深层发酵中丝状真菌菌球形态控制的策略.pdf

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期G-75 分离后得到单一的蛋白条带，所以用此方法可以得到纯度比较高的-呋喃果糖苷酶。提纯后比活提高了 24.93 倍，回收率为 47.35%。参考文献：1张宁,曹劲松,彭志英.液 液双相体系中 D 呋喃果糖苷酶催化转移反应的特性J.食品与发酵工业,2001,27(9)2朱桂兰,童群义.节杆菌-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究J.食品科学,2004,25(12)3蒋世琼.功能食品配料低聚乳果糖J.中国食品添加剂,2000,(3)徐晴1，黄和1,2*，李霜1,2，张昆1，付永前1，何皓1，高振1(1.南京工业大学制药与生命科学学院，南京 210009；2.江苏省工业生物技术创新中心，南京 211816)摘要：丝状真菌在工业化生产中应用十分广泛，其在发酵过程中一般存在球状、絮状、团块状 3种形态，不同代谢产物所适宜的形态不同，在不同形态下，代谢产物的积累差异明显，球状菌体因能够降低发酵液黏度，改善传质、传氧性能，为许多产品生产的首选形态。菌球的形成不但与菌种特性有关，而且受诸多环境因素的影响，如 pH、接种孢子、培养基成分、搅拌等，故控制反应条件获得理想的菌球形态是许多丝状真菌发酵过程中的重要工作。关键词：丝状真菌；菌球；形态代谢产物中图分类号：Q 939.11文献标志码：A文章编号：1005-9989(2009)02-0013-05深层发酵中丝状真菌菌球形态控制的策略Strategy of pellet formation of filamentous fungi in submergefermentationXU Qing1,HUANG He1,2*,LI Shuang1,2,ZHANG Kun1,FU Yong-qian1,HE Hao1,GAO Zhen1(1.College of Life Science and Pharmacy,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009;2.Jiangsu Provincial Innovation Center for Industrial Biotechnology,Nanjing 211816)Abstract:Filamentous fungal fermentation is widely used in industry.Fungi can be grown into three differentmorphological forms when in submerged cultures:pellets,filaments,clump.The products might be wildlydifferent under different morphologies.Due to the low viscosities and enhanced mass and oxygen transfer,thepellet growth becomes the desirable morphology in fungal production.Pellet formation was influenced not onlyby the properties of strains but also by many environmental factors,such as pH,inoculum,medium compositionand agitation speed and so on.Therefore,optimizing the culture condition for pellet growth is of great收稿日期：2008-06-01*通讯作者基金项目：国家自然科学基金项目(20576054,20706031)；863 计划项目(2006AA02Z2400)；973 计划项目(2007CB707805)。作者简介：徐晴(1983)，女，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向为工业微生物及代谢工程。!生物工程13FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技丝状真菌在工业化生产中有着广泛的应用，如乳酸、柠檬酸、富马酸等有机酸的发酵，脂肪酶、蛋白酶等酶制剂的生产及青霉素、头孢菌素等抗生素的制备。深层发酵中丝状真菌菌体通常存在 3 种形态：团块状、絮状和球状(图 1)。目前利用丝状真菌深层发酵生产有机酸、酶制剂等多选用球状菌体，如 Aspergillus niger 产柠檬酸、Aspergillus terreus 产衣康酸、Rhizopus sp.产乳酸等。而此类丝状真菌在深层发酵过程中菌球形态及大小的控制对发酵产量具有重要的影响，因此，对丝状真菌菌球形态控制策略进行细致的总结和整理对指导丝状真菌的工业化发酵应用具有重要意义。已有的关于丝状真菌菌体形态综述性报道主要针对发酵过程中菌体形态的图像分析、菌体形态对发酵过程的影响，针对丝状真菌的发酵罐设计以及针对个别丝状真菌展开讨论，如黑曲霉的菌体形态调控，尚缺乏对影响丝状真菌菌球形态各因素综合性分析及调控策略的探讨。本文重点针对丝状真菌菌球形态控制的常用措施如培养基 pH、接种孢子、培养基成分、搅拌控制等对菌球形态影响最显著的几方面展开综述，探讨丝状真菌形态控制的常用策略，为丝状真菌菌球形态控制及优化提供指导。1不同菌体形态与代谢产物的关系团块状的菌体形态在发酵过程中接种量难于控制，且极大地限制了菌体内部的传氧、传质，产物产量明显偏低，一般不选用；絮状菌体营养物质和氧气在其内部传输较为顺利，但其能增加发酵液黏度，形成假塑型流体，降低物质、氧气在发酵液中的传递效率，同时还极易缠绕搅拌桨，使发酵产物产量、发酵罐性能降低；球状形态可以克服以上不足，改善发酵液的流变特性，有效提高传质、传氧性能，降低能耗。但若菌球过大，菌球内部传质、传氧将发生困难，影响产物积累1。不同的菌株积累代谢产物的最佳形态各异(表1)。如 Aspergillus niger 在絮状形态下蛋白酶产量可超过 350 U/g而在球状形态下，产量不超过150 U/g2；里氏木霉合成组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)时，菌体若以松散菌丝体生长，形成纸浆状较黏稠的发酵液，往往有较高的t-PA 产生，若以菌球生长，则培养液较清，产生的 t-PA 酶活力也较低3。但多数酶、有机酸等代谢产物的积累仍需要在球状形态下进行：Aspergillus niger 生产聚半乳糖醛酸苷酶时，菌球越致密，聚半乳糖醛酸苷酶合成量越多，与絮状相比，其增量可达 2 个数量级4。此外，Rhizopus oryzae 产富马酸、Rhizopusarrhizus 产乳酸、Aspergillus terreus 产衣康酸等均选用球状菌体。不同菌株积累同一代谢产物有时形态也各异：Aspergillus niger 积累葡萄糖淀粉酶的最佳菌体形态为球状；而 Aspergillus awamori 在絮状时积累葡萄糖淀粉酶，菌球的存在会使酶的生成受抑制。同种的不同菌株在积累不同代谢产物时所需的最佳菌体形态也存在差异：Aspergillusniger 积累柠檬酸的以球状为佳，而积累淀粉酶以絮状为宜。2菌球的分类及其大小对产物产量的影响对多数代谢产物而言，菌球是其积累的最佳形态，但不同菌球间存在结构与大小的差异，且不同的菌球结构及大小对代谢产物的生成具有不同程度的影响。Takahashi 和 Yamada5按菌球的形成过程，将a.球状b.絮状c.团状图 1丝状真菌培养过程中的不同形态表 1菌体形态与代谢产物关系菌种产物形态Rhizopus oryzae富马酸、乳酸球状Rhizopus arrizhus乳酸球状Rhizopus arrhizus富马酸絮状Aspergillus niger柠檬酸、聚半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶球状Aspergillus niger蛋白酶、淀粉酶絮状Trichoderma reesei纤溶酶原激活剂絮状Aspergullus awamori葡萄糖淀粉酶絮状Aspergillus terreusPenicillium chrysogenum衣康酸青霉素球状球状significance to the fungal fermentation.Key words:filamentous fungal;morphology;metabolite production生物工程14FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期丝状真菌菌球分为 2 类：a 凝聚型，b 非凝聚型。凝聚型是指在孢子萌发初期，孢子间开始凝聚，最终形成的菌球由多个孢子凝结而成。非凝聚型指由 1 个孢子萌发而成的菌球，此类菌株当接种孢子数较少时，菌丝自身发生缠绕形成菌球，即 1个孢子生成 1 个菌球体；但当接种量较大时，菌丝重复分枝伸长，交织成网眼状，不能获得菌球，呈菌丝状生长。菌球属于凝聚型或非凝聚型很大程度上取决于菌种的特性。如 Aspergillus niger 的菌球形成过程为凝聚型，有报道称 Aspergillus niger 发酵过程中 500 个孢子形成了一个菌球，且菌球数目随接种孢子数的增加而增加(表 2)；而 Penicilium chry-sogenum 为非凝聚型，但与 Penicilium chrysogenum同一属的菌种仍有可能为凝聚型5。按菌球结构，一般可将其分为 3 类：(1)松散型，该类菌球中心菌丝致密，而边缘较为松散；(2)规整光滑型，该类菌球的中心和边缘均完整，菌球表面光滑；(3)中空型，由于菌球过大，菌球内部营养缺乏，中心发生自溶，形成空洞而出现的一种菌球。控制不同的培养条件可以获得大小不同的菌球，不同直径的菌球对发酵产物产量具有一定影响：菌球直径过大，物质、氧气的传输遇到困难，难以到达菌球中心，易形成中空型菌球，影响菌体的正常代谢及目标产物的合成。如 Aspergillusniger 菌球的大小对其发酵生产柠檬酸、衣康酸、多聚半乳糖苷酶均具有显著影响6。Bai Dongmei报道 Rhizopus oryzae R1021 积累乳酸的最佳菌球直径为 1.4 mm，大于该直径，乳酸产量降低7；Zhou Ying 认为当 Rhizopus oryzae ATCC20344 在发酵罐中菌球直径小于 0.43 mm 时，最有利于富马酸的生成8。故对菌球大小的调控也是真菌形态控制的重要组成。3影响菌球形成及其特性的因素环境是影响菌球形成的一重要因素，不同环境条件下获得的菌球结构及大小各异。影响菌球形成及特性的因素一般有 pH、接种孢子、培养基成分、搅拌转速等，通过对这些因素的调控可以获得产物积累的最佳形态。3.1pHpH 是影响菌体形态的重要因素，有文献报道pH 对菌体形态的影响主要有两个方面：一方面为间接性的，表现为影响溶液中 H+浓度，不同的 H+梯度下营养物质的溶解性能、传递特性以及酶的表面结构及反应活性都会发生改变；另一方面为改变接种孢子的表面特性，影响其凝聚。不同菌株在不同 pH 条件下表现不同：Carlsen9对 Aspergillus oryzae 的研究发现，当 pH 低于 2.5 时，菌体的生长十分缓慢，受到一定程度的抑制；pH3.03.5 时形成松散絮状菌丝体；pH4.04.5 时为絮状与菌球的混合；pH 大于 6.0 时，菌球形成，且菌球的大小随 pH 的增大而增大。江洁等研究认为培养基初始 pH 影响菌体的生长状态，当 pH5.4 时，菌体呈球状生长，且随着初始 pH 值的升高，菌球直径变大，菌球数量减少；当 pH5.4时，菌体呈丝状生长，无菌球出现3。同一菌种不同菌株形成菌球的 pH 也有差别，Zhou Ying8对Rhizopus oryzae ATCC20344 研究发现，菌球形成的 pH 范围为 3.362.60，pH 为 5.59 时菌体形成团状，pH 小于 2.5 时，孢子不能够萌发。WeiLiao10对 Rhizopus oryzae NRRL395 研究认为该菌株对 pH 不敏感，在 3.07.0 间均可形成菌球。3.2接种孢子接种孢子对菌体形态的影响主要有两方面：孢子量及孢子保藏时间。孢子量是决定菌体形态的重要因素。低孢子浓度，菌丝体间的凝结受到限制，形成较小的菌球，而高孢子浓度菌丝间易发生缠绕，形成絮状及团状形态。所以，普遍认为低孢子浓度利于菌球的形成。但不同的菌种形成菌球所对应的最大孢子浓度不同。据报道，Rhizopus sp.菌属菌球形成的孢子液浓度较低(3109cfu/L)。在形成菌球的孢子浓度范围内，菌球的数量和直径与浓度的大小密切相关，随着孢子浓度的增加，菌球数目增加，菌球直径减小。Bai Daidongmei7在 Rhizopus oryzae发酵乳酸过程中发现，当孢子液浓度从 9108cfu/L 增大至 8109cfu/L，菌球直径从 2.2 mm 减小至 0.7 mm。WeiLiao10对 Rhizopus oryzae ATCC20344 的研究表明，当孢子悬浮液浓度由 1.5108cfu/L 增至 1.5109cfu/L，菌球直径由 4.5 mm 降至 2.3 mm，菌球数目表 2A.niger 培养过程中接种量对形成菌球孢子数的影响接种孢子浓度/(cfu/m3)孢子个数/菌球2.51091252.71012750生物工程15FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技由 2104cfu/L 增大至 8104cfu/L 以上。关于孢子悬浮液保藏时间与菌球形成的研究相对较少。Yan Liu12通过长期实践发现，短暂的孢子悬浮液保藏时间不利于菌球的形成随着保藏时间的增长，形成菌球的几率增大，且孢子的活力并未因保藏时间的增加而减小，以 4 贮存了 1.5 年的孢子进行接种，菌体生长状况良好，仍然能够形成理想菌球。Yan Liu 认为新鲜孢子液形成菌球概率较低的原因可能是：新制的孢子悬浮液中孢子萌发的菌丝处于活跃状态，从而导致絮状菌体的形成；而长期贮存的孢子液中菌丝的活力已经减退，溶液中只存在孢子，当接入新鲜培养基时更易形成菌球。3.3培养基组成培养基组成是菌体形态的又一重要影响因素，微生物培养基的基础组成有碳氮源、微量元素等，有时还需外源添加诸如聚合物等其他物质。碳氮源种类对菌体形态有一定作用，Z.Y.Zhang13考察葡萄糖、土豆淀粉对菌体形态影响时发现，以土豆淀粉为碳源，Rhizopus arrhizus 易形成分散、细小菌球，而以葡萄糖为碳源，形成较大的致密菌球；Wei Liao10等对 Rhizopus oryzaeATCC 20344 研究发现，以马铃薯葡萄糖培养基为碳源，蛋白胨为氮源更易形成规整、细小的菌球。潘进权等认为玉米淀粉较葡萄糖、蔗糖更有利于雅致放线毛霉 AS3-2778 菌丝的分散，形成菌球，且玉米淀粉浓度对菌球的形成也存在一定影响，3%条件下菌球形态最好14。不同氮源条件也影响着菌球的形成，Rhizopus nigricans 在高氮源浓度下形成高度致密的菌球，而低氮源浓度，易形成细小、松散菌球，并在培养过程中容易交联，形成团状。一般来说，菌种利用有机氮源时吸收较慢，更能促进菌体生长，易形成大的菌团，而无机氮源则更利于菌球的形成14。微量元素如 Mg2+、Zn2+、K+、Na+、PO2-4等，虽然在种子培养基中的用量相对微小，但对菌球的形成同样具有重要作用。Rhizopus oryzae SOI106-3培养过程中，K+浓度小于 0.5 mg/L 时菌体不能够存活，2 mg/L 是其生长的较佳浓度，且只有当Na+K+为 15 时，才能够形成细小菌球，直径约 1.2mm15。Zhou Ying 认为，当培养基中不存在 Mg2+时，孢子不能够萌发，不存在 Zn2+时，不能形成菌球，高浓度的 Mg2低浓度的 Zn2+更有利于形成细小、规整、分散的菌球8。D Siedenberg 报道Aspergillus awamori 形成菌球需要 PO2-4的参与，且低 PO2-4浓度下形成直径约 6 mm 的松散菌球，高PO2-4浓度下形成 7mm 的中空型菌球16。表面活性剂等聚合物的添加也常作为控制菌体形态的重要手段。培养基中加入 Triton N-101或吐温 80 能够促进孢子间的凝聚，利于菌球的形成，同时对菌球结构及其生物量也存在一定的影响。Znidarsic P.报道在 A.niger 培养过程中添加Tween-80，形成松散菌球，菌球直径及生物量略有增大，原因可能是 Tween-80 的添加促进了细胞的渗透，有助于营养物质进入菌体内部11。但并不是所有的聚合物都利于菌球形成，如聚羧乙烯-934、聚丙乙烯、聚丙稀酸钠等的添加将减少孢子的凝聚，从而降低菌球形成的概率。微电泳分析表明，此类聚合物附着于孢子表面，削弱了孢子间因静电作用而产生的聚合，也有研究者认为聚合物是通过阻遏培养基中的阳离子，而阻碍了孢子间盐桥的形成，使孢子无法凝聚。3.4搅拌搅拌是培养过程中的一个重要参数，搅拌转速的高低不但影响培养基的混合效果及物质、能量的传递效应，而且对菌球形成及结构也存在一定的影响。剧烈的搅拌转速不利于菌球形成，Gomez 报道在高搅拌转速下(1000 r/min)，Asperg-illus niger 产柠檬酸过程中形成细小、结实的菌球，而搅拌转速较低时(450 r/min)，则形成絮状菌体与松散菌球的混合17。某些条件下菌球的直径与搅拌转速相关联，搅拌转速越高，直径越小，菌球越致密。P Znidarsic 报道 Rhizopus niger 种子培养过程中，转速升高，菌球数目增多，菌球直径减小，当转速为 150 r/min 时，菌球直径约2.3 mm，转速为225 r/min，菌球直径约 2.1 mm11。Carlsen 认为高转速下菌球易被打碎，形成次级菌球，但 Cui 认为高的搅拌转速并没有打碎菌球；而是产生的较大剪切力去除了菌丝突出部分，限制菌丝的伸长，从而限制菌球直径增大，目前普遍认同后一种看法18。从另一个角度，发酵罐的类型及大小对菌体形态及结构也存在一定程度的影响，采用气生式发酵罐培养 Armillaria mellea 时，形成松散菌球，采用搅拌罐培养时，形成致密菌球19；采用 100 L搅拌式发酵罐获得的菌球直径较大，而 2 L 搅拌式发酵罐相对较小。产黄青霉在中试罐和发酵罐中进行青霉素发酵时，两者的菌体形态差异显著，中试罐中有 1/3 至 1/2 的菌体以菌球存在，而生产罐中菌生物工程16FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期球至多只占菌体总浓度的 1/4，且菌球直径较小20。究其原因，不同的搅拌形式导致了发酵罐剪切环境的差异，且即使采用相同搅拌形式，设备放大后剪切环境也会发生变化，不同的剪切应力造成了菌体形态、菌球大小及结构的差异。通气量是与搅拌相关联的 1 个参数，其对菌球的大小与结构有影响，但影响程度依菌种而异。Aspergillus niger 在搅拌转速较低，即溶氧量低的条件下形成不规则的菌球体，但增加通气量可弥补以上不足，而 Aspergillusawamori 对氧气则不敏感。4结论与展望综上所述，发酵过程中丝状真菌形态于产物积累至关重要，球状因能降低发酵液黏度，并利于传质、传氧，减少能耗，为许多产品发酵的首选形态。发酵培养中丝状真菌菌球的形成不但与菌种本身特性有关，且受 pH、接种量、搅拌、碳氮源、金属离子及外源聚合物的添加等外界环境因素影响，通过调控各种外部的条件可以获得最佳的菌球结构及菌球大小，促进发酵产物的生成。目前丝状真菌形态的控制已有不少成功的先例，且随着理论基础研究的不断深入，建立不同形态、不同培养条件下菌体的生长或产物生成数学模型，优化丝状真菌的发酵过程，将能为丝状真菌的工业化应用提供更为精确的指导。参考文献：1Schugerl K,Wittler R,Lorens T.The use of molds inpellet formationJ.Trends Biotechnol,1983,(1):1202Aftab Ahamed,Ajay Singh,Owen P Ward.Culture-basestrategies for reduction of protease actibity in filtrates fromAspergillus niger NRRL-3J.World Journal of Microbiology&Biotechnology,2005,21:1577-15833江洁,杜连祥,路福平,等.培养条件对里氏木霉 306 菌体形态和t-PA生物合成的影响J.工业微生物,2005,35(4):9-144Maria Papagianni,Murray Moo-Young.Protease secretionin glucoamylase producer Aspergillus niger cultures fungalmorpHology and inoculum effectsJ.Process Biochemistry,2002,37:1271-12785B Metz,N W F Kossen.The growth of molds in the form ofpellets-a literature reviewJ.Biotechnology and Bioengineering,1977,XIX:781-7996S K Treskatis,V Orgeldinger,H Wolf,et al.MorpHological characterization of filamentous microorganisms in submerged cultures by on-line digital image analysis and pattern recognitionJ.Biotechnology and bioengineering,1997,53:191-2017Dongmei Bai,Minze Jia,Xueming Zhao.L-lactic acidproduct by pellet-form Rhizopus oryzae R1021 in a stirredtank fermentorJ.Chemical Engineering Science,2003,58:785-7918Ying Zhou.Fumaric acid fermentation by Rhizopus oryzaein submerged systemsD.Purdue University,19999Carlsen M,Spohr A B,Nielsen,et al.MorpHology andpHysiology of an -amylase producing strain of Aspergillus oryzae during batch 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