深入，人们对胆固醇平衡调节将认识更多，并有可能开发出更为有效的控制胆固醇的药物。关键词：胆固醇；动态平衡；S R E B P 途径中图分类号：R 3 9 4.3文献标识码：AS R E B PP a t h w a yi nC h o l e s t e r o l H o me o s t a s i s R e g u l a t i o nY A OX i a o-m i n1,2,3,S O N GB a o-l i a n g2,WA N GC a n-h u a2,3,Z H A N GWe n-j i n g2,4,L I NZ h i-x i n3,L I B o-l i a n g2(1.C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e a n dB i o l o g y,S h a n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 1 1 0 1；2.I n s t i t u e o f B i o c h e m i s t r y a n dC e l l B i o l o g y,C A S,S h a n g h a i 2 0 0 0 3 1；3.C o l l e g e o f B i o c h e m i s t r y a n dT e c h n o l o g y,J i a o t o n g U n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0 0 3 0；4.S c h o o l o f B i o l o g y a n dE n g i n e e r i n g,E a s t C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,S h a n g h a i 2 0 0 2 3 7,C h i n a)A b s t r a c t：A c y l-C o A:c h o l e s t e r o l a c y l t r a n s f e r a s e(A C A T)p l a y s a ni m p o r t a n t r o l e i no r g a n i s m s.C e l l s c a nm a i n t a i na n o r m a l c h o l e s-t e r o l l e v e l b y r e g u l a t i n g t h e s y n t h e s i s,a b s o r p t i o n,e s t e r i f i c a t i o na n dt r a n s p o r t a t i o no f c h o l e s t e r o l.I nt h i s p a p e r w e m a i n l y i n t r o-d u c e dt h ee f f e c t o f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r S R E B Po nc h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i s r e g u l a t i o n.S R E B P s a r eaf a m i l yo f m e m b r a n e-b o u n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h a t c o n t r o l t h e s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l a n df a t t y a c i d s i na n i m a l c e l l s.S R E B Pp r e c u r s o r s a r e m e m b r a n e p r o-t e i n s,t h e ya r ei n s e r t e di n t om e m b r a n e s o f t h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m(E R)i nah a i r p i nf a s h i o n.S R E B Pp r e c u r s o r s e x i t t h eE Ra n dt r a n s i t t o t h e G o l g i a p p a r a t u s,w h e r e t w o d i s t i n c t p r o t e a s e s c l e a v e t h e S R E B Pp r e c u r s o r t o r e l e a s e t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v e N-t e r m i n u s.Wi t ht h es t u d yo f S R E B P,p e o p l e sk n o w l e d g eo nc h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i sr e g u l a t i o nw i l lp r o m o t et h ed e v e l o p i n go fc h o l e s t e r o l-c o n t r o l l i n g d r u g s.K e yw o r d s:c h o l e s t e r o l;h o m e o s t a s i s;S R E B Pp a t h w a y正常生理条件下，高等生物细胞中的胆固醇水平被维持在一个相当狭小的浓度范围之内。哺乳动物体内胆固醇浓度过高或过低都将影响其正常生命过程，甚至产生严重病变。因此，生物体为维持其正常的生命活动，必需有精细的调控机制以维持胆固醇的平衡。脊椎动物中，由于不同的组织细胞分工不同，其收稿日期：2 0 0 5-1 2-2 5作者简介：姚晓敏（1 9 6 8-），女，江苏南通人，博士生，副教授，研究方向：食品安全与功能食品.文章编号：1 6 7 1-9 9 6 4(2 0 0 6)0 3-0 3 1 1-1 0胆固醇平衡调控中的 S R E B P途径姚晓敏1，2，3，宋保亮2，王灿华2,3，张文静2,4，林志新3，李伯良2(1.上海交通大学 农业与生物学院，上海 2 0 1 1 0 1；2.中国科学院 上海生物化学与细胞生物学研究所，上海 2 0 0 0 3 1；3.上海交通大学 生命科学与技术学院，上海 2 0 0 0 3 0；4.华东理工大学 生物工程学院，上海 2 0 0 2 3 7)上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版)第 2 4卷胆固醇平衡调控的机制和信号途径也略有差别。细胞主要通过调节胆固醇的合成、吸收、酯化及外流等途径之间的平衡以维持正常的胆固醇浓度。而对生物个体来说，胆固醇平衡调控发生在三方面：合成；吸收及代谢。通过对这些途径中的关键酶和基因的研究，人们对于胆固醇平衡调控和其中涉及的转录因子有了较为系统的认识。其中最重要的是甾醇调控元件结合蛋白(S R E B P,S t e r o l r e g u l a t o r y e l e m e n t-b i n d i n g p r o t e i n s)途径。1 S R E B P 途径的负反馈调控胆固醇的从头合成及 L D L R介导的胆固醇的吸收1.1 胆固醇的从头合成胆固醇生物合成从乙酰-C o A缩合开始，胆固醇合成酶系存在于内质网和胞液部分，并且需要细胞液中的辅助因子如 N A D P H，A T P等参与。细胞内胆固醇的合成过程可概括为五大步骤：(1)二羟甲基戊酸（m e v a l o n i c a c i d,M V A）的生成；(2)异戊烯醇焦磷酸酯（I P P）的形成；(3)鲨烯（s q u a l e n e）的合成；(4)羊毛脂固醇（l a n o s t e r o l）的形成；(5)胆固醇的形成。1.2 L D L R介导的胆固醇的吸收低密度脂蛋白（L D L）是人血液中运输胆固醇的主要脂蛋白。L D L 颗粒包含一平均直径为 2 2 n m的核，含有约 1,5 0 0 个胆固醇脂分子，其外周是一极性的包被，主要由磷脂和分子量为 5 1 3k D a 的 A p o B-1 0 0 组成。L D L的前体是由肝脏分泌的直径约 5 5 n m的极低密度脂蛋白（V L D L），其核心包括甘油三酯和胆固醇酯。V L D L 的甘油三酯首先在肌肉组织和脂肪组织中被去除，接着和其它脂蛋白发生交换，去除其它的载脂蛋白保留 A p o B-1 0 0，最终成熟为 L D L。L D L 在人血浆中的平均寿命为 2.5d，L D L通过与细胞膜表面的L D L 受体（L D L R）结合通过受体介导的内吞而被清除。1.3 S R E B P的结构与功能大量研究表明当细胞暴露于高浓度的胆固醇或氧化甾醇时，H M G-C o A合成酶、H M G-C o A还原酶、法呢酰焦磷酸合成酶、鲨烯合成酶及 L D L 受体基因的转录水平降低；另一方面，当培养基中甾醇浓度降低或H M G-C o A还原酶的竞争性抑制剂存在时，这些基因的转录增加。G o l d s t e i n、B r o w n 和其合作者在 H M G-C o A合成酶和 L D L受体基因的启动子中鉴定出 1 0b p 长的 D N A元件，它是甾醇调控转录所必需，该元件被命名为 S R E-1。随后，一个分子量约 6 8k D a 特异的结合蛋白甾醇调控元件结合蛋白（S R E B P）被鉴定，并证明 S R E B P 增加 L D L R和 H M G-C o A合成酶基因启动子的活性 1。目前发现有三个 S R E B P s：S R E B P-1 a，S R E B P-1 c，S R E B P-2，其中 S R E B P-1 a 和 S R E B P-1 c 由同一个基因（S R E B P-1）的不同启动子转录而产生。大鼠的 S R E B P-1 c 能与 E-b o x 结合而被独立克隆，并由于其可作为脂肪细胞潜在的决定和分化因子而命名为 A D D-1（a d i p o c y t e d e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r）2。S R E B P s 的前体蛋白是分子量约 1 2 5k D a（1,1 5 0a.a.）的膜蛋白，以发夹的结构定位于内质网和核包被上，含有三个结构域。(1)N端结构域，约 4 8 0 个氨基酸；(2)C端结构域，约 5 9 0 个氨基酸，这两个结构域均位于细胞质面；(3)8 0 个氨基酸的中间结构域，它包括两个跨膜区及一位于内质网或核包被腔面的 3 1个氨基酸的 l o o p。S R E B P s 的 N端结构域属于 b a s i c-l o o p-h e l i x-l e u c i n ez i p p e r（b H L H-Z i p）类转录因子 3，N端最末端是富含酸性氨基酸的 D N A激活结构域，结合共转录因子（t r a n s c r i p t i o n a l c o a c t i v i t o r s）如 C B P 4。在 S R E B P-1 a和 S R E B P-2 中这段酸性氨基酸较长，而 S R E B P-1 c 中则较短。与另两个 S R E B P 相比，S R E B P-1 c 的转录激活作用则较弱 5。所有这三个 S R E B P 的 N端都有一 b H L H-Z i pm o t i f，它介导了转录因子的二聚化、进核及 D N A结合。在这个 m o t i f 的核心区中，S R E B P s 以一个 T y r 代替其它 b H L H-Z i p 家族中保守的 A r g，这个替换使得 S R E B P s 能够识别长十个核苷酸的胆固醇反应元件 S R E。其它 b H L H-Z i p 家族成员结合的 D N A序列一般是回文结构，而 S R E则是非回文的，通常含有一到两个 C A C 6。S R E B P对 H M G-C o A合成酶和L D L受体基因启动子中的 S R E（T C A C C C C A C T）结合能力远远大于对随机 D N A序列的结合能力 7,8。但在其它启动子中，S R E B P 识别不同的序列，并未发现明显的保守性 9。3 1 2第 3期在甾醇剥脱的细胞中，经过两步有序的蛋白酶水解，S R E B P的 N端结构域从膜中释放出来，进入细胞核，结合于许多基因的 S R E上，调控了胆固醇的生物合成，不饱和脂肪酸的生物合成，甘油三酯的生物合成及脂质的吸收 1 0。在胆固醇生物合成途径中，S R E B P 的靶基因包括 H M G-C o A合成酶、H M G-C o A还原酶、法呢酰焦磷酸合成酶和鲨烯合成酶的基因(E d w a r d s e t a l 1 9 9 8)；脂肪酸和甘油三酯的生物合成途径中的靶基因包括乙酰 C o A羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰 C o A去饱和酶和甘油三磷酸：酰基转移酶的基因 9,1 0。S R E B P 同时也增强了 L D L 受体的表达，L D L R介导了从血液脂蛋白的胆固醇的吸收。高表达 S R E B P 的 N端结构域也提高了脂质合成中其它基因的 m R N A水平 1 1。当细胞中的甾醇增加时，S R E B P 从膜上的蛋白裂解释放就被阻断，已经入核的 N端蛋白被迅速地降解 1 2，于是，所有靶基因的转录下降，胆固醇及脂肪酸的生物合成减少。1.4 S R E B P的两步蛋白裂解释放如图 1 所示，这个过程从 S 1 P（S i t e-1p r o-t e a s e，位点 1蛋白酶）裂解 S R E B P开始，S 1 P在S R E B P的内质网腔面亲水环处水解 S R E B P。在S R E B P-2 中，这个裂解发生在 R S V L S 的 L e u 和S e r 之间。S 1 P绝对要求在 P 4 位是一碱性氨基酸，在 P 1 位最好是 L e u，而 P 2，P 3 和 P 1 位的氨基酸并不影响蛋白裂解 1 3。S R E B P被 S 1 P裂解成两个膜结合的半分子，这个分离可被免疫共沉淀实验检测到：裂解之后，C端抗体不能沉淀膜结合的 N端结构域，后者又叫 S R E B P 中间体片段。S R E B P 的两半分开以后，称为 S 2 P（S i t e-2p r o t e a s e，位点 1蛋白酶）的第二个蛋白水解酶在跨膜结构域中裂解 N端中间体片段。在 S R E B P-2 蛋白中，这一步裂解发生在氨基酸序列 D R S R I L L C的 L e u 和 C y s 之间 1 4，该序列中的第二个氨基酸 A r g 被认为是亲水的 N端结构域和疏水的跨膜区的分界点。因此，这步蛋白水解发生在疏水的跨膜区中，当 N端片段离开膜进入细胞核时，在其 C端仍带有疏水的三个残基 I L L。已经知道，S 2 P的识别序列要求全部或部分 D R S R序列，I L L C中任一氨基酸被突变为 A l a 时并不影响裂解，但精确的识别序列尚不清楚。甾醇通过选择性地抑制 S 1 P 而阻断了 S R E B P 的蛋白水解释放过程，当前实验证据表明 S 2 P 并不直接受甾醇的调控，但它是被间接调控的，因为只有 S R E B P 被 S 1 P 切为两半时，它才能发挥作用 1 5。1.5 S R E B P裂解激活蛋白（S C A P）-甾醇浓度的感受器对于 S R E B P 调控的认识最早突破在于分离克隆编码 S R E B P 裂解激活蛋白（S C A P）的 c D N A，S C A P是一个在位点 1 裂解所必需的调控蛋白。S C A P 是一个整合膜蛋白，有 1,2 7 6 个氨基酸（图 2），包括两个不同的结构域：(1)N端结构域的约 7 3 0 氨基酸中，亲水和疏水序列交替出现，表明它是一 8 跨膜的蛋白 1 6，(2)C端 5 5 0 个氨基酸的结构域伸向胞质面，并含有 5 个 WD重复，每个重复长约 4 0a.a.，相似的结构也在许多其它的细胞内蛋白中发现，WD重复通常介导了蛋白与蛋白之间的相互作用 1 7例如，G蛋白的异源三聚体中，(亚基的 WD重复形成一种类似“桨状结构的片层”，和 、亚基相结合 1 8,1 9。在细胞内，S C A P 的 WD重复结构域和 S R E B P 的调节结构域相互作用使二者形成一紧密的复合物 2 0,2 1，许多证据表明这种相互作用是位点 1 裂解所必需的：(i)缩短 S R E B P-2 的 C末端结构域，阻止了与 S C A P 的相互作用，并且对于 S 1 P 不再敏感；(i i)高表达 S C A P 的 C端结构域或 S R E B P-2 的 C端结构域，竞争性地阻图 1 甾醇调控的 S R E B P 从膜上的蛋白水解释放模式图F i g.1T w o-s t e ph y d r o l y s i s r e a c t i o no f S R E B Pm e d i a t e db y s t e r o l(B r o w nM S,e t a l P r o c N a t l A c a dS c i,1 9 9 9,9 6(2 0):1 1 0 4 1-1 1 0 4 8)S i t e-1C l e a v a g e-S t e r o l R e g u l a t e dE RL u me nb HL HR e g.WDS R E B PS t e r o l sS I Pb HL HR e g.b HL Hb HL HS 2 PZ n*R e l e a s eN u c l e u sS R E-1S C A PS i f e-2c l e a v a g e姚晓敏，等:胆固醇平衡调控中的 S R E B P 途径3 1 3上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版)第 2 4卷断了内源 S C A P与 S R E B P-2 复合物的形成，位点 1 的裂解不能发生。基于以上实验，G o l d s t e i n 和 B r o w n 认为S C A P/S R E B P复合物才是 S 1 P的真正底物。对突变的 C H O细胞株的研究发现，S C A P除了是位点 1 裂解的必要成分之外，它还是甾醇抑制该步裂解的靶蛋白。C H O细胞突变株是这样筛选的，在细胞培养基中加入氧化型甾醇包括 2 5-羟基胆固醇以阻断S R E B P在位点 1 的水解，从而抑制胆固醇的合成。这些氧化型胆固醇并不能代替胆固醇在细胞膜中的作用，因此，除非外源添加胆固醇，否则细胞将死亡。氧化型甾醇抗性的突变株因为不能产生氧化型甾醇导致的胆固醇合成的关闭，所以能够存活，这就构成了遗传选择的基础 2 2。氧化型甾醇抗性的 C H O细胞突变株可分为两种互补的类型，它们都是显性遗传。类型 I 甾醇抗性突变是由于产生了一缩短了的 S R E B P-2 蛋白，含有完全的 N端结构域，但在跨膜区前中止。缩短了的 S R E B P不经蛋白裂解而直接进入细胞核，所以它不受氧化型甾醇的抑制 2 3,2 4。类型 I I 突变可产生正常的全长 S R E B P-1 和 S R E B P-2，并可被蛋白酶水解，但不能在添加甾醇的情况下关闭蛋白裂解。G o l d s t e i n 和 B r o w n 实验室于是制备了这种突变株的 c D N A文库，转染入人胎肾细胞 H E K 2 9 3，通过分析报道基因的氧化型甾醇依赖的抑制表达而最终克隆了编码S C A P 的 c D N A。突变体的 S C A P 有一 C变为 G，导致 4 4 3位的 A s p 变为 A s n，也在另两个突变株中发现同样的突变，而在第四个突变株中，则是 2 9 8 位的 T y r 变为 C y s。当这些突变的 S C A Pc D N A转染入野生型细胞，S 1 P对于氧化型甾醇的敏感性就被剥脱了。G o l d s t e i n 和 B r o w n 对该现象进行了解释，在正常情况下，甾醇通过直接或间接与S C A P相互作用而抑制了 S 1 P的活性；而突变的 S C A P不仅不再对甾醇的抑制有反应，而且介导了 S 1 P对S R E B P的水解，所以即使有高浓度的甾醇存在，S 1 P的活性也并未被阻止，这也解释了为什么氧化型甾醇抗性细胞是显性突变。值得注意的是，所有的上述 S C A P 突变都发生在其 1 6 0 个氨基酸的膜结构域区段中，该区段包括了S C A P的 8 个跨膜区中的 5 个，在另三个蛋白质中也发现这种相似的 5 跨膜区，它们都与胆固醇相关（图5）。甾醇敏感结构域（s t e r o l-s e n s i n g d o m a i n）首先在 H M G-C o A还原酶的跨膜区发现，它负责在氧化型甾醇浓度增高时加速 H M G-C o A还原酶的降解 2 5；甾醇敏感结构域还在 N P C 1 蛋白中发现，该蛋白负责 L D L来源的胆固醇从溶酶体到内质网的运输 2 6；在称为 P a t c h e d 的蛋白中也发现了甾醇敏感结构域，P a t c h e d 是形态发生蛋白 H e d g e h o g 的受体，H e d g e h o g 是目前发现的唯一被胆固醇共价修饰的蛋白。最近，发现又一个图 3 含有甾醇敏感结构域的膜蛋白F i g.3T r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s c o n t a i n i n gs t e r o l-s e n s i n g d o m a i n s(G i l G,e t a l,1 9 8 5,C e l l 4 1,2 4 9-2 5 8)S C A PH MG-COAR e d u c t a s eN P C 1P a t c h e dNNNNCCCC图 2 S C A P 的拓扑结构F i g.2T h e m e m b r a n e t o p o l o g y o f S C A P(N o h t u r f f t A,e t a l,1 9 9 8,J B C,2 7 3:1 7 2 4 3-1 7 2 5 0)WDR e p e a t sS C A P7 3 1N H21Y 2 9 8 C1Mu t a n tD 4 4 3 N3Mu t a n t sC O O H1 2 7 63 1 4第 3期含有甾醇敏感结构域的蛋白 P a t c h-r e l a t e d蛋白 T R C 8，从而使该家族成员数增加到 5 个。甾醇敏感结构域是否直接和甾醇相互作用，或它通过和其它蛋白相互作用进而受甾醇的影响尚不清楚。1.6 编码 S 2 P（S i t e-2P r o t e a s e）的候选基因利用体细胞遗传（s o m a t i c c e l l g e n e t i c s）的方法，G o l d s t e i n 和 B r o w n 实验室不仅发现了 S C A P，而且克隆了 S 2 P 和 S 1 P 的候选基因。其中首先是 S 2 P。D a r t m o u t h 医学院的 T YC h a n g 实验室最先筛选出一胆固醇突变的营养缺陷型细胞株（M 1 9），它不能制造 L D L受体、胆固醇合成途径中的许多酶和脂肪酸去饱和酶 2 7。分析发现 M 1 9 细胞能在位点 1 裂解 S R E B P，但不能在位点 2 水解 S R E B P 2 8，所以 S R E B P 的 N端结构域仍结合在 E R膜上，不能进入细胞核激活其靶基因的表达。T YC h a n g 实验室已经证明 M 1 9 细胞为隐性突变，可以被转染的正常细胞的基因组 D N A所补偿，能在胆固醇缺陷的培养液中存活，进而构成遗传选择的基础。D a r t m o u t h 医学院的 T YC h a n g 实验室和西南医学中心的 G o l d s t e i n 和 B r o w n 实验室合作，最终克隆了 S 2 P。该基因编码的蛋白是 S R E B P 在位点 2 裂解所必需，虽然许多间接证据表明 S 2 P可能就是位点 2 蛋白水解酶（见下），但还没有直接的生化证据支持该结论。S 2 P 也有可能是真正的位点 2 蛋白酶执行功能所必需的一个辅助因子。人 S 2 P基因编码一 5 1 9 个 a.a.的极端疏水的蛋白质，该蛋白的绝大部分是疏水的（图 6），但有两个亲水的区段，一段是 c y s t e i n e-r i c h，另一段包括 2 3 个保守的 S e r。当前证据表明这两个亲水序列伸向内质网的腔面，其它部分包被在膜中。S 2 P 的一个疏水片段含有序列 H E I G H，这与锌金属蛋白酶活性中心的保守序列 H E X X H相一致，突变实验证实 H E X X H序列是 S 2 P 恢复 M 1 9 细胞中位点 2 裂解所必需。计算机搜索 D N A数据库发现的其它物种中的 S 2 P 同源蛋白，几乎都含有 H E X X H保守序列，并且与人 S 2 P 有相似的疏水特征 2 9,3 0。虽然突变数据和 S 2 P是真正的位点 2 蛋白酶相一致，但是到目前为止，所有的试图 i nv i t r o 证明分离的 S 2 P具有蛋白酶活性的尝试都失败了。这些不成功很显然是由于巨大的实验难度所造成，因为（i）需要获得活性形式的膜蛋白，（i i）其可能的底物 L e u-S e r 键要存在于另一蛋白质的跨膜区中，（i i i）使二者在一起并发生反应很难。如果 S 2 P确实是一锌金属蛋白酶，那么它的疏水特征就使它与该家族中的其它成员截然不同。虽然该家族也有其它膜结合的酶如：基质金属蛋白酶，血管紧张素和内皮素转化酶，但它们的底物与 S 2 P显著不同。这些酶中，活性位点位于亲水区，催化结构域只是简单地由一个疏水的片段固定在膜上。而在 S 2 P中，活性位点位于疏水序列并被包埋在膜中。如果 S 2 P 是一蛋白水解酶，它将是第一个被鉴定出的底物是另一蛋白跨膜区的蛋白酶。蛋白水解发生在脂双分子层中显然要求一疏水的酶，酶在这种情况下如何发挥作用尚不得而知。因为既然 S 2 P基因是通过互补实验从 M 1 9 细胞中克隆得到，所有证明 M 1 9 细胞中这个基因是突变的是很有必要的。N o r t h e r n 实验在野生型的 C H O细胞和其它组织中可检测到 S 2 P 的 m R N A，而在 M 1 9 细胞中并未发现。S 2 P基因定位于 X染色体，虽然野生型 C H O-K 1细胞应含有该基因的两个拷贝，但S o u t h e r n 杂交表明只有一个拷贝，M 1 9 细胞来自 C H O-K 1，这个拷贝由于发生了复杂的 D N A重组使转录不能进行。另外，由于在几乎所有的生物中都发现有 S 2 P 的同源蛋白，所以 S 2 P 可能发挥了更为基本的作用，而非仅仅是 S R E B P 的处理。1.7 编码 S 1 P（S i t e-1P r o t e a s e）的候选基因当用类似的体细胞遗传技术克隆 S 1 P 时，则遇到了困难。因为在 C H O-K 1 细胞中，S 2 P 基因只有一个拷贝，当进行 C H O细胞突变筛选胆固醇营养缺陷的细胞株时，总是分离得到 S 2 P的突变株，推测是单拷贝基因的突变比双拷贝基因的同时突变可能性要大的多。为解决这个问题，G o l d s t e i n 和 B r o w n 实验室用编码 S 2 P的 c D N A转染 C H O-K 1 细胞，分离含多个拷贝的稳定细胞株，以减少 S 2 P缺陷突变出现的概率 3 1。致突变处理之后，再用多个步骤分离 S 1 P突变的细胞株：首先把细胞与掺入荧光标记的胆固醇酯（p y r e n e-m e t h y l c h o l e s t e r y l o l e a t e,P M C A-o l e a t e）的 L D L相互作用，只有一个拷贝的 S 1 P细胞由于 S R E B P的减少，将产生较少的 L D L受体，吸收较少的荧光标记的 L D L，分离这些细胞；然后，在这些细胞上进行第二轮突变以灭活 S 1 P 的另一拷贝，利用 T YC h a n g 实验室早期发展的一种方法来筛选 3 2。具体做法是细胞与低浓姚晓敏，等:胆固醇平衡调控中的 S R E B P 途径3 1 5上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版)第 2 4卷度的 L D L短时间相互作用，有正常 S R E B P活性的细胞将通过增加胆固醇的合成与 L D L R介导的吸收来维持胆固醇的浓度，而 S R E B P 途径被阻断的细胞则不能通过上述方法获得胆固醇而造成胆固醇在细胞中的剥脱；接着用两性霉素处理细胞，它通过和细胞膜上的胆固醇形成复合物而杀死细胞。因此，野生型细胞被两性霉素杀死，而胆固醇缺陷的细胞能够存活。在此选择之后，添加醇溶的胆固醇、甲羟戊酸和油酸以维持营养缺陷型细胞的生存。利用上述方法得到了 S R E B P在位点 1 裂解缺陷的一些细胞株，细胞融合实验表明是隐性突变，以这些细胞为受体进行如下的瞬时转染实验以克隆目的基因。首先，他们构建了一个载体带有一基因编码依赖于 S 1 P 裂解的可分泌的融合蛋白，它由人胎盘碱性磷酸酶（P L A P）和 S R E B P-2 的 C段构成。P L A P 是一个细胞膜膜蛋白，催化结构域在胞外，通过 C端的鞘糖脂而锚定在膜上。在此，去除了 P L A P的 C端膜结合区，而与 S R E B P-2 的腔面区相连，包括 S 1 P 的识别序列 R S V L。当 P L A P/B P 2 融合蛋白在野生型细胞中表达时，P L A P 的信号肽将催化结构域带到内质网的腔面，然后通过信号肽酶的水解，P L A P的 N端离开膜，而 C端通过 S R E B P-2 的半分子仍然固定于膜上，S 1 P 的裂解使催化结构域释放到内质网腔中，进而被分泌到培养基中，其活性可由化学荧光方法测得 2 1。对照实验显示当野生型 C H O细胞转染编码 P L A P/B P 2 融合蛋白的 c D N A时，P L A P能被分泌到培养基中，分泌要求共转染编码 S C A P 的 c D N A，这显然是由于内源的 S C A P不足。分泌过程能被甾醇阻断，并当 R S V L 序列突变后不能被检测到。所有这些实验证明 P L A P 的分泌要求 S 1 P。而转染入 S 1 P 突变细胞株S R D-1 2 B中，不能分泌 P L A P，进一步证实了 S 1 P 的重要性。为克隆 S 1 P，在 S R D-1 2 B细胞中瞬时转染 P L A P/B P 2 表达质粒、编码 S C A P的质粒（图 7）、和 C H O细胞的 c D N A文库，同时用带有(-半乳糖苷酶基因的质粒作为内标以校正转染效率。转染后，培养基用来分析 P L A P活性，细胞用来分析(-半乳糖苷酶活性，最终得到了一个阳性的 c D N A。它编码 1,0 5 2 个氨基酸其序列具有所有的位点 1 蛋白酶的预期特征，因此把它命名为 S 1 P。S 1 P 的 N端疏水序列之前是一段信号肽，表明它被运输到内质网的腔面，信号肽之后的序列具有典型的枯草杆菌 S e r 蛋白酶的特征。枯草杆菌类蛋白酶是一类 S e r 蛋白酶，它的催化位点有三个保守的氨基酸 S e r、A s p、H i s 和远端的 A s n 组成。虽然其它的 S e r 蛋白酶和类胰蛋白酶的活性中性也有这三个保守的氨基酸，但认为枯草杆菌类蛋白酶是独立进化而来的。从大肠杆菌到人的各种细胞中都发现含有枯草杆菌类蛋白酶，哺乳动物细胞中已发现的枯草杆菌类蛋白酶有激素原转化酶，这些酶在与分泌相关的细胞器的腔中发挥作用，在那儿，它们裂解产生膜结合的蛋白或分泌蛋白（比如，i n s u l i np r o-r e c e p t o r,p r o-v o nWi l l e b r a n df a c t o r,和 p r o o p i o m e l a n o c o r t i n），转化酶识别的氨基酸序列一般为 R X(R/K)R 3 3,3 4。原核的枯草杆菌类蛋白酶如 B a c i l l u s l e n t u s 的 S a v i n a s e，它在疏水氨基酸残基后水解，而不要求任何碱性氨基酸。哺乳动物 S 1 P的催化结构域更象细菌的 S a v i n a s e，S 1 P也是在疏水氨基酸之后裂解 S R E B P 的。人 S 1 P 的序列首先由日本的一个研究小组随机测定人骨髓细胞 c D N A文库而发现，通过序列分析认为这是一个枯草杆菌类蛋白酶，但并没有实验证据，也不知其生理功能 3 5。随后，仓鼠的 S 1 P、大鼠和小鼠的同源基因（命名为 S K I-1）也被克隆 3 6。N o r t h e r nB l o t 实验表明 S 1 P 在 C H O细胞和 1 5 种检测的人组织中表达，而未在 S R D-1 2 B细胞中检测到。S o u t h e r nB l o t 发现 S R D-1 2 B中的一个 S 1 P 基因拷贝发生了 D N A重组，另一拷贝的酶谱正常，但推测可能有其它形式的突变以至不能产生可检测到的 m R N A。当把编码 S 1 P 的质粒导入 S R D-1 2 B细胞后，其甾醇调控的 S R E B P-1 和 S R E B P-2 在位点 1 的裂解能力就被恢复，细胞因此能够自己合成胆固醇，各种营养缺陷特征消除。而当上述的三个氨基酸残基突变的S 1 P 导入细胞后，不能使细胞恢复，进一步支持该蛋白是一 S e r 蛋白酶，S e i d a h等发现高表达 S 1 P（或 S K I-1）的细胞能在 R G L T S 的 T h r 后裂解原脑来源的神经营养因子。细胞组分分级实