虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较.pdf

食用菌学报?2007.14(3):62 66收稿日期:2007-08-10原稿;2007-08-27 修改稿基金项目:福建省自然科学基金项目?虎奶菇抑菌活性物质的研究?(B0310024)和福建省财政专项?福建省农业科学科技创新团队建设基金?(ST IF-Y01)的部分研究内容作者简介:林陈强(1979-),男,2002年毕业于中国农业大学食品学院食品科学与工程专业,学士,研实,主要从事食用菌活性成分研究,发表主笔论文 2 篇。*本文通讯作者文章编号:1005-9873(2007)03-0062-05虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较林陈强,林戎斌,蔡海松,郑永标,林新坚,陈济琛*(福建省农业科学院土壤肥料研究所,福州 350013)摘?要:分别以几种细菌、酵母菌和霉菌为指示菌,比较了虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物与苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和钠他霉素等几种食品防腐剂的抑菌能力。结果表明,虎奶菇发酵液的乙酸乙酯提取物对几种细菌指示菌均有较好抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌(Stap hylococcus aureus),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),大肠杆菌(Escherichia coli),蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和肠 炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)的抑制效果都显著高于其它防腐剂;对白色念珠菌(Candida albicans)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的抑制作用仅次于钠他霉素;对黄曲霉(A spergillus f lavus)和黑曲霉(A spergillusniger)的抑制效果较差;对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和绿浓杆菌的最小抑菌 浓度 分别为 1.250 mg/mL、1.250 mg/mL、2.500 mg/mL、5.000 mg/mL、5.000 mg/mL和10.000 mg/mL。关键词:液体发酵;乙酸乙酯提取物;抑菌中图分类号:S646.140.1;TS201.6?文献标识码:A?虎奶菇 Pleurotus tuber-regium(Fr.)Sing隶属担子菌亚门层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属,是一种产于亚洲热带地区的珍稀药用菌,在中国主要 分布于 云南省 的腾 冲章 凤等地 1。虎奶菇菌丝及其发酵液具有抑菌活性,特别是对一些革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用 2,3。苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和纳他霉素等都是目前比较常用的食品防腐剂,它们的抑菌谱较广并对多数腐败菌具有抑制作用 4。我们用平板打孔法比较虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物与苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和纳他霉素的抑菌能力,为开发虎奶菇抑菌物质作为生物防腐剂提供参考依据。现将试验结果报道如下。1?材料与方法1.1 菌种?虎奶菇(Pleurotus tuber-regium),引自福建三明真菌研究所。1.2 指示菌?细菌:金 黄色葡 萄球 菌(Staphylococcusaureus),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),大肠杆菌(Escherichia coli),蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus),肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis),绿浓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。酵母菌:白色念珠菌(Candida albicans),啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。霉菌:黑曲霉(Asp ergillus niger),黄曲霉(A spergillus f lavus)。以上菌种由福建省疾病预防控制中心和福建师范大学提供。1.3 培养基?液体菌种培养基:黄豆粉 10 g,葡萄糖 20 g,蒸馏水 1000 mL,pH 自然。液体发酵培养基:黄豆粉 15 g,甘露醇 25 g,蒸馏水 1000 mL,pH 自然。PDA 斜面培养基:马铃薯 200 g,葡 萄糖第 3 期林陈强,等:虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较20 g,琼脂 20 g,蒸馏水 1000 mL,pH7.0。牛肉膏-蛋白胨斜面培养基:牛肉膏 5 g,NaCl 5 g,蛋白胨 10 g,蒸馏水 1000 mL,pH7.2。水琼脂培养基:琼脂 20 g,蒸馏水 1000 mL,pH7.0。1.4 实验方法1.4.1 虎奶菇液体菌种制备250 mL 三角瓶装 100 mL 液体菌种培养基,高压湿热灭菌(0.1 MPa,121?,20 min),接斜面菌种(1 cm?1 cm)两块,160 r/min 摇床 30?培养 7 d。无菌条件下取菌球,用研钵磨碎,加入含有玻璃珠的无菌水60 mL震荡,使其在无菌水中均匀分布,制成液体菌种。1.4.2 虎奶菇发酵液制备 3,5250 mL 三角瓶每瓶装 80 mL 液体发酵培养基,0.1 MPa,121?灭菌 20 min;接入液体菌种,接种量 VV=1?100,160 r/min 摇床 30?培养 6 d,发酵液过 60 目筛,5000 r/min 离心,取上清液备用。1.4.3 样品制备发酵液乙酸乙酯提取物:上清液 65?真空浓缩至原体积的 1/3,5000 r/min 离心,取上清液,用乙酸乙脂萃取 4 次,酯相减压浓缩至恒重作为提取物?,用 25%甲醇稀释至 5 mg/mL;不接菌种的液体培养基用乙酸乙酯萃取 4 次,酯相减压浓缩至恒重,作为提取物?,用 25%甲醇稀释至5 mg/mL。以 25%甲醇溶液为空白对照(Control)。苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和纳他霉素用 25%甲醇分别稀释到5 mg/mL,苯甲酸钠和山梨酸钾溶液 pH 调节为4 5,其它防腐剂的 pH 自然。1.4.4 指示菌悬液制备牛肉膏-蛋白胨培养基斜面划线接种各种指示菌,置 37?恒温培养 24 h 后,取 2 环接至45 mL无菌水中振荡均匀备用。1.4.5 抑菌活性的测定水琼脂培养基溶化倒入直径为 15 cm 的培养皿,每皿 120 mL。凝固后倒入 50 mL 牛肉膏-蛋白胨培养基覆盖(霉菌及酵母指示菌倒入50 mLPDA 培养基覆盖),凝固后吸 0.4 mL 指示菌液 均 匀 涂 布 于 培 养 基 表 面。打 孔(D=0.9 cm),加入待测样品 0.6 mL,样品浓度为5 mg/mL,细菌于 37?恒温培养 24 h,霉菌及酵母菌于 26?培养 48 h。试验重复 4 次,测定抑菌圈直径,比较抑菌活性。1.4.6 发酵液乙酸乙脂提取物对几种指示菌的最小抑菌浓度取一列洁净无菌的小试管,分别加牛肉膏-蛋白胨液体培养基 4 mL,第 1 管加入 4 mL 浓度为20 mg/mL 的乙酸乙酯提取物溶液(提取物用25%的甲醇溶解后定容至 20 mg/mL),振荡均匀后吸出 4 mL 至第二管,依次至最后一管吸取4 mL弃去(各管乙酸乙酯提取物的浓度分别为10.000 mg/mL,5.000 mg/mL,2.500 mg/mL,1.250 mg/mL,0.625 mg/mL 和 0.313 mg/mL),再分别加入 106 cuf/mL 指示菌菌悬液(血球板计数)0.4 mL,摇匀,置 37?培养箱中培养 24 h,观察结果。2?结果与分析2.1 抑菌物质对各种指示菌的抑菌能力2.1.1 不同抑菌物质对细菌的抑制能力从表 1 可以看出,虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑制能力显著高于其他几种抑菌物质。其中对金色葡萄球菌的抑制效果约为乳酸链球菌和苯甲酸的 2 倍;对绿浓杆菌的抑制效果弱于苯甲酸,但优于其他抑菌物质。2.1.2 不同抑菌物质对酵母菌和霉菌的抑制能力从表 2 可以看出,虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物对白色链珠菌和啤酒酵母的抑制作用次于钠他霉素,但显著高于苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠和山梨酸钾;对黄曲霉和黑曲霉的抑制效果不如钠他霉素、苯甲酸和山梨酸,但优于山梨酸钾和苯甲酸钠。2.2 发酵液乙酸乙脂提取物对细菌的最小抑菌浓度?表 3 表明,虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和绿浓杆菌的最小抑菌浓度分别为 1.250 mg/mL、1.250 mg/mL、2.500 mg/mL、5.000 mg/mL、5.000 mg/mL 和10.000 mg/mL。63食?用?菌?学?报第 14 卷表 1?不同抑菌物质对细菌的抑菌能力Table 1?Inhibition of bacterial indicator strains by different antimicrobial substances抑菌物质Antimicrobial substance抑菌圈直径Diameter of inhibitionzone(mm)差异显著性Significance level0.050.01抑菌圈直径Diameter of inhibitionzone(mm)差异显著性Significance level0.050.01金黄色葡萄球菌 S.aureus枯草芽孢杆菌 B.subtilis?对照 Control0dD0fD提取物?Extract?0dD0fD提取物?Extract?51.5?1.25aA39.4?0.84aA乳酸链球菌素 Nisin25.5?0.48bB24.2?0.80bB苯甲酸 Benzoic acid23.1?0.47bB22.2?0.76cB山梨酸 Sorbic acid13.3?2.10cC15.6?0.58dC苯甲酸钠 Sodium benzoate0dD0fD山梨酸钾 Potassium sorbate0dD13.5?0.21eC蜡样芽孢杆菌 B.cereus大肠杆菌 E.coli?对照 Control0eE0dD提取物?Extract?0eE0dD提取物?Extract?39.4?1.31aA37.9?1.56aA乳酸链球菌素 Nisin18.7?0.45cC11.8?1.08cC苯甲酸 Benzoic acid25.4?1.45bB18.8?2.04bB山梨酸 Sorbic acid19.2?1.82cC13.6?1.37cC苯甲酸钠 Sodium benzoate12.8?1.06dD0dD山梨酸钾 Potassium sorbate15.9?1.31cdCD0dD肠炎沙门氏菌 S.enteritidis绿浓杆菌 P.aeruginosa?对照 Control0dD0ED提取物?Extract?0dD0ED?36.9?0.85aA14.5?0.74BB乳酸链球菌素 Nisin11.5?1.50cC0ED苯甲酸 Benzoic acid22.4?2.26bB17.6?1.15aA山梨酸 Sorbic acid15.2?2.25cC13.1?0.49CB苯甲酸钠 Sodium benzoate0dD0ED山梨酸钾 Potassium sorbate0dD11.0?1.14DC数据为 4 次重复的平均值 Values are the mean?SD of 4 replicates表 2?不同抑菌物质对酵母菌和霉菌的抑菌能力Table 2?Inhibition of fungal indicator strains by different antimicrobial substances抑菌物质Antimicrobial substance抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)差异显著性Significance level0.050.01抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)差异显著性Significance level0.050.01白色念珠菌 C.albicans啤酒酵母 S.cerevisiae?对照 Control0eE0dD提取物?Extract?0eE0dD提取物?Extract?27.9?1.04bB30.4?0.24bB纳他霉素 Natamycin34.7?0.41aA38.8?0.62aA苯甲酸 Benzoic acid17.1?0.20cC17.8?0.20cC山梨酸 Sorbic acid16.0?0.39cdCD0dD苯甲酸钠 Sodium benzoate0eE0dD山梨酸钾 Potassium sorbate14.7?0.36dD0dD黄曲霉 A.f lavus黑曲霉 A.niger?对照 Control0eD0fE提取物?Extract?0eD0fE提取物?Extract?19.9?0.38cBC13.5?0.6eD纳他霉素 Natamycin34.7?0.99aA47.0?0.42aA苯甲酸 Benzoic acid20.3?1.03bcB19.8?0.61bB山梨酸 Sorbic acid22.5?1.25bB17.7?0.49cC苯甲酸钠 Sodium benzoate0eD0fE山梨酸钾 Potassium sorbate17.0?0.45dC16.1?0.19dC数据为 4 次重复的平均值 Values are the mean?SD of 4 replicates64第 3 期林陈强,等:虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较表 3?发酵液乙酸乙酯提取物对细菌的最小抑菌浓度Table 3?Minimum inhibiting concentration(MIC)of ethyl acetate extracts for bacterial indicator strains最小抑菌浓度 MIC(mg/mL)10.0005.0002.5001.2500.6250.313金黄色葡萄球菌 S.aureus-1)-+2)+枯草芽孢杆菌 B.subtilis-+蜡样芽孢杆菌 B.cereus-+大肠杆菌 E.coli-+肠炎沙门氏菌 S.enteritidis-+绿浓杆菌 P.aeruginosa-+1)?-?表示试管澄清?-?bacterial growth was inhibited as indicated by the absence of turbidity in the culture medium2)?+?表示试管混浊?+?bacterial growth was evident as indicated by the presence of turbidity in the culture medium3?讨论?虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物对所提供的指示菌均有抑制作用,其中对细菌指示菌的抑制效果显著优于其它几种食品防腐剂;对白色念珠菌和啤酒酵母菌的抑制能力弱于钠他霉素,但优于其它几种食品防腐剂;对黄曲霉和黑曲霉的抑制效果不如钠他霉素和苯甲酸。我们以虎奶菇发酵后原液进行抑菌试验,并未检测出对霉菌和酵母有抑制作用 3,进一步的试验发现发酵液乙酸乙酯提取物对霉菌、酵母有抑制作用,这可能是因为发酵原液中所含抑菌物质浓度较低。我们分别以石油醚、氯仿乙酸乙酯对发酵液进行萃取,发现乙酸乙酯提取物抑菌效果最好,推测该抑菌物质为极性较大的小分子类化合物。虎奶菇发酵液中抑菌物质抑菌谱较广,并且具有选择性,但其抑菌机理还有待进一步研究。我们还研究了虎奶菇发酵液乙酸乙酯提取物对几种常见细菌的最小抑菌浓度,这为进一步提取纯化虎奶菇发酵液的抑菌成分并进行化学分析和开发为生物防腐剂提供重要的实用价值。参考文献1 黄年来,郭美英,黄黎红.虎奶菇及其栽培 J.中国食用菌,1997,16(1):13-14.2 陈济琛,林戎斌,郑永标,等.虎奶菇菌丝生长的氮源和碳源筛选及其抑菌作用 J.福建农林大学学报(自然科学版),2005,34(3):373-375.3 林戎斌,蔡海松,林陈强,等.培养成分对虎奶菇发酵液抑菌作用的影响 J.中国食用菌,2006,25(4):46-48.4 蔡海松,林戎斌,林陈强,等.发酵条件对虎奶菇发酵液抑菌活性的影响 J.食用菌学报,2006,13(4):74-80.5 孙?平.食品添加剂使用手册 M.北京:化学化工出版社,2004:6-38.本文编辑?朱丽娜Ant-i microbial Activity of Ethyl Acetate Extracts ofPleurotus tuber-regium Spent Culture LiquidLIN Chenqiang,LIN Rongbin,CAI Haisong,Z HENG Yongbiao,LIN Xinjian,CHEN Jichen*(Soil and Fertilizer Institute,Fujian Academy of Agricultual Sciences,Fuzhou,Fujian 350013,China)Abstract:The ant-i microbial activity of ethyl acetate extracts of Pleurotus tuber-regium spent culture liquidwas determined and compared with several recognized food preservatives(sorbic acid,benzoic acid,sodiumbenzoate,potassium sorbate,nisin and natamycin)using several bacteria and fungi as indicators.Ethylacetate extracts inhibited the growth of Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Escherichia coli,Bacillus65食?用?菌?学?报第 14 卷cereus and Salmonella enteritidis more strongly,but exhibited relatively weaker inhibiting capacity towardsAspergillus niger and Aspergillus flavus,compared with the tested food preservatives.Ethyl acetate extractswere less effective than natamycin in inhibiting the growth of Candida albicans and Saccharomyces cerevisiaebut more effective compared with the other tested food preservatives.M inimum inhibiting concentrations(M IC)of ethyl acetate extracts for S.aureus,B.subtilis,E.coli,B.cereus,S.enteritidis and P.aeruginosa were 1.25 mg/mL,1.25 mg/mL,2.50 mg/mL,5.00 mg/mL,5.00 mg/mL,and 10.00 mg/mL,respectively.Key words:Liquid fermentation;Ethyl acetate extraction;Bacteriostasis欢迎订阅 2008 年?食用菌学报?食用菌学报?系由国家科委批准,全国公开发行的学术类刊物。主要为食用菌教学和科研人员、生产单位的技术人员及供销外贸系统和领导机关的专业干部提供食药用菌遗传育种、种质资源、设施栽培、菇房管理、病虫防治、生理生化及产后加工等方面的最新研究成果。2008 年?食用菌学报?为 A4 版,90 页,中英文对照,每期定价 15 元,全年订价 82 元(含挂号邮寄费)。自办发行。欢迎读者直接向本编辑部订阅。汇款地址:上海市南华街 25 号?上海市农业科学院?食用菌学报?编辑部邮政编码:201106开户银行:农行长宁支行北新泾所账?号:033283-00873001146户?名:上海市农业科学院食用菌研究所电?话:[phone]E-mail:xx8 或 shiyongjunxuebao ?食用菌学报?编辑部66