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实验四 乙酸的电位滴定分析及其解离常数的测定

一、目的要求
1．学习电位滴定的基本原理及操作技术
2.运用pH-V曲线和（ΔpH-ΔV）-V曲线与二级微商法确定滴定终点。。
3.学习测定弱酸离解常数的方法。

二、实验原理
乙酸HAc是一弱酸，其pKa = 4.74，当以标准碱溶液滴定乙酸试液时，在化学计量点附近可以观察到pH的突跃。
以玻璃电极与饱和甘汞电极插入试液即组成如下的工作电池：
Ag,AgCl︱HCl(0.1 mol·L-1)︱玻璃膜︱HAc试液︱KCl(饱和)︱Hg2Cl2,Hg
该工作电池的电动势在酸度计上反映出来，并表示为滴定过程中的pH记录加入标准碱溶液的体积V和相应的被滴定溶液的体积。也可用二级微商法，于Δ2pH-ΔV2=0处确定终点。根据标准碱溶液的浓度、消耗的体积和试液的体积，即可求得试液中乙酸的浓度或含量。
根据乙酸的解离平衡：
HAc(aq) H＋（aq） ＋ Ac－(aq)
其解离常数
[HAc]
[H+] [Ac-]
Ka =

当滴定分数为50﹪时，[Ac-] = [HAc]，此时Ka = [H+]，即pKa = pH
因此在滴定分数为50﹪处的pH，即为乙酸的pKa。

三、仪器和试剂
1.酸度计
2.玻璃电极
3.甘汞电极
4.容量瓶 50ml 100ml
5.吸量管
6.微量滴定管
7.0.1000mol/L邻苯二甲酸氢钾标准溶液
8.0.1mol/LNaOH
9. 0.1mol/LHAc
10. pH=4.00、pH=6.88标准缓冲溶液（20℃）

四、操作步骤
1.调试仪器:接通电源，将选择开关置于pH档，连接好电极，调节温度档于室温。
2.将pH=6.88（20℃）的标准缓冲溶液置于50mL的烧杯中，放入磁力子，开动搅拌器，调节定位档，再用pH=4.00（20℃）的标准缓冲溶液校核，调节斜率挡，反复调节，相对固定，所得读数与测量温度下的缓冲溶液的标准值之差应在±0.05pH单位之内。
3.准确吸取10.00mL邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100mL烧杯中，加水约30mL，放入磁力子.
4.将待标定的NaOH溶液装入滴定管中，调节液面在0.00mL处
5.开动搅拌器，调节适当的搅拌速度，进行粗测，即测量在加入NaOH溶液0mL、1mL、2mL…8mL、9mL、10mL时的各点的pH。初步判断发生PH突跃时所需的NaOH体积范围（△Vex）。
6.重复3、4操作，然后进行细测，即在化学计量点附近取较小的体积增量，以增加测量点的密度，并在读取滴定管读数时，读准至小数点后第二位。如在粗测时△Vex为8~9mL，则在细测时，在加入800mLNaOH后，以0.10mL为体积增量，测量加入NaOH溶液8.00 mL、8.10 mL、8.20 mL…8.90mL和9.00 mL时各点的pH值。
7.吸取乙酸试液10.00 mL，置于100 mL烧杯中，加水约30 mL.
8.仿照标定NaOH时的粗测和细测步骤，对乙酸进行测定。在细测的（1/2）△Vex处,也应该适当增加测量点的密度,如△Vex为4~5 mL,可测量加入2.00 mL、2.10 mL…2.40mL和2.50 mLNaOH溶液时各点的pH值。

五、数据处理
1、NaOH溶液浓度的标定
（1）实验数据及计算
粗测 ΔVex= mL
V/mL
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ………
pH
＞10.00

细测
V/mL

pH

ΔpH/ΔV

Δ2pH/ΔV2

根据实验数据计算ΔpH/ΔV和化学计量点附近的Δ2pH/ΔV2，填入表中
（2）于方格纸上作pH-V和（ΔpH/ΔV）-V曲线，找出终点体积Vep.
（3）用内插法求出Δ2pH/ΔV2=0处的溶液的NaOH体积Vep.
（4）根据（3）所得的Vep，计算NaOH标准溶液的浓度。
2、乙酸浓度及解离常数Ka的测定
（1）实验数据及计算
粗测 ΔVex= mL
V/mL
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ………
pH
＞10.00
细测（半中和点）
1／２ΔVex

pH

细测
V/mL

pH

ΔpH/ΔV

Δ2pH/ΔV2

仿照上述NaOH溶液浓度标定的数据处理方法，画出曲线，求出终点Vep。
（2）计算原始试液中乙酸的含量，以g.L-1表示。
（3）在pH-V曲线上，查找体积相当于1/2ΔVep时的pH，即为乙酸的pKa。
【注：pKa一定要在pH-V曲线上描出并读出相应数据（直接打印的请用16K或B5）】

六、思考题（任选两题）
1．若改变所测乙酸溶液的浓度，乙酸的解离常数有无变化？
2．测定一系列同种溶液的pH值时，测定顺序由稀到浓和由浓到稀，其结果可能有何不同？
3．如何确定pH计已校正好？
4．将10mL0.2 mol·L－1HAc溶液和10mL0.1 mol·L－1NaOH溶液混合后，所得溶液是否具有缓冲能力？
5.常用标准缓冲溶液有哪几种？

七、备注
1．介绍pH计的使用方法。
2．强调移液管的使用。

实验五 原子吸收分光光度法测定自来水中钙、镁的含量
———— 标准曲线法
一、目的要求
1. 掌握原子吸收分光光度法的基本原理；
2. 了解原子吸收分光光度计的基本结构及其使用方法；
3. 掌握标准曲线法测定自来水中钙、镁的含量的方法。

二、实验原理
原子吸收分光光度法是基于物质所产生的原子蒸气对特定谱线(即待测元素的特征谱线)的吸收作用进行定量分析的一种方法。
若使用锐线光源,待测组分为低浓度,在一定的实验条件下,基态原子蒸气对共振线的吸收符合下式： A=e cl
当l以cm为单位，c以mol·L-1为单位表示时，e 称为摩尔吸收系数，单位为mol·L-1·cm-1。上式就是Lambert-beer定律的数学表达式。如果控制l为定值，上式变为A=Kc
上式就是原子吸收分光光度法的定量基础。定量方法可用标准加入法或标准曲线法。
标准曲线法是原子吸收分光光度分析中常用的定量方法，常用于未知试液中共存的基体成分较为简单的情况，如果溶液中基体成分较为复杂，则应在标准溶液中加入相同类型和浓度的基体成分，以消除或减少基体效应带来的干扰，必要时须采用标准加入法而不是标准曲线法。标准曲线法的标准曲线有时会发生向上或向下弯曲现象。要获得线性好的标准曲线，必须选择适当的实验条件，并严格实行。

三、仪器和试剂
1.原子吸收分光光度计 AA320N型（上海分析仪器厂）
2.空心阴极灯 钙、镁空心阴极灯
3.无油空气压缩机
4.乙炔钢瓶
5.通风设备
6.容量瓶、移液管等
7.钙标准储备液（1000μg.mL-1）
8.钙标准使用液（100μg.mL-1）
9.镁标准储备液（1000μg.mL-1）
10. 镁标准使用液（25μg.mL-1）
四、实验条件
钙 镁
1、吸收线波长（nm） 422.7 285.2
2、空心阴极灯电流（mA） 10 10
3、狭缝宽（mm） 0.5 （2档） 0.2（1档）
4、燃烧器高度(mm) 6.0 4.0
5、乙炔流量（L·min－1） 0.8 0.7
6、、空气流量（L·min－1） 4.5 4.5
五、实验步骤
1、配制标准溶液系列
（1）Ca标准溶液系列 准确吸取0.50，1.00，2.00，3.50，5.00 mL上述Ca标准使用液，分别置于五只50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。
（2）Mg标准溶液系列 准确吸取0.50，1.00，1.50，2.00，3.00 mL上述Mg标准使用液，分别置于五只50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。
2、自来水样品溶液
打开自来水开关，取中间水样备用。
测定Ca不稀释，测定Mg稀释1倍(视具体情况而定)。
根据实验条件，将原子吸收分光光度计，按仪器操作步骤进行调节，待仪器电路和气路系统达到稳定，即可测定以上各溶液的吸光度。

六、数据处理
1．记录实验条件
（1）仪器型号
（2）吸收线波长（nm）
（3）空心阴极灯电流（mA）
（4）光谱通带或光谱带宽（nm）
（5）乙炔流量（L·min－1）
（6）空气流量（L·min－1）
（7）燃助比

2．列表记录测量Ca、Mg标准系列溶液的吸光度

测定序号
1
2
3
4
5
样品
Mg浓度/mg▪L-1

吸光度A
A1

A2

A3

Ā

Ca浓度/mg▪L-1

吸光度A
A1

A2

A3

Ā

以吸光度为纵坐标，以Ca，Mg浓度为横坐标绘制标准曲线，并计算回归方程和标准偏差（或相关系数）（直接打印的请用16K或B5）
3．根据自来水样的吸光度，用回归方程求得水样中Ca，Mg的浓度（g·L-1）。若经稀释须乘上稀释倍数求得原始自来水中Ca，Mg含量。

七、学习掌握有关操作
1. 了解原子吸收分光光度计的基本结构及其使用方法；
2. 了解标准加入法的具体操作。
3. 学习钢瓶的分类及使用。

八、思考题（任选两题）
1. 原子吸收光谱的理论依据是什么？
2. 原子吸收分光光度分析为何要用待测元素的空心阴极灯做光源？能否用氢灯或钨灯代替，为什么？
3. 如何选择最佳的实验条件？
4. 在什么条件下使用标准曲线法或标准加入法，他们各有什么优缺点？

九、备注
介绍原子吸收光谱仪的原理、注意事项和操作。

实验六 荧光光度分析法测定蔬菜水果中维生素B2的含量

一、目的要求
1．了解荧光分光光度法的基本原理，正确使用930型荧光分光光度计。
2. 掌握荧光分光光度法测定蔬菜水果等食品中维生素B2含量的实验技术。
二、实验原理
在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。以测量荧光强度和波长为基础的分析方法叫做荧光分光光度分析法。
对同一物质而言，若alc<<0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系
F = 2.3φf I0 alc
式中：
φf — 荧光过程的量子效率；
I 0 — 入射光强度；
a — 荧光分子的吸收系数；
l — 试液的吸收光程。
I 0和l不变时
F = Kc
式中K为常数。因此,在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。
维生素B2(即核黄素)在430 ~ 440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535 nm。维生素B2的荧光在pH=6~7时最强，在pH=11时消失。
荧光分析实验首先选择激发光单色器波长和荧光单色器波长，基本原则是使测量获得最强荧光，且受背景影响最小。激发光谱是选择激发光单色器波长的依据，荧光物质的激发光谱是指在荧光最强的波长处，改变激发光单色器的波长测量荧光强度，用荧光强度对激发光波长作图所得的谱图。大多数情况下，荧光物质的激发光谱与其吸收光谱相同。荧光光谱是选择荧光单色器波长的主要依据，荧光物质的荧光光谱是将激发光单色器波长固定在最大激发光波长处，改变荧光单色器波长测量荧光强度，用荧光强度对荧光波长作图所得的谱图。下图为维生素B2的吸收（激发）光谱及荧光光谱示意图。
本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。激发光单色器波长选360 nm或 440 nm。荧光单色器波长选525 nm，可将440nm的激发光及水的拉曼光（360 nm）滤除，从而避免了它们的干扰。
三、操作步骤
1．标准系列溶液的配制
在五个洁净的50 mL容量瓶中，分别加入0.50 mL，1.00 mL，3.00 mL，5.00 mL和10.00 mL 5.00 mg · L－1维生素B2工作标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2．标准系列溶液的测定
开启仪器电源，预热约10min。用蒸馏水作空白，用标准溶液中浓度最大的溶液，调节荧光读数近满刻度的某一固定值，从稀到浓测量标准系列溶液的荧光强度，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

四、样品测定
1、样品的氧化：吸取上述样品处理液25mL于50mL容量瓶中，加入lmL3％KMnO4溶液，混匀后放置2分钟，再加入lmL3％H2O2溶液混匀，使KMn04褪色，并稀释至刻度。
2、维生素B2含量的测定：在与标准曲线同样条件下测定样品氧化后的溶液荧光强度，并据此从标准曲线上求得维生素B2的含量，计算测定结果：
3、对于复杂样品中维生素B2的提取，可将一定量均匀样品放入250mL锥形瓶中，加入HCl溶液(0.1mol/L)50mL，置于高压锅中于10MPa煮沸30分钟，冷却后，用醋酸钠溶液(2.5mol/L)调节pH至4.5～5.5，用水稀释至100mL。过滤，取中间滤液备用。实验操作最好在避光条件下进行，容器采用棕色玻璃器皿。
4、加入KMnO4的作用，是氧化其他色素和杂质，以除去干扰。

实验说明
维生素B2的理化特征；维生素B2是桔黄色无臭的针状结晶，又叫核黄素，易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定，在食物中维生素B2一般都以磷酸核黄素和二核苷酸腺嘌岭黄素的形式存在，而且它们都是或紧或松地和蛋白质结合着，若用酸和酶水解Q可以使其成为游离的维生素B2
（仪器操作方法见930荧光光度计或有关仪器说明书。）

四、数据处理
1．记录数据
维生素B2标准溶液浓度及荧光强度测定数据
测定次数n
1
2
3
4
5
样品
ρ /mg L-1

F

2. 用标准系列溶液的浓度及荧光强度绘制标准曲线。
3．根据待测液的荧光强度，从回归方程上求得其浓度。
4．计算样品中维生素B2的含量，用μg/g表示。

五、学习掌握有关操作
1. 学习和掌握荧光分光光度计的结构和使用方法
2. 学会荧光池的使用。

六、思考题（任选两题）
1. 荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？
2. 荧光是如何产生的？
3. 荧光池为什么四面透光？
4. 930荧光光度计怎样选择激发光单色器波长和荧光单色器波长？

七、备注
介绍荧光分光光度计的原理和操作注意事项。