大鼠松果体Clock基因和苏烷脘N-乙酰转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响.pdf

生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2005,57(1):97-102http:/97研究论文Received 2004-04-23 Accepted 2004-09-29This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30170295),Medical Developmental Foun-dation of Soochow University(No.EE134031)and Young Teachers Research Foundation of Soochow University(No.Q3134044).*Corresponding author.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:大鼠松果体大鼠松果体 Clock 基因和芳烷脘基因和芳烷脘 N-乙酰基转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响乙酰基转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响王国卿1,2,杜玉珍2,童 建2,*苏州大学1医学院基础医学系生理学教研室；2放射医学与公共卫生学院卫生毒理学教研室，苏州 215007摘要：摘要：探讨12 h 光照、12 h 黑暗交替(12 h-light:12 h-dark cycle,LD)及持续黑暗(constant darkness,DD)光制下松果体Clock基因和芳烷脘N-乙酰基转移酶基因(arylalkylamine N-acetyltransferase gene,NAT)是否存在昼夜节律性表达及其光反应变化。Sprague-Dawley大鼠在LD和DD光制下分别被饲养4周(n=36)和8周(n=36)后，在一昼夜内每隔4 h采集一组松果体组织(n=6)，提取总RNA，用竞争性定量RT-PCR 测定不同昼夜时点样品中Clock及NAT 基因的mRNA相对表达量，通过余弦法和ClockLab 软件获取节律参数，并经振幅检验是否存在昼夜节律。结果如下：1)在 DD 或 LD 光制下，松果体 Clock 和 NAT 基因mRNA的表达均呈现夜高昼低的节律性振荡(P0.05)。(2)与DD 光制下比较，LD 光制下松果体 Clock 和NAT 基因的表达振幅及峰值相的mRNA水平均降低(P0.05)。结果表明，Clock 和 NAT 基因在松果体中存在同步的内源性昼夜节律表达，光照作用可使其表达下调。关键词：关键词：Clock 基因;NAT 基因;昼夜节律;光照;松果体中图分类号：中图分类号：Q811.213;R322.55;R852.6;R322.81Circadian rhythms and light responses of clock gene and arylalkylamineN-acetyltransferase gene expressions in the pineal gland of ratsWANG Guo-Qing1,2,DU Yu-Zhen2,TONG Jian 2,*1Department of Physiology,Medical School;2Department of Toxicology,School of Radiation Medicine and Public Health,SoochowUniversity,Suzhou 215007,ChinaAbstract:This study was to investigate the circadian rhythms and light responses of Clock gene and arylalkylamine N-acetyltransferase(NAT)gene expressions in the rat pineal gland under the 12 h-light:12 hdark cycle condition(LD)and constant darkness(DD).Sprague-Dawley rats housed under the light regime of LD(n=36)for 4 weeks and of DD(n=36)for 8 weeks were sampled for the pinealgland once a group(n=6)every 4 h in a circadian day.The total RNA was extracted from each sample and the semiquantitative reversetranscription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to determine the temporal changes in mRNA levels of Clock and NAT genesduring different circadian times or zeitgeber times.The data were analysed by the cosine function software,Clock Lab software and theamplitude F test was used to reveal the circadian rhythm.The main results obtained are as follows.(1)In DD or LD condition,both ofClock and NAT genes mRNA levels in the pineal gland showed robust circadian oscillation(P 0.05)with the peak at the subjectivenight or at night-time.(2)In comparison with DD regime,the amplitudes and the mRNA levels at peaks of Clock and NAT genesexpressions in LD in the pineal gland were significantly reduced(P 0.05).These findings suggest that the expressions of Clockand NAT genes in the pineal gland not only show remarkably synchronous endogenous circadian rhythmic changes,but also response 生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2005,57(1):97-10298大多数生物体的生理功能表现出以24 h为周期的昼夜节律。产生这种节律的结构基础是分子计时器昼夜节律生物钟。哺乳类动物的生物钟已被定位于下丘脑前部的视交叉上核（suprachiasmaticnucleus,SCN）和松果体1,2。外源光信号的强弱变化通过视网膜-SCN-松果体之间神经信息和体液信使的相互联系，形成一个统一协调的昼夜节律整体振荡系统2。Klein 等3认为，由松果体分泌、释放的重要时间生物学激素褪黑素(melatonin,MEL)，其合成与分泌受到关键酶芳烷脘N-乙酰基转移酶(arylalkylamine N-acetyltransferase,NAT)基因的调控。Abe等4证实哺乳类SCN钟基因Clock存在着昼夜节律性表达,光照作用以时相依赖方式可使这种表达上调。而在另一重要钟组织松果体中，有关Clock和NAT基因表达的昼夜节律性、二者相关性及其光反应性的报道不多。为此，本实验在持续黑暗(constant darkness,DD)和 12 h 光照、12 h黑暗交替(12 h-light:12 h-dark cycle,LD)光制下，于不同昼夜时点采集大鼠松果体组织，进行竞争性半定量RT-PCR，测定不同光制各时点下 Clock 和NAT 基因的 mRNA 表达水平变化。用余弦函数和Clock Lab软件获取和分析节律性参数，旨在探讨松果体Clock和NAT基因表达的昼夜节律性、光反应性及二者之间的相关性，以便进一步阐明中枢昼夜节律的分子调节机制。1 材料和方法材料和方法1.1 动物模型及分组采样动物模型及分组采样 健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠(70100 g，苏州大学医学院实验动物中心 SPF 级)，自由摄食、饮水，室温维持(25 1)。随机分成两大组：DD 组(n=36，饲养 8 周，6 只一笼)和 LD 组(n=36，饲养 4 周，6 只一笼)。光照期的光照度 150 lx，照射时间为 5:00 至 17:00，位于鼠笼中央上方。黑暗期采样时红光照度1.0lx。将光照开始时间定为昼夜 0 时点，把 24 h 自然时点转换成昼夜时点(circadian time，CT 或 zeitge-ber time，ZT)。每组又按各 CT(DD 光制)或 ZT(LD光制)时点（02、06、10、14、18、22）分成6 小组，每隔 4 h 采集一组动物的松果体样品，每组 n=6。乙醚麻醉后打开颅腔，于窦汇正下方直视摘除松果体组织，迅速冻存于-80备用。1.2 仪器与试剂仪器与试剂PTC-100TM 热循环仪，美国MJ Research，Inc；5810R 冷冻高速离心机,德国Eppendorf；MDF-U4086S、-85冰箱，日本SANYO；UV-VIS756MC紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Gel Doc 2000TM凝胶成像分析系统，意大利 BIORAD；SCR-6 稳流稳压电泳仪，江 苏 丹 阳 无 线 电 一 厂。焦 碳 酸 二 乙 酯(DFPC)，购自 AMRESCO；Trizol、Oligo(dT)36、dNTP、RNasin(核糖核酸酶抑制剂)、Taq 酶、糖原、琼脂糖，上海 Sangon；M-MuLV 逆转录酶、Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder，MBI Fermentas。其它试剂均为分析纯级。1.3 总总 RNA 提取和提取和 cDNA 合成合成松果体总 RNA提取按 Trizol 试剂说明书执行。提取的 RNA，用紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm波长下的吸光度值，计算 OD260/OD280的比值，比值大于 1.7 的样品，用0.01%DEPC 水稀释至浓度为1 g/l。按M-MuLV 逆转录试剂说明书进行 cDNA 合成。1.4 竞争性竞争性 PCR目的基因Clock和NAT扩增片段的引物采用计算机在线辅助设计(http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www-results.cgi)。Clock基因引物正义链为：5-TCA CCACGT TCA CTC AGG ACA-3，反义链为：5-AAGGAT TCC CAT GGA GCA A-3，扩增片段长度 375bp；NAT 基因引物正义链为：5-GGG AGC CTCTGG AAT TAA CC-3，反义链为：5-AAA CCCCTT CTG AGG TCT GC-3，扩增片段长度 300 bp；内参基因 H3.3 的引物5序列：正义链为：5-GCGTGC TAG CTG GAT GTC TT-3，反义链为：5-CCA CTG AAC TTC TGA TTC GC-3，扩增片段长度 230 bp。反应总体积为 50 l，体系中含模板 4l、dNTP 100 mol、Clock 或 NAT 基因引物对各0.7 mol、H3.3 引物对各 0.3 mol、MgCl2 1.5mol、10 buffer 5 l、Taq 酶 2.5 U。反应液用 30 l 石蜡油覆盖。95预变性5 min后热循环条件如下：94，1 min；55，1 min；72，2 min；扩增Clock和NAT基因的循环数分别为32和35，最to the ambient light signal in a reduced manner.Key words:Clock gene;arylalkylamine N-acetyltransferase gene;circadian rhythm;light;pineal gland99王国卿等:大鼠松果体Clock 基因和芳烷脘N-乙酰基转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响后 72延伸 8 min。扩增产物以(1.52.0)%的琼脂糖进行凝胶电泳，稳压 80 V，持续 40 min。溴乙淀(EB)染色，并在凝胶成像分析系统下观察结果、照相存盘。1.5 数据处理数据处理用 BIORAD 凝胶成像分析系统软件转换数据，根据各泳道目的基因与内参基因(H3.3)的辉度比值进行相对定量。用余弦分析软件和Clock Lab 软件获取节律性参数，并经振幅 F检验确定是否存在昼夜节律。用于拟合的余弦函数方程为：F(t)=M+A cos(t+)，其中 M(mesor)为中值，即涨落变化的中线；A(amplitude)为节律振荡的振幅，表示上下波动的幅度；(peak phase)为峰值相位，是振荡达到峰值的时刻，可根据角速度（360/24 h）将其换算成 CT 或 ZT 时点。数据采用 mean SD 表示，组内差异用 SPSS11.0 forWindows 统计软件包进行 t 检验；组间差异用相同软件包进行方差分析(ANOVA)，P0.05为差异具有显著性。2 结果结果2.1 不同光制下松果体不同光制下松果体 Clock基因的昼夜节律性表达及其光反应性基因的昼夜节律性表达及其光反应性2.1.1 DD 或或 LD 光制下光制下 Clock 基因的昼夜节律性表达基因的昼夜节律性表达在 DD 或 LD 光制下的不同昼夜时点，Clock 基因半定量 RT-PCR 的扩增结果见图 1；其mRNA 表达的昼夜节律参数见表 1；其昼夜节律性表达的时间模式分别见图 2A 和 B。两种光制下Clock 基因的昼夜表达经振幅 F 检验分析，P0.05(表 1)。表明无论光照与否，松果体 Clock 基因表达均存在着明显的夜高昼低的节律性振荡。2.1.2 光照对光照对 Clock 基因昼夜节律性表达的影响基因昼夜节律性表达的影响与 DD 光制下比较，LD 光制下松果体Clock基因表达的节律振幅减小(P0.05)，达到峰值时的mRNA 水平降低(P0.05)，而其他节律参数无明显图 1.半定量RT-PCR 测定不同光制下大鼠松果体Clock、NAT 基因的表达Fig.1.Semiquantitative RT-PCR of Clock and NAT genes in the pineal gland of rats under different light conditions.C,control;M,marker;CT,circadian time;ZT,zeitgeber time.表 1.不同光制下大鼠松果体Clock、NAT 基因mRNA表达的昼夜节律参数Table 1.Circadian rhythmic parameters of Clock and NAT genes mRNA expressions in the pineal gland of rats under different light conditions Gene Light n Amplitude Mesor Peak Trough mRNA level mRNA level P condition phase phase at peak at troughClockDD36 0.42 0.140.99 0.10CT18CT61.41 0.270.57 0.21*NATDD 0.37 0.111.00 0.15CT17CT51.37 0.250.63 0.19*ClockLD36 0.30 0.10#0.87 0.09ZT17ZT51.17 0.24#0.56 0.17*NATLD 0.23 0.13+0.84 0.11+ZT16ZT41.07 0.23+0.61 0.15*Data were presented as mean SD.CT,circadian time;ZT,zeitgeber time;NAT,arylalkylamine N-acetyltransferase gene.*P 0.05,bythe amplitude F test;#P 0.05 vs Clock in DD and+P 0.05)(表 1，图 2)。表明光照作用可使松果体 Clock 基因表达量下调，但不引起其节律相位的明显改变。2.2 不同光制下松果体不同光制下松果体NAT基因的昼夜节律性表达及其光反应性基因的昼夜节律性表达及其光反应性2.2.1 DD 或或 LD 光制下光制下 NAT 基因的昼夜节律性表达基因的昼夜节律性表达在DD或LD光制下，于不同昼夜时点，NAT基因半定量 RT-PCR 的扩增结果见图 1；其 mRNA表达的昼夜节律参数见表 1；其昼夜节律性表达的时间模式分别见图 2C 和 D。两种光制下 NAT 基因的昼夜表达，经振幅 F 检验分析，P0.05(表 1)。表明无论光照与否，松果体NAT基因表达也均呈现出明显的夜高昼低的节律性振荡。2.2.2 光照对光照对 NAT 基因昼夜节律性表达的影响基因昼夜节律性表达的影响 与 DD 光制下比较，LD 光制下松果体 NAT基因表达的节律振幅减小(P0.05)，节律振荡的中值下降(P0.05)，达到峰值时的 mRNA 水平降低(P0.05)(表 1，图 2)。表明光照作用也能导致松果体 NAT基因表达下调，但不引起其节律相位的明显改变。2.3 不同光制下松果体两种基因不同光制下松果体两种基因(Clock、NAT)昼夜节律性表达的比较昼夜节律性表达的比较在DD或LD光制下，与Clock基因相比，NAT基因表达的昼夜节律参数及其时间模式均无显著性差异(P0.05)(表1)。表明在松果体中，NAT 基因与Clock 基因的昼夜节律性表达是同步发生的。3讨论讨论哺乳类松果体不仅表现内分泌输出效应，而且自身也起着昼夜节律振荡器的作用，其光信号输入通路和内分泌输出通路均与中枢节律振荡密切相关6,7。在SCN 输出性振荡节律的驱动下，松果体分泌MEL 的节律呈现昼低夜高变化3,6。作为体液信使，MEL 发挥编码夜晚期间节律运行的作用2，但其效应主要取决于NAT基因表达的节律性水平3。Clock 基因作为重要的钟基因之一，已被证实主要在SCN、松果体和视网膜上表达8，是维持内源性生物钟运行的必要元件。Clock 基因的表达可维持近24 h的周期9，其表达可受光照的改变直接影响下游基因的转录。该基因突变后，小鼠丧失昼夜节律的内源性和持续性，而增加外源性Clock 基因的mRNA 含量，能使小鼠昼夜节律加快10。因此，Clock和NAT基因在昼夜节律的调节和维持中具有重要作用。本实验在 DD 光制下，观察到松果体Clock和NAT基因均存在明显的内源性昼夜节律表达，峰值和谷值均分别出现于主观夜晚和主观白天，这与以往的报道相一致3,11。以往文献报道认为Clock基因mRNA的丰度在钟结构中以持续而恒定图 2.不同光制下大鼠松果体Clock(A 和B)、NAT(C 和D)基因mRNA昼夜节律性表达的时间模式Fig.2.Temporal patterns of Clock(A and B)and NAT(C and D)genes mRNA circadian expressions in the pineal gland of rats underdifferent light conditions.The transcription levels are expressed by grayness ratio of Clock/H3.3 or NAT/H3.3 bands.101王国卿等:大鼠松果体Clock 基因和芳烷脘N-乙酰基转移酶基因的昼夜节律性表达及光照影响的水平表达，24 h 内不具有明显的昼夜节律性振荡12,13，这可能是由于本实验所用的竞争性 RT-PCR法，在灵敏度检测方面高于以往文献中采用的原位杂交法14,15，使得较弱的mRNA昼夜振荡变化能够表现出来；另一可能原因是本实验进行昼夜全程多时点采样，而以往报道中多采用白天、黑夜两个时点取样4,11,13，难以反映24 h内基因表达的昼夜动态变化。为了探讨光导引对松果体Clock、NAT 基因节律性表达的影响，实验中采用LD(12 h:12 h)光制，分别模拟自然白天和黑夜，发现光照条件下松果体两种基因的节律性表达依然存在，而光照引起各自表达的节律振幅、峰值相的 mRNA 水平降低，但不引起各自节律相位的明显改变。提示光照可导致松果体Clock和NAT基因表达下调。Namihira 等11曾报道，松果体Clock基因及其功能伴侣基因Bmal1的表达呈现相互反时相的昼夜节律性振荡，30 min光照均不影响二者的表达水平。这可能与以往的检测方法和实验光照时间过短有关。Abe 等4指出，在DD 光制下，SCN 的Clock 基因存在昼高夜低的节律性表达，其峰值和谷值分别出现于CT6和CT18至22，光导引以时相依赖方式上调其mRNA水平。这些与本实验在松果体上观察到的结果恰好相反，表明在松果体和SCN 中，Clock基因的表达存在昼夜节律时相上的显著差异。Foulkes 等16发现，尽管松果体的节律性活动受控于SCN，但也可能部分独立于SCN。在MEL 节律性合成的机制中，通过cAMP反应分子调控器反馈环路的作用，松果体本身具有后效生物钟特性；在无 SCN 的参与下，松果体MEL可直接受光影响17并经其SCN上高敏感的受体作用调节 SCN 的节律输出18,19。提示松果体Clock 基因昼夜节律性表达，可能存在着非依赖SCN的Clock基因的振荡机制，即除了共同的E-box结合方式外Clock、Bmal1基因产物CLOCK:BMAL1蛋白在细胞核内形成杂二聚体，作为正向调节子与下游基因Per(period)、Cry(cryptochromes)或 tim(timeless)启动子区的 E-box 结合，激活基因的转录和翻译7,12,20，松果体Clock基因表达可能还有其他的光导引通路和转录调节机制。比较不同光制下松果体两种基因昼夜节律性的表达，发现在同一光制下NAT基因与Clock基因的表达是同步发生的。Takekida 等21证实，大鼠松果体Per1和Per2基因的mRNA节律性表达模式与NAT基因的非常相近。Simonneaux 等7最近报道，松果体Per1、Per3、Cry1 和 Cry2 基因的转录水平均于夜间增加，其中夜间Per1 和Cry2 基因的高水平表达可因光照或-肾上腺素能拮抗剂作用而抑制，这与NAT基因的表达有着共同的节律性特点。本实验和其他报道的结果3,6,7,11,21表明，松果体 Clock、NAT、Cry2和Per基因的mRNA水平均显示相似的夜高昼低节律性变化，而光照作用可下调上述基因的表达，这与 MEL 的节律振荡3相一致。至于这些基因表达与MEL合成以及在昼夜节律调节方面是否存在功能协调性，有待今后进一步探讨。*本文工作完成于苏州大学放谢医学与防护省级重点实验室，特此感谢！参考文献参考文献1Wang 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