实时荧光定量PCR检测临床上的运用与意义.pdf

实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 检测临床上检测临床上的的运运用与意用与意义义 叶明奇（厦门安普利生物工程有限公司，福建 厦门 343，技术工程部）【摘要】【摘要】目的分析临床使用实时荧光定量 PCR 法在临床检测的各个项目情况，并探讨实时荧光定量 PCR 法的临床意义。主要介绍核酸 DNA 或 RNA 的提取、实时荧光定量 PCR 技术以及实时荧光定量 PCR 方法临床运用的意义：乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量检测在临床诊断中的应用、实时荧光 PCR 检测丙型肝炎病毒核酸及其临床应用、实时荧光定量 PCR 法在检测血浆结核杆菌 DNA 的临床应用、实时荧光定量 PCR 检测 HPV 病毒的临床运用、泌尿生殖道感染沙眼衣原体的临床应用、传染性疾病检测临床应用、测胰腺癌中 HIF1、VEGF 和bFGF 的表达及其临床意义、绵羊肺腺瘤病毒检测、胃癌淋巴结微转移敏感且特异的方法，实时荧光定量 PCR 法在临床检测的运用在临床分期、判断预后以及治疗方案选择具有重要意义。【关键词】【关键词】实时荧光定量 PCR；乙型肝炎；丙型肝炎；传染性疾病；HPV；MTB；AbstractAbstract Objective using real-time fluorescence quantitative PCR method in clinical detection of each project,and to explore the clinical significance of real-time fluorescent quantitative PCR method.Mainly introduces the nucleic acid extraction of DNA or RNA,real-time fluorescent quantitative PCR and real-time fluorescence quantitative PCR method for clinical application significance:hepatitis B virus DNA by real-time fluorescent quantitative PCR assay application in clinical diagnosis,real-time fluorescent PCR detection of hepatitis C virus nucleic acid and its clinical application,the real-time fluorescence quantitative PCR assay in the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in plasma clinical application,real-time fluorescence quantitative PCR detection of HPV virus,the clinical application of urogenital Chlamydia trachomatis infection in the clinical application of infectious diseases,clinical application,measured in pancreatic cancer HIF1,VEGF and bFGF expression and its clinical significance,sheep pulmonary adenomatosis virus detection of lymph node micrometastasis,sensitive and specific method,real-time fluorescence quantitative PCR method applied in clinical detection in clinical staging,prognosis and treatment options have important significance.keywordkeyword real-time fluorescence quantitative PCR;hepatitis B;hepatitis C virus;infectious diseases;HPV;MTB;PCR法最初由Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。此想法的提出在1983年,美国Cetus公司Mullis博士发明了PCR技术,使Khorana的设想变成实现。1985年，美国PerkinElmer Cetus公司发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase chain reactionPCR)，人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。随便人类对PCR法的研究深入1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入了PCR技术，使PCR技术的应用价值大大提高。1989 年美国Science杂志列 PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻 1989 年为 PCR 爆炸年。国际为表彰 Mullis 在 PCR 的发明，Mullis 荣获 1993 年度诺贝尔化学奖。随便PCR技术的运用在医疗检测的方面推广，已经作为一标准取代细胞法的“金标准”，目前实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。与普通的PCR相比。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优式，RTFQPCR相比传统的PCR具有以下重要优点：它使用荧光基团对PCR每个循环中的扩增产物进行实时监测，操作简便且具有很高的敏感性和特异性；实现了定性到定量分析的飞跃；DNA扩增及其分析过程均在同一封闭系统中完成，避免了样品和产物的污染，且不需要复杂的产物后续处理从而能得到可靠和可重复性的结果；动力学范围宽，允许对样品的靶序列进行不同数量级的分析。目前应用实时荧光定量PCR检测在临床的项目很多如：实时荧光定量检测的含量的方法，探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值；运用实时荧光PCR检测技术在丙型肝炎病原诊断及在监测干扰素一a治疗慢性丙型肝炎早期病毒学应答反应(EVR)中的临床意义；实时荧光方法在传染性疾病检测研究中的应用；实时荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体的临床应用；实时荧光定量 法在检测血浆结核杆菌 的应用及价值；实时荧光定量PCR检测宫颈癌患者HPV病毒负载量的研究等等。1.1.资料与方法资料与方法 1.11.1核酸核酸D DN NA A的提取的提取资料与方法资料与方法：1.1.1DNA提取的经典方法：即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。1.1.2 胍盐提取结合二氧化硅吸附法：二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中 DNA 和 RNA。目前厦门安普利生物工程有限公司采用此固相吸附法可以在保证结果的前提下，省去许多繁琐的操作。1.1.3 TRIzol 试剂提取 RNA 方法：用 TRIzol 试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有 RNA，中间层含 DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。1.1.4 旋转离心柱提取：旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱各有特色。1.21.2 实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 技术技术资料与方法资料与方法：1.2.1实时荧光定量PCR的基本原理：样本核酸扩增呈指数增长在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比。由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过检测荧光量即可测定样本核酸量。通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值(cycle threshold)，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。在实时荧光PCR技术的发展过程中，2个重要的发现起着关键的作用：在20世纪90年代早期，TaqDNA多聚酶的5核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接检测PCR产物成为可能；此后，荧光双标记探针的运用，使得在一个密闭的反应管中能实时监测反应全过程。1.2.2实时荧光定量PCR类型和特点:根据RTFQPCR所使用的荧光化学方法的不同，荧光定量PCR技术主要分为染料法、荧光探针法。染料法中以SYBR Green I染料的应用最广泛。SYBR Green I能与所有双链DNA小沟结合，在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，能特异性地掺人DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。探针法是在待扩增区域结合上DNA探针，在PCR过程中，具有5一3外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。常用的探针法包括TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针和荧光标记引物。探针法因增加了探针的识别步骤，特异性更高，而染料法的优点是简便易行。1.2.3实时荧光定量PCR定量方法：RTFQPCR的模板定量包括相对定量和绝对 定量。前者是指在一定样本中的靶序列相对于另一参照样本的量的变化；后者指的是用已知标准曲线来推算未知样本的量。分为三种方式：1：标准曲线法的绝对定量；2：标准曲线法的相对定量；3：比较Ct法的相对定量。2.2.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR检测临床上的运用检测临床上的运用 2.12.1乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量检测在临床诊断中的检测在临床诊断中的应应用用 乙型肝炎病毒（）是乙型肝炎的病源体，感染人体是一个连续、动态的过程，平时我们所用的法检测的免疫标志物（、），可在一定程度上反映病毒是否处于复制状态，但是不可避复制过程，敏感性更强，特异性更高，通过探讨血清的与免疫标志物的相关性，符合性和补充性，从而进一步证实的检测在乙肝早期诊断，传染性识别，病毒复制水平判断以及抗病毒治疗效果，监测中的临床运用。2.22.2实时荧光实时荧光PCRPCR检测丙型肝炎病毒核酸及其临床检测丙型肝炎病毒核酸及其临床应应用用 丙型肝炎病毒是一种RNA病毒（HCVRNA），目前可分为6个不同的基因型及亚型，如1a、2b、3c等。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上。实时荧光PCR检测丙型肝炎病毒核酸是采用的实时荧光PCR定量检测丙肝病毒核酸是近年来新发展的PCR荧光检测技术，其与传统的Nested一PCR相比，后者以琼脂糖凝胶电泳加澳乙锭后于紫外灯下肉眼观察PCR产物，虽比较简单，但过于粗糙，且假阳性较多，亦无法量化，而实时荧光PCR检测技术则操作更简便，HCV一RNA逆转录与PCR可在同管一步扩增即能快速、特异地检测出被检标本中的病毒载量，并设有内标监控标本处理，逆转录及PCR全过程，有效地避免了假阴性，提高了实验的精确度;灵敏度提高约2个单位。因此，实时荧光PCR具有较强的敏感性和特异性，且由电脑分析数据，结果客观，易于判断。2.32.3实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 法在检测血浆结核杆菌法在检测血浆结核杆菌DNA DNA 的的临床临床应用应用 结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex,简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多器官系统，最常见的患病部位是肺脏，占各器官结核病总数的80-90%。也可以累及肝、肾、脑、淋巴结等器官。主要的传播途径有呼吸道、消化道、皮肤和子宫，但主要是通过呼吸道。排菌的肺结核病人痰液干燥后，细菌随尘土飞扬，被他人吸入而引起感染，人体吸入含有结核分枝杆菌的飞沫是否患病主要由吸入结核菌的数量、毒力、人体的抵抗力等多种因素有关。采用实时荧光定量 对 进行检测，其不但可以减少标本污染机会，而且可有效的避免了前处理，从而做到标本均一，而且可以做到标准化的定量检测，从而提高检测的特异性以及敏感性。2.42.4实时荧光定量实时荧光定量PCPCR R检测检测HPVHPV病毒的临床运用病毒的临床运用 人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，人乳头瘤病毒（hpv）感染越来越引起人们的关注。利用实时荧光定量PCR技术 对部分单一感染HPVl6 HPVl8 HPV58的宫颈癌病人进行了病毒负载量的检测 发现这几种高危型HPV的感染率与其病毒负载量之间的一些关系 为进一步研究高危型HPV致病机制提供了一些启示。对相对低危的型别如HPV58等感染进行防治 必须首先提高机体的免疫力 阻断HPVl6的持续感染 这样才能防治由HPVl6感染继发的其他高危型别HPV感染。2.52.5实时荧光定量孕实时荧光定量孕PCRPCR检测泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体的临床应用检测泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体的临床应用 沙眼衣原体是一种独立寄生于细胞内的微生物，含DNA和RNA，革兰染色阴性，只能在细胞内繁殖。CT是近年来最常见的性传播疾病病原体之一，主要引起男女泌尿生殖道感染，因此也越来越受到人们的注意。随着荧光定量PCR技术的发展，该技术已广泛运用于临床。PCR反应体系中加入荧光基团，它采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，给探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对CT核酸的自动化检测。利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CT值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量的特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高、易操作等优点。荧光定量基因检测方法可准确、灵敏地反映沙眼衣原体感染数量和治疗恢复情况，对沙眼衣原体诊断和疗效的观察具有重要的指导作用。2.62.6实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR临床检测的其它运用临床检测的其它运用 荧光定量PCR法作为一种核酸定量技术，具有高特异、高敏感的特点，除以上病原体外，FQPCR技术还可用于其他多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测。测胰腺癌中HIF1、VEGF 和bFGF 的检测、绵羊肺腺瘤病毒检测、胃癌淋巴结微转移敏感且特异的方法检测等等，用荧光定量PCR方法，对传染性性疾病检测临床淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和梅毒螺旋体等4种性病病原微生物进行定量测定。对实时荧光定量PCR技术在曲霉病诊断中的应用进，对TaqMan实时荧光定量PCR技术在口腔微生物定量分析中的进展进行了综述，等等。3 3.讨论讨论实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR检测检测意义意义 实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染的问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性的特点。实时荧光足量检测较检测法，有更好的灵敏度和特异性。能准确反映检测项目的核酸在体内的复制情况，对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后还是具有一定的临床价值。但时荧光定量PCR还存在以下不足之处：实验结果缺乏可比性。在标准曲线定量中标准品的制备是重要一环，由于没有统一标准，各实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。在定量一些不可培养的微生物时，可能要用质粒DNA的拷贝数换算才能得到某一微生物种类的丰度，其准确性值得探讨。对扩增产物缺少监控。FQPCR减少了扩增后电泳的检测步骤，因此不能监测扩增产物的大小。荧光化学物质种类和光源的局限性。由于荧光素种类和检测光源的局限性，相对地限制了FQPCR的复合式检测应用能力。定量方法本身的缺陷，如TaqMan探针淬灭不彻底、本底高、定量受酶性能影响、成本高；分子信标杂交时不能完全与模板结合，稳定性差、设计、合成时标记复杂；SYBR Green受非特异扩增的影响。基于实时定量荧光PCR的缺点，目前国内外很多医疗方面研发团队都致力于实时荧光定量PCR的的优化，如厦门安普利生物工程有限公司自主研发采用UNG防污染技术和荧光探针标记闭关检测技术等有效的控制了假阳性。各种优越的热循环仪和诊断试剂试剂运用在临床上检测，同时也是国内首用固态激光的9800PCR扩增仪，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染的问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性的特点。目前荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，它采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，给探针能与引物扩增区域中间的一段DNA或RNA发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对DNA或RNA核酸的自动化检测。利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CT值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。它利用了PCR对核酸的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量的特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高、易操作等优点。因此，荧光定量PCR法作为一种核酸定量技术，具有高特异、高敏感的特点，值得推广。1 李国利实时荧光定量 技术及在结核病诊断实验室的研究和应用临床肺科杂志，（）：2 郑怀竞,国内基因扩增技术的进展.中国医药导刊，2001;3(4):303-303 3 邹红霞，梁国鲁.实时荧光定量PCR及其在传染性疾病检测中的应用J.生物技术通讯.doi：103969jis8n10090002201105035 4 徐亚军，周子人，林琳，等分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究册四川大学学报，2008，39(4)：66l663 5 马继红，于海，周艳君，等 快速检测A型流感病毒的TaqM实时荧光定量RTPCR方法的建立叨 中国动物传染病学报，2010，18(3)：17 6 胡孝面，王铎阳Mn实时荧光定量PcR技术在口腔微生物定量分析中的应用研究进展叽牙体牙髓牙周病学杂志，216(11)：652654 7 王晓东，李风焕荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物【J】中国社区医师医学专业，20lO22：187 8 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