发酵工程与工艺实验教案.doc

实 验 教 案
课题(项目)名称: 果酒的发酵实验
计划学时: 1周
实验类型: 1.演示性□ 2.验证性□ 3.综合性□ 4.设计性√ 5.其它□
授课日期: 2014年 5 月 26 日
第 13 周 星期 一 第 5、6 节
一、实验目的
1、在实验室条件下制作果酒，研究利用果酒酵母发酵的方法和基本的操作技能。
2、通过自己亲手制作果酒，学习到果酒制作的简单过程，并了解微生物发酵过程中所需的各种条件。同时通过亲自动手，培养我们严谨的科学态度，勇于探究的精神，提高我们观察、思考、总结等能力以及学科学、用科学的基本素养，培养我们与人交流、与人合作的能力。
二、实验原理
酿酒酵母在厌氧、PH3.5-4.5左右条件下，通过EMP途径将每分子葡萄糖分解为2分子丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化下脱羧生成乙醛；再以乙醛为受氢体，在醇脱氢酶催化下，接受EMP途径中3-磷酸甘油醛脱下的NADH2的氢生成2分子乙醇、2分子CO2并净得2分子ATP。总反应式为：
C6H12O6+2ADP+2Pi→2CH3CH2OH+2CO2+2ATP
在发酵过程中有许多指标发生变化，主要包括比重、PH、温度等。
1、糖浓度检测方法：手持式折光仪

使用方法：

1)将折光棱镜①对准光亮方向，调节目镜视度环⑤，直到标线清晰为止；
2)调整基准：测定前首先使标准液(纯净水)、仪器及待测液体基于同一温度。掀开盖板②，然后取1~2滴标准液滴于折光棱镜上，并用手轻轻按压盖板②得出一条明暗分界线。旋转校准螺栓③使目镜视场中的明暗分界线与基准线重合(0%)；
3)掀开盖板②，用柔软绒布擦净棱镜表面，取1~2滴被测溶液滴于折光棱镜上，盖上盖板②轻轻按压，读取明暗分界线的相对刻度，即为被测液体的含量；
4)测量完毕后，直接用潮湿绒布擦去棱镜表面及盖板上的附着物，待干燥后，妥善保存起来。
2、比重检测方法：比重计
使用方法：
1）、取玻璃体的容器或其他透明的容器，将需要测量的液体导入容器内；
2）、将比重计轻轻放置容器液体中，待比重计稳定后读取数据；
3）、读取数据后，把已测量的液体倒回原封装箱的容器中；
4）、使用酒精清洗容器和比重计后，保管好，待下次使用.
注意事项：
1）、导入液体时，要注意注入量，以防溢出；
2）、读取数据时，一定要待比重计稳定后才能读取，以防出错；
3）、比重计使用一年后，要由第三方校对后方可使用；
4）、比重计的读取，一般每支比重计的数据范围为0.100；
5）、比重计的度数与温度有关，温度越高、比重越小，反之比重会增加。
3、PH值检测方法：PH计
使用方法：
1）、将机器预热30min,并用温度计测量被测溶液的温度，读数，例如25℃。调节温度旋钮至测量值25℃。
2）、调节斜率旋钮至最大值。
3）、用吸水纸仔细将电极头部吸干，将复合电极放入混合磷酸盐的标准缓冲溶液，使溶液淹没电极头部的玻璃球，轻轻摇匀，待读数稳定后，调定位旋钮，使显示值为该溶液25℃时标准PH值6.86。
4)、将电极取出，洗净、吸干，放入邻苯二甲酸氢钾标准缓冲溶液中，摇匀，待读数稳定后，调节斜率旋钮，使显示值为该溶液25℃时标准PH值4.00。
5）、取出电极，洗净、吸干，再次放入混合磷酸盐的标准缓冲溶液，摇匀，待读数稳定后，调定位旋钮，使显示值为25℃时标准PH值6.86。 取出电极，洗净、吸干，放入邻苯二甲酸氢钾的缓冲溶液中，摇匀，待读数稳定后，再调节斜率旋钮，使显示值为25℃时标准PH值4.00。
6）、取出电极，洗净、吸干。重复校正，直到两标准溶液的测量值与标准PH值基本相符为止。
7）、校正过程结束后，进入测量状态。将复合电极放入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇匀，待读数稳定后，记录读数。
8）、完成测试后，移走溶液，用蒸馏水冲洗电极，吸干，套上套管，关闭电源，结束实验。
4、温度检测方法：温度计
使用方法：
1）、先估测被测液体的温度。
为了测量的准确和读数的精确，不同的温度，选择不同的温度计
2）、 观察温度计的量程和分度值。
量程就是温度计的测量范围，分度值是指温度计上面每个小格代表多少，它决定了测量的精确程度
3）、 测量
液体温度。要让温度计的玻璃泡完全浸没在被测液体中，不要碰到容器壁和容器底；温度计的玻璃泡浸入被测液体中药稍后一会，待温度计的示数稳定以后再读数。
4）、读数
  读数就是读出温度计的最终测量结果。读数的时候要让温度计的玻璃泡继续留在被测液体中，并且视线要与液柱的上表面向平
三、实验器材和试剂
1. 仪器：1L玻璃瓶，1L玻璃烧杯、纱布、温度计、比重计、天平、烧杯、量筒、PH计、果汁机等。
2. 试剂：亚硫酸（6%）、白砂糖、活性干酵母，果胶酶。
3. 水果：米易“巨峰”红葡萄，三斤（约八元/斤）。
四、实验步骤
1.原料处理：
1）、将1L玻璃坛与1L玻璃瓶充分洗干净，控干（此处用1％的H2SO3对发酵仪器进行消毒）。
2）、将葡萄摘除坏珠、瘪珠，浸泡，然后冲洗干净、晾干。
3）、把手洗干净，用果汁机将葡萄肉打碎，用2L玻璃瓶装取葡萄汁1.6L加入2L玻璃坛中，本次是以100%纯果汁为主要原料制作酒精度为11°干红葡萄酒，因此并不额外补加纯水。
2.配料：本次葡萄酒的酒度要达到11°为准，酒度的生成以1.7%糖浓度生成1°酒精，估测出纯葡萄汁糖度在15%左右，依此为计算数据可得如下：
达到11°葡萄酒理论所需糖量：1700ml×1.7%×11=317.9g
实际纯葡萄汁所含糖量：1700ml×15%=255g
所需添加糖量：317.9-255=62.9g
3. 活化：
①酵母活化：添加酵母，按照400mg/L的量用分析天平称取酵母520mg，将其活化。
活化条件：放入三角瓶中，加入40℃、50mL、5%蔗糖水溶液，活化20分钟。
②果胶酶活化：按照40mg/L，用分析天平称取果胶酶52mg，在常温活化10分钟。
4. 装瓶：装瓶总量约为瓶容的75％，同时按汁量加入65mg/LS02 48.75mg搅匀，亚硫酸的浓度为6%。接种后测果汁浓度、PH、比重、温度。
5.发酵：开始发酵之后每天上午十点分别测量一次比重、温度，PH，并进行记录，同时搅拌，观察发酵情况，鉴于攀枝花室内气温偏高，所以采用湿布包裹的方式控温至22～24℃。
6．当前酵结束时，出酒，同时压榨皮渣，混合、控温20～22℃，进行后发酵管理。
7. 当相对密度降到0.993 - 0.998时，酒精发酵结束。
8. 贮藏：换瓶，满瓶、加入H2SO3终止反应，用6%的H2SO3终止反应加入65mg/LS02，则算为6%H2SO3的用量为：
(已知)每一升发酵液添加H2SO 1.25ml
故H2SO3用量为1700×1.25=2.125ml
则本次试验加入6%H2SO3 2.125ml。
表1 前发酵过程中指标的变化记录表
时间/天
1
2
3
4
糖浓度
6.5
4.5
4.0
3.5
比重
1.162
1.022
0.992
0.992
PH

温度
27.5℃
26℃
26℃
26℃

发酵情况

无明显反应
发酵液中产生大量气泡，葡萄渣逐渐下沉，发酵液颜色加深。
发酵液气泡产生量明显减少，葡萄渣基本下沉，果皮呈白色并浮于液面上方
发酵液几乎无气泡产生，发酵液逐渐澄清。
过滤时间 6月10日 比重 0.992
过滤时果汁的量 1356ml 过滤渣的质量 324.6g
温度 26℃ 发酵情况 发酵液几乎无气泡产生
表2 后发酵过程中指标的变化记录表
时间/天
5
6
7
糖浓度
3.0
3.0
3.0
比重
0.991
0.991
0.991
PH

温度
24℃
24℃
24℃
发酵情况
发酵坛无明显反应，
发酵液基本澄清。
无明显反应
无明显反应
五、注意事项
1、各种容器、设备及与果汁接触的玻璃仪器必须先清洗干净，然后用1%浓度亚硫酸（6%）消毒，使用后及时清洗。
2、应当将发酵温度控制在20~24℃范围内。因为温度对酵母菌的繁殖有很大的影响。温度低于10℃，酵母菌发育很缓慢。随着温度的升高，繁殖速度加快，22℃时为最佳繁殖温度，此时酵母菌生殖速度快，生活力强。超过35℃，酵母菌生长受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，开始出现死亡。如果想要获得高酒精浓度的发酵液，减少酒精的消耗，必须控制好发酵温度。
3、根据实验要求，实验小组应先通过上网搜索，查阅相关书籍，展开小组内的讨论和交流等方式，确定各自实验方案，各小组不得完全相同。实验方案包括水果品种、数量、加工方式、水和糖添加量、前酵结束选择条件、后处理方法等。

六、思考题
1、根据实验结果，画出发酵指标变化曲线图，分析发酵过程中各指标变化的关系。
日期
糖度
比重
温度/℃
7号
16.5
1.162
27.5
8号
4.5
1.022
26
9号
4
0.992
26
10号
3.5
0.992
26
11号
3
0.991
24
12号
3
0.991
24
13号
3
0.991
24
（1）糖度变化：

葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原料经酵母菌酒精发酵而成的低度酒，在这个酿造过程中，葡萄浆果里的糖，经酵母菌的作用，分解为酒精及其副产物。在发酵前期，酵母生命活动剧烈，代谢旺盛，所以糖耗量较大，糖度减少量大，但当进入发酵后期，发酵进入平稳期及后期酵母生命活动逐渐减弱并逐渐死亡，所以糖度变化量较少直至后期不再改变。

（2）比重变化：

葡萄汁比重与葡萄酒潜在酒度(酿成酒后的酒精含量)之间的关系为:比重每增加0.001对应的酒精度提高1%～2%,平均1.5%[1-2]。发酵过程中发酵液的糖浓度逐渐降低,酒精浓度升高,使得发酵液密度发生变化。密度下降实际上是发酵液中还原糖消耗、酒精浓度增加后的综合外在表现，即表象是比重下降，其本质是发酵液中糖消耗、酒精度增加的结果。所以发酵前期，发酵较剧烈比重减少，变化值值较大，随着发酵进行，发酵逐渐进入后期，比重继续降低直至不变，但变化较缓慢。
（3）温度变化：

温度控制影响整个发酵过程，因为温度高于29℃，酵母菌发酵变得缓慢，在大约38℃时基本上停止活动，这会导致葡萄酒留有残糖，并成为生物不稳定因素，同样高温会引起酵母毒素的产生，酒精损失增大，生成量降低，并且过高的热量积累，葡萄酒的不稳定性产生。本次由于在室温下进行，并未刻意维持发酵温度，所以温度变化对发酵带来一定影响，发酵前期酵母菌代谢旺盛，产生大量热量，所以发酵液温度高于室温。发酵后期酵母菌代谢减弱，发酵温度与室温持平。

2、如何确定果酒发酵过程的皮渣分离时间。

答：发酵逐渐转为平缓，葡萄皮浮在上面，颜色由深变浅，葡萄肉的残渣沉在瓶底，当发酵汁含残糖达到5g/L以下时，此时可以把残渣和酒液分离。
3、如何判断发酵果酒实验是否成功。
答：发酵后取样，通过嗅味和品尝进行初步鉴定。此外，还可用显微镜观察酵母菌，通过观察相关微生物的存在或数量变化进行鉴定，并用重铬酸钾检验酒精的存在，

实验总结
本次实验中，进一步了解了葡萄酒发酵机制及发酵过程各项指标变化及变化原因，熟练掌握了比重计以及糖度仪的使用，并对通过对颜色、气味、口感等外观观察，本次实验产品颜色呈石榴红，具有葡萄自带果香以及发酵过程产生的酒香,口感略微苦涩，可能是发酵时间不足，导致单宁含量高于标准值，口感适中，酒味薄弱，并且也从糖度值间接反应出酒精度适中，产品基本上符合11°干红特征，表明本次葡萄酒发酵实验合格。但由于初次接触发酵实验操作，在实验操作过程中存在流程不熟练的问题。并且由于室温发酵，无法控制发酵温度，对实验存在一定影响，而所使用葡萄为常见鲜食葡萄而并非专用酿酒葡萄，比表面积较小，所以葡萄酒颜色较浅。