慢性疲劳综合征动物模型制作与检测_洪肖娟.pdf

慢性疲劳综合征动物模型制作与检测洪肖娟，吴曦，冉茜(成都中医药大学针灸推拿学院，四川 成都 610075)摘要:归纳总结国内外慢性疲劳综合征的动物造模方法以及造模后的行为学检测指标，推荐冷水游泳加慢性束缚造模法复合免疫诱导法，可能会是一种稳定、可靠且重复性好的 CFS 造模方法。关键词:慢性疲劳综合征;动物模型中图分类号:R332文献标识码:A文章编号:1000 1719(2011)04 0737 03Animal Model of Chronic Fatigue Syndrome and DetectionHONG Xiao-juan，WU Xi，RAN Qian(Acupuncture and Tuina College，Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，Sichuan，China)Abstract:This article summarizes chronic fatigue syndrome animal model and detection of behavioral indicators after models methods inChina and abroad，recommend swimming in cold water and chronic restraint modeling method combined immune method，may be a stable，reli-able，and reproducible CFS modeling methodKey words:chronic fatigue syndrome;animal model收稿日期:2010 07 11基金项目:国家自然科学基金项目(30801488)作者简介:洪肖娟(1984 )，女(回族)，四川成都人，硕士研究生，研究方向:针炙治疗心脑疾病。通讯作者:吴曦，女，博士，研究方向:针灸调整亚健康状态机理研究，E mail:wuxi403 hotmail com。慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是人群亚健康的主要表现形式之一。1988 年美国疾病控制与预防中心正式命名，并制定了相应的诊断标准1。随着社会高速发展，在快节奏的生活、高压力的工作环境中，临床上以慢性疲劳为主诉的患者日益增多。CFS 已成为当今不容忽视的威胁人类健康的重大问题，成为国内外医学家们关注和研究的热点。目前CFS 的病因尚不明确，多数学者认为 CFS 的产生可能与病毒感染、精神刺激、过敏、遗传，接触有毒化学物质及过度劳累等多种因素有关。动物实验作为研究 CFS病理机制的重要途径，动物模型制备成功与否对研究具有重大影响。迄今为止，CFS 动物造模的方法较多，但尚无经典、公认的造模方法，对这些方法进行综述、评价，寻找便于重复且造模效果好的方法，可为 CFS进一步的机制研究打下良好的基础。1造模方法1.1游泳法游泳法因具有较好的操作性、重复性以及良好的造模效果，得到了多数研究者的认可，是最常被运用的造模方法之一。短时间冷水游泳法2 3:使大鼠于每日的不同时间在水温为 10 左右的冷水中游泳，每次游泳持续 6 10min。这种造模方法主要从身体疲劳出发，制造了包括体力消耗刺激、寒冷环境的温度刺激和强制其冷水中游泳的精神刺激在内的多种应激因素4。还有研究者5 在每天的不同时间对大鼠进行造模，并改变每天造模持续时间，以减少其机体对应激的耐受。长时间常温游泳法:使大鼠每日在水温 20左右常温水中游泳每次 30min6 8。也有研究强制大鼠每日在 4冷水中游泳 30min9 10，把冷刺激和躯体疲劳都用到了比较大的强度，但动物长时间处于严酷环境中，造模死亡风险可能加大。以上各种游泳造模法，造模持续时间报道不一，从 7 21d 不等。还有研究11 采用了负重力竭游泳方法。国外部分研究12 14 采用了短时间常温游泳法:强制大鼠在室温(22 3)，体积为(25cm 12cm 25cm)水深 15cm 的水池中游泳，游泳持续 6min，造模过程总共持续 7 天。老鼠在最初的体力充沛的活动后就会出现一种典型的不动姿势，研究者通过每天测定在这 6min 内大鼠总共不动的时间，来判断造模成功与否。不动的标准是根据大鼠停止任何四肢挣扎运动，使其头部浮出水面来判断。不动时间的延长被认为和CFS 的情况类似。祖国医学认为，过劳是产生疲劳的一个重要因素。素问宣明五气篇 云:“久视伤血，久卧伤气，久坐伤肉，久立伤骨，久行伤筋，是谓五劳所伤。”游泳造模法正是运用这一理论，通过连续数天的强制游泳，劳伤大鼠的筋骨肌肉，造成其四肢倦怠，筋骨痿软。进而四肢劳倦影响脾胃运化功能，造成纳食减少，气血生化减少，机能下降进一步加重疲劳。而强制冷水刺激作为不良精神刺激，七情变动也是造成疲劳的因素之一。1.2慢性束缚法慢性束缚法是目前 CFS 应用较广的造模方法之一，主要是利用大鼠喜钻洞的特性将大鼠束缚在狭小的硬塑料特制筒腔内。每天在不同的时间开始对大鼠进行束缚，并调节到其不产生强烈反抗737辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 4 期的紧张程度，每次束缚 3h，共束缚 14d15。也有文献报道11 束缚时间每 3d 循序加量 1 次，时间分别为 1h、1 5h、2h、2 5h。慢性束缚主要通过使动物的躯体活动受限，使之产生挣扎、急躁、愤怒、绝望等心理及行为变化，产生慢性应激，导致大鼠躯体及精神疲劳的发生，与 CFS 发病的社会心理因素相似。每天造模时间的不固定则可减少机体对应激的耐受，增强效果。有研究报道16 慢性束缚可能是影响了海马中氨基酸递质的水平及比例，使中枢抑制占优势，使动物出现疲劳记忆力下降及抑郁倾向。从中医理论来看，肝主疏泄，慢性束缚造成其情志的抑郁，影响肝的疏泄功能，造成气血运行不畅，导致气滞血瘀，筋脉失养，运动不利。且肝的疏泄功能异常可影响脾的运化功能，使其神疲乏力，四肢倦怠。而束缚过程中动物肢体的挣扎可导致劳伤筋脉、肌肉，最终造成肝脾功能失调，导致慢性疲劳的发生。1.3电刺激法目前应用较多的电刺激法主要有电脉冲刺激和进食电刺激法。电脉冲刺激法17 是将大鼠束缚在固定器中，两足踝关节用等渗盐水浸湿，电疗带固定接电针仪，每次刺激 10min，2 次/d，共计 14 天。也有研究者18 将大鼠固定并给予不定时的电刺激 5 6 次，每次持续 30min，连续 14 天造成疲劳模型此外还有电刺激足底造模2。进食电刺激法19 20 则是每天定时喂养大鼠 2 次，每次动物进食时予金属棒敲打鼠笼半小时。电刺激法主要是通过电刺激为应激原，使动物躯体和情绪长期处于紧张状态，造成其应激疲劳。祖国医学认为肝脾功能失常与慢性疲劳的发生关系密切。进食时电刺激通过进食时刺激致其情志不畅，肝失疏泄进而影响脾的运化功能，造成动物进食减少或食而不能运化，造成其肝脾功能失调，导致疲劳。1.4跑台法跑台法是一种运动性疲劳造模法，主要造成动物的躯体疲劳。具体方法是在适应性训练几天后，每天逐步加快大鼠跑步速度和增长跑步的时间，直至动物力竭11。以大鼠不能继续跑动，下跑台后伏地喘息，暂时无逃避反应为力竭标准。1.5夹尾应激法夹尾应激法是对雄鼠进行激怒刺激，造成其“神劳”。每日下午随机用尖端缠有纱布的止血钳夹一只大鼠尾部，令其与其他大鼠撕打，以模仿人类生存环境不佳，竞争激烈，精神压力大的情况。夹尾时以不破皮、不流血为度，每次刺激 2h，连续 21天9。1.6免疫诱导法有些学者认为慢性疲劳综合征持续疲劳的发生并不是由于外周的一些因素如肌肉无力或肌肉关节疼痛，而是存在复杂的内在机制，如特定病毒性感染、免疫功能失调相关性感染等是造成 CFS 发病的关键因素21。研究者22 25 给大鼠注射棒状杆菌或纯化的脂多糖(LPS)或灭菌的布(鲁)氏杆菌(BA)抗原作为免疫原，或在大鼠腹膜内注射合成聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyI:C)26 引起急性免疫应答。其中BA 抗原或 polyI:C 诱导的疲劳模型持续时间较长，模型稳定，应用较多。Ottenweller27 最早运用静脉注射BA 抗原造模，其方法为每两周经由大鼠尾静脉注射BA 抗原原液两次，每次每只 0.2mL。但 Chen R 等28 在之后的研究中发现这个剂量造成的运动减少在 2 3 周后就会恢复，改为注射 6 剂后造模效果更稳定。此外，还有房劳造模法:每晚让大鼠与发情期雌鼠合笼(每次合笼都新换一批雌鼠)，连续 21d10;睡眠剥夺法:每日部分剥夺睡眠 20h，持续 13d29;肾上腺皮质激素应用 停药法6，8 以及悬吊法等造模方法11应用较少。2造模后的行为学检测2.1一般情况观察主要观察大鼠的精神状态，体重、饮食、活动情况、步态、二便，以及爪、鼻唇、耳等的色泽和眯眼等。2.2力竭游泳实验9 用于了解动物体力情况。让大鼠在 150cm 70cm 100cm，水深 50cm，水温(28 1)的游泳池中游泳，记录大鼠从入水游泳至力竭(头部沉入水中 10s 不能浮出水面为力竭标准)的时间。2.3悬尾实验5 用于测定大鼠体力情况及疲劳程度。将大鼠尾端 1cm 的部位贴在一水平木板上(木板离地 1m 左右)，使动物呈倒挂状，悬挂两侧用板隔开动物视线。动物为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后出现间断性“不动”显示“失望”状态。计算 6min 内的不动时间，同时观察大鼠挣扎幅度及抑郁状态。2.4水迷宫实验5 用于测试大鼠的学习记忆情况。选用 Mods 水迷宫，内设一低于水面的平台，测试大鼠从两个固定点入水到找到平台所需的平均时间。2.5旷场实验19 用于评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度。开阔箱为黑色，底面用白线分割为面积相等的 25 块。将大鼠放入开阔箱的正中格，观察大鼠 6min 的活动情况。测定指标包括:正中央格停留时间;方格间穿行次数(3 爪以上跨入邻格的次数);竖起或修饰次数(两前肢离地 1cm以上的次数);竖起或修饰时间(两前肢离地 1cm 以上的时间)。2.6高架十字迷宫12 是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，安置在离地面 25cm 处。大鼠被分别放在高架十字迷宫的中央部分，头朝向开臂。记录 5min 内大鼠在开臂内的时间。3讨论综合目前国内外 CFS 动物实验研究发现，大多数研究者主要采用躯体疲劳 游泳、跑台训练、房劳等和心理疲劳 慢性束缚、电刺激、夹尾、睡眠剥夺、悬尾等相结合的造模方法来模拟人类长期精神压力大，体力超负荷运转等多重应激疲劳状态。其中，短时间冷水游泳加慢性束缚造模法被重复采用次数最多。这种造模方法对实验设备要求较低，效果较好，动物死伤率较低，可操作性较强。跑台、夹尾电刺激、悬尾等，因操作者刺激强度掌握不当或动物剧烈反抗，均易造成动物受伤出血或引起继发感染，影响造模进行。由于 CFS 与长期精神刺激、脑、体力过度劳累、病毒感染及神经 内分泌 免疫功能失调等多种因素有关，多因素复合应激造模因其能更好更全面的模拟837辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 4 期CFS 病理状态，已成为造模的主流方式。多因素造模多是上述造模法中的两种或多种的组合，造成动物的躯体、心理复合应激疲劳，如慢性束缚加冷水游泳30，力竭游泳复合部分睡眠剥夺29，慢性束缚加强制冷水游泳结合睡眠剥夺2 等等。在模型检验方面，国内研究在造模后多通过进一步的动物实验了解动物体力情况(力竭游泳实验)，学习记忆情况(水迷宫实验)、探究行为及情绪反应(旷场及鼠尾悬挂实验)等，根据动物出现的体力疲劳及一系列精神情志症状来判断造模情况。国外研究则更主要通过造模过程中如强制游泳中大鼠不动的时间、大鼠活动能力、大鼠焦虑样表现(高架十字迷宫和 mir-ror chamber)等直接的行为学测试和血脂质过氧化反应、还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶、亚硝酸酯等客观生物化学参数变化来判断造模成功31。综上，CFS 不是由单一因素造成，其发病与精神刺激、体力、心理过度劳累及病毒感染有关，伴随有一定程度的神经 内分泌 免疫功能失调。在造模时应考虑多方面因素，现有的短时间冷水游泳加慢性束缚造模法兼顾了体力和心理因素，而免疫诱导法则模拟了神经 内分泌 免疫功能失调的内在机制，这两者的有机结合可更好地兼顾和模拟 CFS 的发病机制，可能会是一种稳定、可靠且重复性好的 CFS 造模方法。另外，在模型的检验标准上，国外研究往往更客观，更努力保护实验动物权益，值得我们参考和借鉴。参考文献 1Holmes GP，Kaplan JE，Gantz NM，et al Chronic fatigue syndrome:aworking case definitionJ Ann Intem Med，1988，108(3):387 389 2唐纯志，杨丽霞，杨君军，等 针刺对慢性疲劳大鼠血清 干扰素和转化生长因子和转化生长因子 的影响J 中国中医基础医学杂志，2007，13(8):612 613 3陈云飞，杨文佳，符胜光，等 电针对慢性疲劳大鼠下丘脑、垂体、肾上腺指数及 CRH 的影响J 上海针灸杂志，2007，26(2):35 38 4石世德，周民伟，李建军，等 怡欣乐口服液对慢性疲劳模型动物免疫调节作用的影响J 实用医学杂志，2004，20(5):501 503 5陈云飞，杨文佳，符胜光，等 电针对慢性疲劳大鼠模型下丘脑 垂体 肾上腺轴激素水平的影响J 中华中医药学刊，2007，25(6):1146 1149 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