电穿孔SCIENTZ-2C说明书.doc

SCIENTZ-2C基因导入仪

使
用
说
明
书

宁波新芝生物科技股份有限公司
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SCIENTZ-2C基因导入仪使用说明书

一、概述
高压脉冲基因导入仪，广泛用于植物、动物和各种微生物的各类细胞电穿孔，可以进行细胞杂交、细胞融合，基因导入的研究。
本系统结构紧凑，采用电脑(CPU) 控制, 使用方便,安全可靠。
★注意：
1. 本仪器为高压装置，使用仪器前请仔细阅读说明书，必须按说明书方法安装和使用。
2 .在各项准备工作完成后再开机，使用完后须及时关机, 避免长时间空开；充完电后，应及时进行导入操作或者放电，避免长时间处于充电状态。
3 .防止液体溢出洒在仪器上。
二、原理
１．仪器的组成
本仪器由SCIENTZ-2C基因导入仪主机和基因导入杯及专用连接线等组成。
电路构成由控制电源、高压电源、高压整流、储能电容（有高压电容和低压电容）、并接电阻、充放电回路、CPU控制、显示电路以及导入杯（溶池）等部分组成。
电子开关
电子开关
如图：
高压电源 高压整流 电子开关

高压储能电容

储能电路 放电回路 导入杯
高压储能电容
电源

分压取样

CPU控制电路
并接电阻选择
控制电源 CPU控制电路

显示电路

２．工作原理
导入杯（溶池）内放置经过适当处理的细胞溶液（含基因），接入仪器的高压脉冲输出端，选择适当的电能量（）：由储能电容和储能电压的平方乘积确定），选择适当的放电阻抗（以RC放电时间常数作参考）以瞬间放电（指数式衰减）的形式可逆击穿细胞壁，达到基因导入细胞之目的。
三、技术参数
1、储能电容
A.高压储能电容：1μF、5μF、25μF 以及它们的组合如6μF、26μF、30μF和31μF共七档，自由设置；
B.低压储能电容：25μF、50μF、100μF、200μF、400μF、800μF以及它们的组合如125μF、150μF、175μF、200μF --直至1575μF共63档自由设置. 最小25μF, 以25μF为步长递进；
2、储能电压
A.使用高压储能电容时，储能电压可从401V～2500V，自由设置,精度为1V；
B.使用低压储能电容时，储能电压可从10V～400V，自由设置，精度为1V；
3、放电并接电阻：50Ω(固定)、50Ω、100Ω、200Ω、Ω400Ω、800Ω和∞以及它们的组合如50Ω、100Ω、150Ω 直至1600Ω共32档，自由设置。最小50Ω最大1600Ω, 以50Ω步进. 另有无穷大档可供选择.
4、使用电源：单相220V，50HZ，100W。
静态RC放电时间常数（RC理论值，忽略细胞溶液阻抗）
以下测试条件（低压：300V，高压：2000V）
RC(ms)R(Ω)C(mf)
1.0
5.0
25.0
100
200
400
600
800
1000
1500
50
0.05
0.25
1.25
5
10
20
30
40
50
75
100
0.10
0.50
2.5
10
20
40
60
80
100
150
200
0.20
1.0
5.0
20
40
80
120
160
200
300
300
0.30
1.5
7.5
30
60
120
180
240
300
450
400
0.40
2.0
10.0
40
80
160
240
320
400
600
500

0.50
2.5
12.5
50
100
200
300
400
500

750
600
0.60
3.0
15.0
60
120
240
360
480
600
900
700
0.70
3.5
17.5
70
140
280
420
560
700
1050
800
0.80
4.0
20.0
80
160
320
480
640
800
1200
1000
1.00
5.0
25.0
100
200
400
600
800
1000
1500
1500
1.50
7.5
37.5
150
300
600
900
1200
1500
2250
（注：在高压放电时，实际的RC常数要远小于上表的参考值）
四、仪器面板、后板结构及功能
1.前面板

2.后面板

电源插座
五. 参数设置步骤
（一）开机后液晶LCD显示0，此时按“C”键进入设置界面（如下图所示）

图5.1 按“C”后进入设置界面
（二）参数设置
１、电压参数设定（U）
a.进入设置界面后，按电压设置键“U”，进入电压设置窗口（如下图所示），
可以输入所需的电压值。
b.按“PT”键确认（参数被确认后电压数组中会出现“.”）。如输错可按“0”按钮清除数据后，重新输入再次按“PT”键确认即可；或者多次按“0”键，直至显示区域只显示0；

图5.2_1 设置电压第二组参数200V，按“PT”调用
c.在电压设置界面中，可按“U”键来切换预存参数（U1到U5共5组参数），按“PT”键即可调用（参数被调用后，电压数组中会出现“.”）；
d.被调用的该组参数，经过导入动作后，会覆盖原先改组的参数，下次只需调用该组参数，而无需再此输入
２、电阻参数设置（R）
按“R”键进入电阻参数设置，设置基本设置方法，跟电压设置方法一样，设置范围为50～1600欧姆（每50欧步进）
电阻也R1～R5五组参数，也可保存和调用预存参数；
３、电容参数设置（C）
按“C”键进入电容参数设置，设置方法同上，电容设置分为高压储能电容和低压储能电容两种（具体设置方法再下文『设定数据的范围』介绍）
（三）、设定数据的范围
电压、电容和电阻三个参数的设定范围各不相同，下面分别作说明。
1、电压：设定范围为50～2500伏,辨别率为1伏。低压50-400V, 高压401-2500V.
2、电容：分为高低压两档，高压分为:1,5,6,25,26,30,31μF共七档。低压从25μF开始到1575μF，每25μF步进一档，且只有当设定的数值达到或超过该档时才会有效。
3、 电阻：电阻的设定范围为50~1600欧姆(每50欧姆步进一档) 另有无穷大档(设0即
为该档). 设置时,只有设定的数值达到或超过该档时才会有效。

（四）导入操作
４、电压（U）电阻（R）电容（C）设置完后，就可以按“RD”键进行储能(过程如下图所示)

图5.2_2 存能过程（从1%到99％,当到达99%即表示储能完成）
5、储能完成（界面显示“L 99”），按“RD”即进行导入动作
6、导入动作后，界面会显示本次导入时间（时间常数），如下图所示

图5.2_3 时间常数显示
5、导入动作后，需按“U”键返回到设置状态中，来进行新的设置；如无需根改参数，直按“RD”键，仪器按前一次设置进行储能

注意事项：
1、每一个数字键按下都有“嘀”的声音提示，如没有声音则表示按钮并未完全按下，输入无效。
2、如听到“嘀”、“嘀”两声提示音则表示输入数据超出范围需重新输入（在设定电容、电阻参数时）。

六、使用注意事项
1、仪器若长期未使用在重新使用时，应先低压充电、放电，逐步升高电压，直至额定值。在仪器使用时,应先通电予热10-15min,设置数据,进行几次充电放电空操作后,才可正式进行导入操作。
2、仪器的输出连接线、接线座等处在放电时有高电压、大电流存在。故在使用时，应避免与人体、导体（如液体）或易受干扰的电器等接触靠近。
3、 仪器内有高电压（2500V）存在，非专业人员，不得打开检修。如有故障请与我单位
有关技术人员联系。
4、 实验中如果出现溶池发生弧光,溶液爆溅出来说明电压设置太高或电容太大,应相应
降低电压、电容的设置值。

七． 新芝基因导入仪实验参考技术参数
品种
电压
电容
电阻
导入盒
转化率
反馈用户名
酵母
1200-1500V
25µF
200-400Ω
2mm
2.2-3.2*102cfu/ug DNA
上海肺科医院
大肠杆菌
1250V
5µF
400-1000Ω
1mm
107-108cfu/ug DNA
清华大学
大肠杆菌
1100V
10µF
500Ω
1mm
2500cfu/ug DNA
清华大学
大肠杆菌
1500V
25µF
400Ω
2mm
2500cfu/ug DNA左右
解放军总医院
羊细胞
250V
500µF
500Ω
4mm
102cfu/ug DNA
中科院发育所
毕赤酵母
1500V
25µF
400Ω
2mm
1.8x103cfu/ug DNA
华东师范大学
枯草芽
孢杆菌
1250V
25µF
400Ω
2mm
102cfu/ug DNA
华东师范大学
（因各单位实验条件不尽相同，以上实验参数仅供参考）

八． 操作过程
1、按上图所示，连接好仪器电源、导入盒（接输出插孔）等。
2、将配有相应细胞液的导入杯装入导入盒内（细胞液一般用双重去离子水价甘露醇或葡萄糖等，浓度为10%～20%，电阻在3千欧左右）。
3、 打开电源开关，仪器通电，显示器有显示。按“参数设置步骤”的方法。设置实验
所需的技术参数时，应先按储能电容(C)再按储能电压（U）最后按放电电阻(R)的具体数值，然后按RD键按一下即可，当屏幕中充电进度显示“99”时，按RD键进行导入，听到锋鸣器响声后，此时显示屏显示的是时间常数。
电脑便进行储能电压, 储能电容, 放电电阻的选取及对所选定的储能电容充电,当充电电压稳定到所设置的电压值后, 按RD键进行导入，立即向输出端(包括导入盒和所选定的放电电阻的并联电路)释放高压脉冲，进行有一定时间常数的放电过程，即电击穿、融合、导入过程。（选择储能电压值、电容值和放电电阻值，是为了选取恰当的电能量和放电（RC）时间常数，以期获得刚好使细胞壁可逆击穿，基因导入融合的最佳效果。这是十分重要的。因为影响因素很多，要想获得高的转换率，必须依靠自己长期实践经验的积累。）
4、 若需二次放电，只要按U，然后再次按RD键即可。若要修改参数，则重复上述（3）的操作过程，可获得多次放电效果。
5、 若停止使用，可关电源开关，切断输入电源，取出导入杯。为安全起见，应在关断电源后，再取出为妥。
九、大肠杆菌基因导入（参考资料）
用基因导入仪进行基因转化很有效。用生长旺盛的细胞，可使1ug质粒DNA
[材料]
E． coli单菌落
LB培养基
10%冰冷的甘油(丙三醇)
Scientz-2C基因导入仪
含抗菌素的LB平板
冰水
SOC培养基(0.5%酵母提取物,2%蛋白胨,10mmol/L Nacl,20mmol/L MgSO4,
2．5mmol/L KCl,20mmol/L葡萄糖,10mmol/L MgCl2)
[方法]
（1）将E.coli单菌落接种于5mlLB培养基中,在37℃下振荡培养过夜。取2.5ml新鲜培养液倒入500mlLB培养基（用2L三角瓶）中，在37℃下振荡（300rpm）培养至细胞对数生长期（OD600为0.5-0.6）。
（2） 将培养物在冰水中放置30分钟使细胞停止生长，然后倒入预冷的离心管中，在4℃下5000g离心10分钟，弃去上清液。
（3） 用100ml预冷10％甘油重悬细胞，4℃ 5000g离心10分钟，弃去上清液。
（4） 重复步骤（3）。
（5） 用5-10ml预冷10％甘油重悬细胞，100-200µl/管分装于无菌的1.5ml eppendorf管中，保存于-80℃。
（6）将基因导入仪的参数调至2.5Kv，25uF，脉冲阻抗控制在200-1000欧姆。
（7）加入不大于5ul质粒DNA(5pg-0.5ug)和步骤(5)处理的新鲜细胞或冰冻细胞（融化后置冰上）混合（增加DNA样品体积会盐浓度加大，易产生电弧，转化率下降）。将混合液转到预冷的导入杯中，抹去杯外冰水后放入样品槽中。
（8） 释放电脉冲，取出导入杯立即加入1mlSOC培养基，并用吸管将菌液转至无菌小管中。在37℃下，缓慢振荡培养30-60分钟。
（9） 将上述转化细胞的培养液涂于抗菌素的LB平板上。
[注意]
（1）该法的关键是用适当的电压、电容值和适当时间常数的电脉冲。用对数生长的细胞进行的转化效率比稳定生长期的细胞高。
（2） 该法的优点是：转化效率高。尤其对一些较大的质粒，采用该法可获得较好的
结果。实践已经证明，当质粒达14kb时，转化效率不会产生明显下降。
（3） 释放电脉冲，取出导入杯立即加入1mlSOC培养基，并用吸管将菌液转至无菌的
小管中。在37℃下，缓慢振荡培养30-60分钟。
（4） 将上述转化细胞的培养液涂于抗菌素的LB平板上。
[实验结果]（使用Scientz-2C基因导入仪）
材料: PUC18质粒1UL 0.1UGDNA
转化率
BL 21
2-3×10
JM 109
2-3×10
DH 5a
1×10
HB 101
2-3×10

[应用举例条件]：导入杯2mm (一次性使用)
电压 2.5kv
电容 25uf
电阻 400-1000Ω
PUC 18质粒转化率（BL 21菌株）
电 阻
400
800
1000
转化率
1×10
1.5×10
2-3×10

十、装 箱 清 单

1、SCIENTZ-2C基因导入仪主机 1台
2、保险管3A 2只
3、质量保证书（保修卡） 1份
4、合格证 1份
5、使用说明书 1份
6、2mm基因导入盒（进口） 1只
7、电源线及连接线 各1副

Scientz-2C基因导入仪简易实验步骤
1、收集细胞：用胰酶消化细胞，将细胞培养液吸入到15ml离心管中，分为6管，900rpm 5min，弃其上清。
2、用不含血清的培养液洗一次，弃上清。
3、各取5ul质粒Red 分别加入到100ul电缓冲液中，充分混匀。
4、分别各用100ul混有质粒Red的电转缓冲液充分溶解细胞，转入2mm电转导入杯中。
5、将电转导入杯放入样品槽中，释放电脉冲。
6、立即取出电击杯，分别用一次性吸管将混和液转移至加有DMEM培养基的一次性细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
备注：为了使实验达到更好的效果可以选购晶赛公司的电转缓冲液。
例：做293细胞，设电阻为00Ω，电容为500µF，电压为250V，成活率较高。
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