TCF-4在肺癌中高表达并与肺癌的进展有关.pdf

http:/ -1-TCF-4 在肺癌中高表达并与肺癌的进展有关在肺癌中高表达并与肺癌的进展有关1 杨连赫，徐洪涛，刘洋，赵月，苗原，杨志强，刘楠，王恩华 中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳(110001)E-mail： 摘摘 要：背景与目的要：背景与目的 T 细胞因子 4（T cell factor-4，TCF-4）是 Wnt 信号传导通路的重要分子，但其 mRNA 及蛋白在肺癌组织及细胞系中的表达情况和意义的相关研究较少。本研究的目的是检测 TCF-4 在肺癌组织和细胞系中的表达情况，并探讨其与肺癌的临床病理因素和生物学行为的关系。方法方法 采用免疫组织化学（S-P 法）检测 120 例肺鳞癌和肺腺癌患者及 10 例癌旁正常肺组织中 TCF-4 的表达；应用免疫荧光法检测肺癌细胞系及 HBE（人正常支气管上皮）细胞系中 TCF-4 的表达水平及亚细胞定位；应用 RT-PCR 方法检测九种肺癌细胞系中 TCF-4 mRNA 的表达水平。结果结果 在 120 例肺鳞癌和肺腺癌组织标本中，96例为 TCF-4 高表达（80.0%），其中包括 37 例同时有细胞浆和核表达（30.8%）。TCF-4 的高表达水平与患者的 TNM 分期正相关（P=0.022），10 例癌旁正常肺组织无 TCF-4 表达。免疫荧光显示 TCF-4 蛋白在正常支气管上皮细胞系中表达极弱，而在肺癌细胞系中则出现明显的表达，主要定位于细胞核。TCF-4 的 mRNA 在不同组织学类型的肺癌细胞系中的表达并不一致，巨细胞癌细胞系中相对较高，而腺癌细胞系中表达较低。结论结论 TCF-4 的高表达与肺癌的进展密切相关。关键词：关键词：T 细胞因子 4，肺癌，TNM 分期，免疫组织化学，免疫荧光 中图分类号：中图分类号：R361 Wnt 信号传导通路是一种对胚胎发育起重要作用的信号传导途径1，而其不恰当的激活参与了多种人类癌症的发病过程。此通路在结直肠癌，胃癌，肝细胞癌中都起着重要作用2。T 细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)是 Wnt 信号传导通路的主要信号分子。TCF/LEF 家族包括 LEF-1、TCF-1、TCF-3、TCF-4。其中 TCF-4 是 Wnt 信号传导通路的一个重要的分子，并且在肿瘤的发生过程中起重要作用3。Wnt 信号传导通路的激活需要-catenin 在细胞核内的聚集，并且与 TCF-4 结合形成复合物，此复合物可以诱导一些靶基因的转录，如 c-myc、cyclin D1、血管内皮生长因子（VEGF）等，而这些靶基因的激活对肿瘤细胞的增值、去分化、侵袭、转移等都起重要作用。已有研究表明在结肠癌、乳腺癌、结直肠癌中 TCF-4 的表达水平都很高4，但是 TCF-4 在肺癌中的表达情况却报道很少5，且样本例数较少。因此本研究采用 120 例的大样本肺癌组织标本检测 TCF-4 在肺癌组织中的表达水平，及其与肺癌临床病理因素的关系，同时检测 TCF-4 蛋白和 mRNA 在多种肺癌细胞系中的表达和定位，深入研究 TCF-4 与肺癌发生发展的关系。1 材料和方法材料和方法 1.1 材料材料 120 例肺鳞癌和肺腺癌标本及 10 例癌旁正常肺组织标本来自 1999-2006 年于中国医科大学附属第一医院行肺癌切除手术的患者。患者术前均未接受放化疗。患者平均年龄 58 岁（20-81 岁），其中男性 79 例，女性 41 例。肺癌标本根据世界卫生组织 2004 年的分类标准分为鳞癌 54 例，腺癌 66 例；其中高分化 27 例、中分化 43 例、低分化 50 例。68 例有淋巴结转移，依据国际抗癌联盟（UICC）1997 年修订的肺癌 P-TNM 分期标准：期 47 例，1 本课题得到国家自然科学基金(30670917)和教育部博士点基金(20040159008)资助。http:/ -2-期 18 例，期 49 例，期 6 例。9 种肺癌细胞系分别为：肺巨细胞癌细胞系 BE1；肺大细胞癌细胞系 NCI-H460（以下简称为 460）和 NCI-H661（以下简称为 661）；肺鳞癌细胞系 QG56 和 SK-MES-1（以下简称为 SK）；肺腺癌细胞系 A549、LTEP-2（以下简称为 LTE）和 SPC-A-1（以下简称为SPC）；肺小细胞癌细胞系 NCI-H446（以下简称为 446）。以人正常支气管上皮细胞系 HBE为正常对照。每种细胞都用含 10%的胎牛血清的 1640 培养基，PH 值保持在 7.2-7.4 之间，于含 0.5%CO2的 37孵箱内培养。TCF-4 兔抗人多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 生物技术公司；SP 超敏免疫组织化学试剂盒（KIT-9710）和 DAB 酶底物显色试剂盒（DAB-0031）购自福州迈新生物技术公司；Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；RT-PCR 试剂盒 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 购自大连宝生物（TaKaRa）公司1.2 方法方法 1.2.1 免疫组织化学免疫组织化学 所有切除标本均用 10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成 4m 切片，经脱蜡，脱苯，水化后，采用链菌素抗生物素蛋白过氧化物酶法（S-P 法）检测 TCF-4 蛋白表达情况。首先用 3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性，高温高压修复抗原，然后使用 TCF-4 一抗（1：100）4湿盒内孵育过夜，次日依次滴加生物素标记的二抗和链菌素抗生物素蛋白过氧化物酶，DAB 显色，苏木素复染。以 PBS 代替一抗作为阴性对照。判定标准5：每张切片在高倍镜下随机选取 10 个视野，当 TCF-4 表达阳性的肿瘤细胞数30%时该病例为 TCF-4 高表达，当 TCF-4 表达阳性的肿瘤细胞数30%的则该病例为TCF-4 低表达。当有 10%以上的肿瘤细胞核出现 TCF-4 阳性表达时该病例为 TCF-4 核表达。1.2.2 免疫荧光化学染色免疫荧光化学染色 将盖玻片放入无菌十二孔板中，将不同的细胞系分别传代至每个孔中并做好标记。36 h后取出，丙酮室温下固定 20 min。PBS 冲洗 3 次，每次 5 min（以下 PBS 冲洗方法相同），Triton-100 37 打孔 20 min，PBS 冲洗，非免疫动物血清 37 封闭 40 min，吸净血清后加入 TCF-4 一抗（1：100）4 过夜，次日 PBS 冲洗后避光加入 FITC 标记的山羊抗兔荧光二抗，37 孵育 30 min，PBS 冲洗，Hoechst 37 复染细胞核 20 min。PBS 冲洗后用 50%甘油封片。使用荧光显微镜（BX60,OLYMPUS）观察成像。1.2.3 RT-PCR 传代细胞在培养瓶中生长 2 天后使用胰酶（0.25%）消化细胞并离心收集，分别加入 400ul的 Trizol 试剂，提取每种细胞系的总 RNA，具体操作按生产商提供的说明书进行。总 RNA的纯度和浓度使用紫外分光光度计（UV-310,spectronic,UK）测定，经测定所用样品的A260/A280 比值都在 1.8-2.0 之间。反转录过程按说明书操作。PCR 引物序列分别为：TCF-4上游引物为5-CGAGGGTGATGAGAACCTGC-3,下游引物为 5-CCCATGTGATTCGATGCGT-3;-actin 上游引物为 5-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3,下游引物为 5-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3。TCF-4 和-actin 的 PCR 反应循环条件均为：94预变性 5min，94变性 40s，55退火 40s，72延伸 40s，30 个循环后于 72 延伸 5min。PCR 反应产物的大小分别是 444 bp(TCF-4)和 308 bp(-actin),PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，使用生物成像系统(UVP,Upland,CA,USA)成像和分析结http:/ -3-果。1.3 统计学分析统计学分析 采用 SPSS for Windows 13.0 统计分析软件进行分析，对 TCF-4 的表达与临床病理特征的关系采用卡方检验和确切概率法。P0.05 为有统计学意义。2 结果结果 2.1 免疫组化结果免疫组化结果 在 120 例肺鳞癌和腺癌组织中，有 96 例为 TCF-4 高表达（80.0%），其中包括 37 例同时有胞浆表达和核表达（30.8%）（图 1）。TCF-4 在 10 例癌旁正常肺组织中无表达。如表1 所示，TCF-4 的表达情况与肺癌患者的 TNM 分期显著相关（P0.022）。TCF-4 的表达水平与患者的性别（P=0.923）、年龄（P=0.762）、肺癌的分化程度（P=0.224）、组织学类型（P=0.142）及有无淋巴结转移（P=0.629）关系并不明显。TCF-4 的核表达与患者的临床病理学特征无相关性。2.2 免疫荧光结果免疫荧光结果 TCF-4 蛋白在肺癌细胞系中都有表达（图 2），在细胞中表达定位以细胞核为主，同时可见细胞浆表达。而在正常人支气管上皮 HBE 细胞系中，TCF-4 表达极弱，只有极少数细胞出现细胞核表达。2.3 RT-PCR 如图 3 所示，TCF-4 的 mRNA 在九种肺癌细胞系中的表达并不一致。首先在不同组织学类型的细胞系之间比较，TCF-4 在肺巨细胞癌 BE1 中的表达最高；在肺鳞癌 SK 和 QG56细胞系中表达较 BE1 少；在肺大细胞癌 661 和 446 细胞系中的表达水平与两种肺鳞癌细胞系基本相同；在肺小细胞癌 446 细胞系中表达水平中等；在肺腺癌 SPC、LTE 和 A549 细胞系中的表达最少。其次在同种组织学类型的不同细胞系中比较，TCF-4 mRNA 在 SK、QG56两种细胞系中的表达并无明显差别；在 460、661 两种细胞系中表达水平也较为一致；在 SPC、LTE，两种细胞系中表达水平相近，但同为肺腺癌的 A549 细胞系表达水平与前两者比略低。TCF-4 的 mRNA 在九种肺癌细胞系的总体表达水平按从高到低的顺序依次为：巨细胞癌、大细胞癌、鳞癌、小细胞癌、腺癌。其中腺癌细胞系的 TCF-4 mRNA 的表达水平与其它种类细胞系相比表达较低。3 讨论讨论 Wnt 信号传导通路通路的活性受多种蛋白的调节，其中-catenin 与 LEF/TCF 家族成员形成复合体是Wnt信号传导通路的关键调节因素之一6。TCF-4是这个家族的一个重要成员，在其 N 端有 53 个氨基酸序列与-catenin 有着很高的结合能力7。1996 年 Jurge8等发现-catenin 的入核过程是由 TCF 来完成的。TCF 家族包括 TCF-1、TCF-3、TCF-4 等，都具有高度保守的 HMG Box，属于细胞核内的一种转录因子，调控着下游基因的表达。其中 TCF-4在上皮组织中表达，与上皮细胞的发育、分化及肿瘤的发生密切相关。TCF-4 作为核内转录因子可携带上游信号分子-catenin 入核，并启动 c-myc，CD44，cyclin D1 等靶基因的表达，是核内基因调控的重要分子9，10。以往研究表明在肺癌组织中-catenin 在细胞膜表达明显减少，而细胞核的表达明显增http:/ -4-强 11，本次研究发现在肺癌组织中 TCF-4 也有很高的核阳性率，免疫荧光的结果也显示了肺癌细胞系中 TCF-4 主要定位于细胞核。Zhao 等12发现在肝癌细胞系 BEL-7402 中 TCF-4高表达，并且-catenin 在细胞核内聚集明显。这些结果提示，-catenin 与 TCF-4 在肺癌细胞核内的高表达能促进它们形成复合体，并激活 Wnt 通路的下游靶基因。本研究发现 TCF-4在肺癌中高表达，这与以往在乳腺癌，结肠癌，肾癌等恶性肿瘤的研究结果一致，在期和期的肺癌标本中 TCF-4 的表达水平明显高于期和期的肺癌标本，提示 TCF-4 表达水平能够反映肿瘤细胞的活性，并且与肺癌的进展相关。RT-PCR 的结果也显示，TCF-4 在不同组织学类型的肺癌细胞系中表达强弱不同。TCF-4 的 mRNA 在九种肺癌细胞系的总体表达水平按从高到低的顺序依次为：巨细胞癌、大细胞癌、鳞癌、小细胞癌、腺癌，其中腺癌细胞系的 TCF-4 mRNA 的表达水平与其它种类细胞系相比表达较低。这一结果进一步证实TCF-4 的表达水平能够在一定程度上反映肿瘤细胞的活动性，可能与肿瘤细胞的恶性程度和分化程度有关。有研究表明 TCF-4 在肾癌组织与细胞系 GRC-中强表达，而在正常肾组织与细胞系中不表达13，与先前研究相近，本次研究在癌旁正常肺组织中检测不到 TCF-4，在人正常支气管上皮 HBE 细胞系中观察到的 TCF-4 信号也极弱。TCF-4 在肺癌和癌旁正常肺组织、肺癌细胞系和正常支气管上皮中表达的强烈反差进一步证实了其与肺癌进展的关系。然而有研究结果表明，TCF-4 作为核转录因子在缺乏-catenin 的情况下，与 CEBP 结合蛋白 CBP 或Grouch 结合，对 Wnt 通路的下游靶基因起抑制作用，防止细胞的恶性转化14。最新的研究表明，TCF-4 在脑桥神经元的分化过程中起重要的作用15，所以在肺部肿瘤的发生过程中把TCF-4 单纯的定义为一种致癌细胞因子是不全面的，其在肺癌组织和正常肺组织中起到什么样的作用还有待进一步研究。近年来，已有学者将 TCF-4 视为肿瘤基因治疗的靶点。Nath 等人16发现 Asprin 在结肠癌中可以通过抑制-catenin 与 TCF-4 的结合从而阻止两者形成复合体而激活下游靶基因，从而达到了治疗结肠癌的目的。Boon 等人17也发现 sulindac（舒林酸）可以抑制-catenin在细胞核内的聚集而达到治疗肿瘤的目的。综上所述，TCF-4 的高表达与肺癌的进展密切相关，有效抑制 TCF-4 在肺癌中的高表达可能成为肺癌治疗的新途径。参考文献参考文献 1 Wodaza,Nusse R.Mechanisms of Wnt signaling in development J.Annu Rev Cell Dev Biol,1998,14:59-88.2 Lee YJ,Swencki B,Shoichet S,et al.A possible role for the high mobility group box transcription factor TCF-4 in vertebrate gut epithelial cell differentiation J.J Biol Chem,1999,274(15):1566-1572.3 Graham TA,Ferkey DM,Mao F,et al.TCF4 can specifically recognize beta-catenin using alternative conformations J.Nat Struct Biol,200l,8(12):l048-1052.4 Hovanes K,Li TW,Munguia JE,et al.Beta-catenin-sensitive isoforms of lymphoid enhancer factor-1 are selectively expressed in colon cancer J.Nat Genet,200l,28(1):53-57.5 LI Chun-yan,WANG Yan,CUI Ze-shi,et al.Expression of T cell factor-4 in non-small-cell lung cancer J.Chinese Medical Journal,2005,118(2):136-140.6 Shapiro L.Beta-catenin and its multiple partners:promiscuity explained J.Nature Stru Biol,200l,8(6):484-487.7 Omer CA,Miller PJ,Diehl RE,et al.Identification of Tcf4 residues involved in high-affinity beta-catenin binding.Biochem Biophy Res Comm,1999,256(3):584-590.8 Behrens J,von Kries JP,Khl M,et al.Function interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1.Nature,1996,382(6592):638-642.9 Van Aken E,De Wever O,Correia da Rocha AS,et al.Defective E-cadherin/catenin complexes in human cancer J.Virchows Arch,2001,439(6):725-751.10 林东,王恩华,张志坤,等.磷酸化的-catenin 在非小细胞肺癌中的表达及意义J.中华病理学杂志,200332(1):54-55.11 徐洪涛,王亮,林东,等.非小细胞肺癌中 Axin 与-连环素异常表达的关系J.中华病理学杂http:/ -5-志,2005,34(8):519-523.12 Dong Hong ZHAO,Jian Jun HONG,Shi Ying GUO,et al.Aberrant expression and function of TCF4 in the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 J.Cell Res,2004,14(1):74-80.13 林桂亭,藏桐,张志文,等.T 细胞因子在肾癌中的表达及其意义J.中华外科杂志 2000,38(6):460-461.14 Mannervik M,Nibu Y,Zhang H,et al.Transcriptional coregulators in development J.Science,1999,284(5414):606-609.15 Flora A,Garcia JJ,Thaller C,et al.The E-protein Tcf4 interacts with Math1 to regulate differentiation of a specific subset of neuronal progenitors J.Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(39):15382-15387.16 Nath N,Kashfi K,Chen J,et al.Nitric oxide-donating aspirin inhibits beta-catenin/T cell factor(TCF)signaling in SW480 colon cancer cells by disrupting the nuclear beta-catenin-TCF association J.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(22):12584-12589.17 Boon EM,Keller JJ,Wormhoudt TA,et al.Sulindac targets nuclear beta-catenin accumulation and Wnt signalling in adenomas of patients with familial adenomatous polyposis and in human colorectal cancer cell lines J.Br J Cancer,2004,90(1):224-229.High expression of TCF-4 positively correlated with lung cancer progression Yang Lianhe，Xu Hongtao，Liu Yang，Zhao Yue，Miao Yuan，Yang Zhiqiang，Liu Nan，Wang Enhua Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang (110001)Abstract Background and objective TCF-4 is an important downstream molecule of Wnt signaling pathway,but studies on the expression level and significance of TCF-4 in lung cancer were still limited.Our aim was to examine the expression level of TCF-4 in lung cancer tissues and cell lines,and analyze its relationship with clinicopathologic characteristics and biological behavior of lung cancers.Methods TCF-4 expression was examined in 120 lung cancer specimens and 10 corresponding normal lung specimens using immunohistochemistry(S-P method).Immunofluorescence was used to examine the TCF-4 protein expression level and subcellular localization in lung cancer cells and HBE(human normal bronchi epithelium)cells.Expression levels of TCF-4 mRNA were examined using transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in 9 lung cancer cell lines.Results Among 120 lung cancer specimens,96 samples showed high expression of TCF-4(80.0%),including 37 samples showed TCF-4 expression both in cytoplasm and nuclei(30.8%),TCF-4 were not detected in 10 corresponding normal lung specimens.TCF-4 expression level was positively correlated with TNM stages(P=0.022).The fluorescence signal of TCF-4 protein was conspicuous in lung cancer cells,primarily in cell nuclei,but extremely low in HBE.TCF-4 mRNA expression levels were imcompatible in different histology types,the expression level of TCF-4 was relatively high in giant cell carcinoma cells,but low in lung adencarcinoma cells.Conclusion High expression of TCF-4 positively correlated with lung cancer progression.Keywords：TCF-4；lung cancer；TNM stage；Immunohistochemistry；Immunofluorescence http:/ -6-表 1 肺鳞癌和肺腺癌中 TCF-4 的高水平表达及临床病理学特征 TCF-4 表达 参数 低 高 P 性别 男 16 63 女 8 33 0.923 年龄 58 岁 11 43 58 岁 12 54 0.762 TNM 分期 III 18 47 IIIIV 6 49 0.022 分化 高中分化 16 54 低分化 7 43 0.224 组织学类型 鳞癌 14 40 腺癌 10 56 0.142 淋巴结转移 无 11 41 有 12 56 0.629 http:/ -7-图 1 TCF4 在肺鳞癌和腺癌中的表达 A.TCF-4 在肺鳞癌中的高表达，以细胞核阳性表达为主，原始放大倍数200；B.TCF-4 在肺鳞癌中的细胞浆阳性表达，原始放大倍数200；C.TCF-4 在肺鳞癌中的低表达，原始放大倍数200；D.TCF-4 在肺腺癌中的细胞核和浆阳性表达，原始放大倍数200；E.TCF-4 在肺腺癌中的细胞浆阳性表达，原始放大倍数400；F.TCF-4 在肺腺癌中的低表达，原始放大倍数400。图 2 TCF-4 蛋白在肺癌细胞系和支气管上皮细胞系中的表达情况 用 Hoechst 标记的细胞核显示蓝色荧光，FITC 标记的 TCF-4 蛋白显示绿色荧光。在肺癌细胞系中 TCF-4的呈阳性表达，主要定位于细胞核，同时有细胞浆表达。TCF-4 在肺癌细胞系的表达明显高于其在 HBE 中的表达。http:/ -8-图 3 TCF-4 mRNA 在九种肺癌细胞系中的表达水平 A 为九种肺癌细胞系中 TCF-4 的 mRNA 经 RT-PCR 后的电泳结果，以-actin 为内参。B 显示 TCF-4 mRNA与-actin 相比后的相对表达量。可见在同种组织学类型的细胞系之间 TCF-4 表达水平相近，而不同组织学类型的细胞系中有所不同，肺腺细胞系中 TCF-4 的表达水平低于其它细胞系。