酵母菌的筛选方案.doc

第一部分：酵母筛选收集
一．土样中酵母的分离：
1．土壤的采集处理
采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。
将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。
2. 土壤中菌种的分离：
称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。
为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。
观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。
二．葡萄果表酵母的分离:
1. 葡萄的采集：
葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。
2. 菌种分离步骤：
将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。
随机选取并称量约 10g成熟葡萄，放入盛有 90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养 30min后静置，制成菌悬液，吸取 50µl 放入 YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养 24～48h。观察菌落的大小及生长状况。
然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基 表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。
为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。
观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。
三. 自然发酵过程中酵母菌的分离:
将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。
称量约 100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的 500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔 24h 取发酵液1ml，加入 9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。
取 0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置， 28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。
为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。
观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。
四. 设备表面酵母的分离：
取擦拭过设备表面的棉球，将其中的菌液挤出，取1 m菌液经梯度稀释法结合划线分离得到单菌落。以上菌液通过梯度稀释法进行划线分离单菌落：无菌条件下取1 ml含菌的样品处理液→用无菌的生理盐水稀释为若干梯度（10-1-10-7）→将稀释液涂布于固体培养基平板，28 ℃培养3d→菌落计数→观察，编号并记录。

观察和记录完毕后，挑选不同菌落中的每一菌株制成水浸片（染色），并编号。将各个水制片在高倍镜下观察各株菌的个体形态，并记录。
选出具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，用灭菌后的接种环挑去不同菌落，在分离培养基上连续划线分离2~3次，进行纯化。
菌种的保藏：
分离纯化得到的酵母单菌落接种于培养基进行液体培养，培养的条件为：温度是 28 ℃，转速为180 r/min，时间为 18～24 h。当菌体培养好后，将菌液和灭菌后的甘油按体积比为 7: 3 的比例进行混合，混合摇匀后于-20 ℃下保藏待用。

PS：以上分别进行培养基筛选试验，可选培养基：
（1）PDA培养基：
去皮马铃薯300g，加水煮沸10～20min，过滤加入葡萄糖200g，加水至1L。灭菌。
（2）YEPD：
葡萄糖20g、蛋白胨20g、牛肉膏10g、琼脂20g、水1000ml
将葡萄糖溶解在水中，添加蛋白胨及酵母浸膏，混匀后，加琼脂溶化，灭菌。
YEPD液体培养基：酵母浸粉 10 g/L,胰蛋白胨 20 g/L,葡萄糖 20 g/L,琼脂15 g/L, 固体培养基可加入2 %琼脂。

第二部分：酿酒酵母筛选及其鉴定
一 筛选
1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选
对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。
2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母
WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁
0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌 20 min；
将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。
3 赖氨酸培养基筛选
赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁 200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结晶硫酸镁500mg，氯化钠100mg，结晶氯化钙100mg，赖氨酸盐酸盐2.5g，琼脂20g，pH 自然，121℃灭菌 20 min；
接种液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种酵母到5mL无菌水中进行饥饿处理，5d后，接种到赖氨酸培养基，27℃培养 5d 后观察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到 15d 后仍无菌落生长说明可能是酿酒酵母。
二 酿酒酵母的鉴定
1. 形态与培养特征
将菌种接种到液体培养基中，25℃培养3～7d，观察是否发酵、培养液是否混浊，是否形成环或岛，沉淀量多少及松紧状况，并制水浸片于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖方式与细胞的形状。将酵母在琼脂培养基上划线，于28℃培养3d～4d，观察其菌落形态。
2. 酵母假菌丝的观察
将菌株在25℃活化后，在琼脂平板上划线接种(每个平板2-3 条)，在菌线上盖上无菌盖玻片，在28℃下培养5d～10d。
3. 酵母菌子囊孢子的观察
产子囊孢子培养基：酵母膏3g、麦芽汁3g、蛋白胨5g、葡萄糖10 g、琼脂20g、水1000 mL。上述培养基于121 ℃灭菌20min, 做斜面；
菌株在25℃琼脂培养基活化1-2d 后，接种到生孢培养基斜面上划线，25 ℃培养3d，镜检是否有子囊孢子。凡未见孢子的在 17℃左右保持4～6周, 每周再检查是否出现子囊孢子。
4. 同化碳源试验
鉴定所需同化物质共18种, 为半乳糖、棉籽糖、赤藓糖醇、蔗糖可溶性淀粉、核糖醇、麦芽糖、D-木糖、D-甘露糖醇、纤维二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、柠檬酸、乳糖、L-鼠李糖和肌醇。将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的氮源基础培养基(YNB) 中，使糖浓度达到50 mmol/L，经过滤( 0.20μm)除菌。以含 YNB 而不含碳源的试管作为不生长的空白对照。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中，25℃条件下培养分别在 1、2 和第3周观察，以试管中出现混浊计为阳性，否则计为阴性。重复3次，结果观察标准：将已培养数天的试管于混合振荡器上摇动，使内容物充分混匀。在一张白色卡片上画一条约3/4mm 宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光观察，如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+；如果溶液非常澄清，记为-，表示未有酵母生长。
5. 发酵糖类试验
鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、菊糖乳糖和核糖。将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的生理生化培养基中, 使糖的浓度达到50 mmol/L , 经过滤( 0.20μm) 除菌。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中，25℃条件下培养，每隔2d观察发酵情况，连续观察2周，4周后再观察一次，每次观察时注意杜氏小管中气体的量，以及出现的速度，判断发酵情况。以杜试管中有气泡记为阳性，无气泡为阴性，三次重复。
6. 同化氮源
供试氮源有硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、L-赖氨酸。该试验主要考察酵母菌在分别以硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、L-赖氨酸为惟一氮源时的生长情况。碳源基础培养基中加入硝酸钾，加入量为0.078%(w/w)，115℃灭菌20min。接种隔夜活化的酵母，于25℃培养1周。试验设置3个重复，以不加入氮源的培养基作为对照。
7. 生成类淀粉化合物试验
生成类淀粉化合物培养基：硫酸铵 0.2%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%、酵母膏0.1%、葡萄糖2%、琼脂2%。上述培养基溶于蒸馏水中, 并用盐酸调整溶液pH值达4.8, 然后于115℃灭菌20 min；
接种隔夜活化的酵母，28℃培养1～2d后，在平板长菌处周围滴加Lugol's 碘液，凡能产生类淀粉化合物的酵母会在菌落周围呈现蓝紫色或绿色为正反应，即能生成类淀粉。有时出现棕色是肝糖反应，会混淆结果，因此应将培养物保存几小时或过夜，如是棕色则会消失，而蓝色仍然会保留。
8. 0.1%、0.01%放线菌酮抗性测试
溶解1g放线菌酮于2.5mL丙酮中，向丙酮溶液中加入6.7g氮源基础培养基，再加入含10g葡萄糖的蒸馏水，充分混匀后过滤( 0.20μm) 除菌。取上述溶液加入到有蒸馏水(已高压灭菌)的试管中，制成含 0.1%、0.01%放线菌酮的培养基。向培养基中接种已活化好的酵母，25℃培养3周。结果观察标准同碳源同化测试。
三．菌株26S rDNA D1/D2区序列分析
1.菌落PCR DNA的制备：
挑取新鲜单菌落置于 30μl 0.2％ SDS 中；漩涡混匀器上混匀 15 秒；90℃ 热激4min；4℃ 13000rpm×1min，离心，取上清液 20μL 至新的无菌离心管中，-20℃保藏。
2. 菌株26SrDNAD1/D2区的 PCR 扩增
26SrDNAD1/D2区PCR扩增的引物对为NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和 NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）；Taq DNA Polymerse Buffer (1×)，MgCl2 2.0mmol/L，dNTPs 40μmol/L，Taq 酶 1U，模板 DNA60ng，引物各 0.6μmol/L，加超纯水至 50μl。反应程序为 95℃ 5min；94℃ 1min；52℃ 1min；72℃ 1min20s，循环 36 次；72℃ 延伸 8min。所得PCR产物使用凝胶回收试剂盒进行纯化后，送出去进行测序。

第四部分：耐受性分析
1. 酒精耐受性测定
将灭菌后的YEPD培养基降温至40℃左右，按 10%、12%、14%、16%、18%(v/v)的浓度加入乙醇，接种新鲜单菌落在YEPD平板进行生长实验，一周后以生长状况表征其酒精耐受性。
2. 渗透胁迫耐受性测定
加入0.7mol/L、1.0mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L、1.6 mol/L、1.8 mol/L、2.0 mol/L、2.2 mol/L、2.4 mol/L KCL 到YPD液体培养基中，接种新鲜单菌落进行生长实验，以生长状况表征其渗透胁迫耐受性。培养2d 后以生长状况表征其耐受性。
3. 高温耐受性测定
在 37℃和 42℃下，YEPD斜面培养进行生长实验，以生长状况表征其高温耐受性。培养两周后以生长状况表征耐受性。
4. 营养饥饿耐受性测定
将各菌株在无菌水中25℃分别静置饥饿 5d、6d、7d、8d、9d、10d，在YPD液体培养基进行生长实验，培养2d后以生长状况表征其营养饥饿耐受性。
5. 高糖耐受性测试
在含有10%、20%、30%、40%、50%、60%的葡萄糖的YEPD斜面培养基进行生长实验，以生长状况表征其对不同浓度糖的耐受性。培养两周后观察生长差异。
6. 低pH值的耐受性测试
在pH值分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的YPD液体培养基中进行生长试验，以生长状况表征其对低pH值得耐受性测试。培养2d后观察生长差异。
7. 发酵力
紫外分光光度法测定葡萄糖的含量：
在碱性的条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，而非还原糖则被氧化为糖酸或者其它的产物。该棕红色物质在540nm波长处具有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收的值与还原糖的量呈一定线性关系，通过比色法可测定样品的含糖量。
标准曲线的绘制方法：取7只25mL的容量瓶，按照下表加入各种试剂：
残糖标准曲线的绘制（单位：mL）
管号
0
1
2
3
4
5
6
Glc标液
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
H2O
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
DNS试剂
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5

测定不同浓度葡萄糖标准液在 540 nm波长处的吸光度，计算出各管中标准葡萄糖含量，以吸光度值对各管标准葡萄糖含量作曲线得到标准葡萄糖曲线。实验数据填入下表，绘制标准曲线。
葡萄糖标准曲线的数据（单位：mL）
管号
0
1
2
3
4
5
6
Glc含量
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
OD540

PS：平板菌落计数：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。