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论著肾小管间质纤维化与单核巨噬细胞的关系郭 华,邹万忠(北京大学基础医学院病理学系,北京 100083)关键词肾小管/病理学;纤维化;单核细胞化学吸引蛋白质1;巨噬细胞集落刺激因子摘 要目的:探讨肾小管间质纤维化与单核巨噬细胞(MC/MP)的关系。方法:结扎大鼠一侧肾静脉,连续饲养25 d,制作大鼠肾小管间质纤维化模型。每5天杀检取材。HE、PAS、PASM、Masson等染色方法观察MC/MP的聚集和肾小管间质纤维化病变;免疫组化和双重免疫组化观察肾间质MC/MP的聚集与增生;原位杂交、免疫组化观察单核细胞化学吸引蛋白质1(MCP21)、巨噬细胞集落刺激因子(M2CSF)在肾内的表达分布。Western blot检测病变肾脏MCP21的表达。对不同时间点肾小管变性、肾小管间质纤维化程度、肾间质MC/MP聚集的数量及其中的增生比例、MCP21和M2CSF的表达进行评估分析。结果:肾静脉结扎侧表现为肾小管变性萎缩、间质中MC/MP浸润、细胞外基质沉积等肾小管间质纤维化的典型病变。病变早期肾间质中有明显的MC/MP聚集,后期减少。表达增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的单核细胞占一定比例,单核细胞的增生比例与聚集高度相关。原位杂交、免疫组化和Western blot显示,病变肾组织中MCP21、M2CSF mRNA的表达主要位于变性的肾小管上皮细胞胞浆中,病变早期强,后期减弱。肾小管上皮细胞MCP21和M2CSF的表达与肾间质MC/MP的聚集高度相关。肾间质MC/MP的聚集与肾小管变性高度相关。结论:肾小管间质纤维化早期,间质中有明显的MC/MP聚集,来源于浸润和局部增生。肾小管上皮细胞通过表达MCP21、M2CSF在MC/MP浸润和增生中起了重要的调控作用。肾间质MC/MP的聚集与肾小管变性高度相关。MC/MP通过分泌多种细胞因子和促增殖因子促进肾小管间质纤维化,并进一步损伤肾小管。中图分类号 R69216文献标识码 A文章编号 16712167X(2003)0520503205Relationship between tubulointerstitial fibrosis and mononuclear2macrophageGUO Hua,ZOU Wanzhong(Department of Pathology,Peking University School of Basic Medical Sciences,Beijing100083,China)KEY WORDSKidney tubules/pathol;Fibrosis;Monocyte chemcattractant protein21;Macrophagecolony2stimulating factorSUMMARYObjective:To study the relationship between monocyte/macrophage(MC/MP)accumu2lation and tubulointerstitial fibrosis.Methods:The renal tubulointerstitial fibrosis model in Wistar ratswas established by unilateral renal vein ligature.The rats were fed for 25 days.The kidneys were ob2tained every 5 days by killing the rats.The morphological changes of tubulointerstitial fibrosis wereobserved by light microscopy with HE,PAS,PASM and Masson staining.Immunohistochemistry anddouble immunohistochemistry were used to observe MC/MP accumulation and proliferation.In situhybridization and immunochemistry were used to observe MCP21 and M2CSF expression in experimen2tal renal tissue.The MCP21 protein expression was inspected by Western blot.All the data were ana2lyzed statistically.Results:The pathological changes of tubulointerstitial fibrosis were typical.Therewere many MC/MPs accumul sated in the interstitial space at the early stage and some of them werePCNA positive.At the late stage both accumulation and proliferation of MC/MPs were decreased.Theportion of monocyte proliferation was high correlated with the MC/MP accumulation.In situ hy2bridization showed the positive signals of MCP21 and M2CSF were mainly located in the cytoplasm ofdegenerated tubular epithelium and they were strong at the early stage,weak at the late stage.MCP21 by immunochemistry and Western blot were consistent with in situ hybridization.The MC/MP ac2cumulation was high correlated with the expression of MCP21 and tubular epithelium degeneration.The portion of monocyte proliferation was high correlated with the expression of M2CSF.Conclusion:There was obvious accumulation of MC/MP at the early stage of tubulointerstitial fibrosis.The accu2mulation came from infiltration and proliferation which were regulated by degenerated tubular epithe2lial cells producing MCP21 and M2CSF.MC/MP accumulation was highly correlated with tubular de2generation.MC/MP promoted tubulointerstitial fibrosis and damaged tubular epithelium by secreting avariety of cytokines.(J Peking Univ Health Sci ,2003,35:5032507)基金项目:国家自然科学基金(39770293)资助Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(39770293)Corresponding author tel,(010)62092623305北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)Vol.35No.5Oct.2003 临床病理和动物实验证明,肾小管间质纤维化是各种原因导致的慢性肾功能衰竭的重要病理形态基础。其病变特点为肾小管上皮细胞变性、萎缩和消失,肾间质淋巴和单核细胞浸润和纤维化。其中大量单核巨噬细胞(monocyte/macrophage,MC/MP)的浸润是其主要特点之一,但其来源以及与肾小管间质纤维化的关系还有待进一步探讨。本文通过单侧肾静脉结扎肾小管间质纤维化模型,探讨MC/MP在肾小管间质纤维化中的作用。1 材料与方法1.1 肾小管间质纤维化的动物模型Wistar大鼠,雄性,25只,体重100150 g,由北京大学医学部实验动物中心提供。85 gL-1的水合氯醛腹腔注射麻醉动物(0.1 mlkg-1)。经腹腔分离并结扎左肾静脉。分笼饲养,自由进食水。分别在实验开始后第5、10、15、20、25 d杀检,取双侧肾脏。每次随机数字表法取大鼠5只。未结扎侧的肾脏作为正常对照。动物处死前,留24 h尿,股动脉取血,作尿常规检查并测定血肌酐含量(日立710712A型自动生化分析仪)。部分肾组织制成5m冰冻切片,部分进行蛋白印迹检查,其余肾组织10%(体积分数)中性福尔马林固定,常规脱水包埋,制成4m切片,分别进行HE、PAS、PASM、Masson染色、免疫组化、原位杂交。1.2 免疫组织化学染色石蜡切片4m厚,Envision法免疫组化染色。抗体为小鼠抗大鼠MC/MP单克隆抗体(ED1,Sero2tee公司)、小鼠抗大鼠TNF单克隆抗体(中山公司)。Envision工作液为DAKO公司产品。DAB显色,Mayer苏木素复染。冰冻切片用冷丙酮固定,常规免疫组化染色(SABC法)。加抗体前,用5%(体积分数)鸡蛋清溶液室温1 h封闭内源性生物素。抗体为山羊抗大鼠MCP21抗体(Santa Cruz公司)。AP2RED显色。双重免疫组化分两步,第1次用SABC法。抗体为小鼠抗人PCNA单克隆抗体(DAKO公司)。BCIP/NBT显色。第2次用Envi2sion法,抗体为小鼠抗大鼠MC/MP单克隆抗体(ED1,Serotee公司),AEC显色。切片室温干燥,二甲苯透明1 min,树酯封片,避光保存。所有抗体工作液浓度均为150。1.3 蛋白质印记(Western blot)新鲜肾组织提取总蛋白。用BCA Protein AssayReagent Kit测蛋白浓度。取100g总蛋白以15%(体积分数)SDS2PAGE凝胶电泳,蛋白Marker用考马斯亮蓝染色,恒压30 V、7 h转膜,50 gL-1脱脂奶粉室温封闭1 h,MCP21多克隆抗体(同前,体积比1100 TBST稀释)4过夜,TBS冲洗,辣根过氧化物酶(HRP)耦联的兔抗山羊IgG(中山公司,体积比1200 TBST稀释)37、1 h,TBS冲洗,DAB显色。1.4 原位杂交大肠杆菌XL2blue,制备感受态,转化含MCP21、M2CSF、TNF的质粒(MCP21、TNF质粒由澳大利亚Bender Wien研究所Adolf Himmler教授惠赠,M2CSF质粒由澳大利亚Monash医学中心肾脏学系Nikolic2Paterson教授惠赠),挑选克隆、扩增,用Winzard plus SV Minipreps DNA purification system提取纯化质粒,酶切,用T3/T7RNA聚合酶合成地高辛标记的RNA探针。原位杂交方法参见文献1,其中抗体改为碱性磷酸酶(AP)标记的抗地高辛抗体,显色系统为BCIP/NPT。水性封片剂封片。1.5 结果判断1.5.1 肾小管间质纤维化程度判断 按照纤维化占肾皮质面积的比例分为03级:0=正常,1=纤维化占肾皮质 25%,2=纤维化占肾皮质的26%50%,3=纤维化占肾皮质的50%以上。该评分在Masson染色中进行。1.5.2 肾小管变性损伤程度判断 按照变性的肾小管占肾皮质面积的比例分为04级:0=正常,1=占肾皮质面积 25%,2=占肾皮质面积26%50%,3=占肾皮质面积50%75%,4=占肾皮质面积75%以上。该评分在PASM切片中进行。1.5.3 免疫组化结果判断 ED1、TNF阳性信号为棕色颗粒,位于胞浆。MCP21阳性信号为红色颗粒,位于胞浆。双重免疫组化PCNA阳性信号为蓝紫色,位于胞核;ED1阳性信号为红色颗粒,位于胞浆。肾间质中MC/MP和增殖的单核细胞计数:每张切片随机选10个高倍视野,计数肾间质中ED1阳性细胞数和ED1、PCNA双重阳性的细胞数。1.5.4原位杂交结果判断 MCP21、M2CSF原位杂交阳性信号为蓝紫色颗粒,位于胞浆。原位杂交评分系统包括两个:(1)按每种阳性信号占肾小管的比例分为03级,即0=无着色,1=阳性成分 25%,2=阳性成分占25%50%,3=阳性成分占50%以上。(2)按阳性成分的染色强度分为03级,即0=阴性,1=弱阳性,2=中等强度,3=强阳性。两个评分系统的分数相加得到每种指标的最后评分。1.6 数据统计学分析405北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)Vol.35No.5Oct.2003应用SPSS11.0软件,对MC/MP、增殖期单核细胞计数做单因素方差分析最小显著差法(LSD)检验;对MCP21、M2CSF原位杂交和肾小管变性、肾小管间质纤维化程度做独立样本非参数秩检验;MC/MP与增殖期单核细胞数的相关性用Pearson相关分析;将MC/MP、增殖期单核细胞数变量转化为秩变量,各指标之间的相关性用Spearman秩相关分析。2 结果2.1 肉眼观察及血、尿检查结扎肾静脉后第5天,肾脏呈紫红色,明显肿胀。随着时间延长(10、15、20、25 d),静脉结扎侧的肾脏逐渐呈灰红至灰白色,体积缩小,质地变硬。而对侧的肾脏无明显变化。术后第5天,出现微量镜下血尿和微量蛋白尿。随着时间的延长,尿常规恢复正常。血肌酐含量始终未见异常。2.2 肾静脉结扎侧肾组织光镜观察术后5 d,肾小球淤血,肾间质弥漫性淤血、水肿及灶状出血,肾小管弥漫空泡及颗粒变性,伴有管型形成。术后10 d,肾小球淤血,肾小管上皮细胞变性、萎缩并存,部分肾小管管腔扩张,基底膜增厚,肾间质单个核细胞浸润(图1)。术后1525 d,肾小球出现缺血性改变,肾小管萎缩、扩张更加明显,肾小管数目减少,肾间质纤维化明显。2.3 免疫组化及双重免疫组化手术后5 d,静脉结扎侧肾组织中即有大量MC/MP浸润(ED1阳性细胞),主要分布于皮质肾间质中(图2)。随着病程的延长,肾组织中MC/MP的数量逐渐减少。ED1阳性的单核细胞中有一定比例的PCNA阳性细胞(图3)。MCP21在损伤的肾小管上皮细胞显示强阳性。肾间质MC/MP和部分肾小管上皮细胞TNF阳性(图4)。2.4 原位杂交在大鼠未结扎静脉的肾组织中,没有MCP21和M2CSF mRNA的表达。在病变早期和中期,MCP21、M2CSF mRNA的表达明显增多,主要位于皮质肾小管(图5、6),肾小球和肾髓质无明显表达。肾间质的MC/MP和部分肾小管上皮细胞TNF阳性。2.5 蛋白印记(Western blot)正常肾脏中没有MCP21蛋白表达,病变早期、中期MCP21表达较强,晚期减少(图7)。2.6 各时间点之间显著性比较(表1)实验早、中期(5、10、15 d)肾间质MC/MP、增殖期单核细胞、MCP21、M2CSF、肾小管变性程度、肾小管间质纤维化程度等各项指标,无论与对照相比或各时间点之间相比差异均有显著性;实验晚期(20、25 d)各时间点和对照之间差异无显著性。肾间质MC/MP、增殖期单核细胞在病变早期增多,随时间延长而减少;MCP21、M2CSF病变早期表达强,晚期弱;肾小管变性早期明显,晚期减少而以萎缩消失为主;肾小管间质纤维化随病程延长而加重。2.7 各指标相关性分析(表2)肾间质MC/MP数与增殖期单核细胞数高度正相关。肾间质MC/MP数与肾小管MCP21的表达高度正相关。增殖期单核细胞数与肾小管M2CSF表达高度正相关。肾间质MC/MP、增殖期单核细胞、MCP21、M2CSF的表达与肾小管变性高度正相关,而与肾小管间质纤维化高度负相关。3 讨论肾小管上皮细胞变性、萎缩和消失,肾间质淋巴单核细胞浸润和纤维化,称为肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病发展的共同结局。大量形态学定量分析认为它是决定预后的重要因素,其病理过程起初是炎症期,以淋巴、单核细胞为主的炎细胞浸润,肾小管变性损伤,继而肾间质中的成纤维细胞活化,数目增加,产生大量基质蛋白,使细胞外基质增多,间质纤维化,肾小管消失。本实验的动物模型为结扎肾静脉所导致的肾脏淤血性缺血肾小管间质纤维化模型,免疫组化显示病变早期肾间质中有大量ED1阳性的MC/MP聚集。双重免疫组化结果显示部分单核细胞处于增殖期,而且增殖期单核细胞数目与肾间质MC/MP数目高度正相关。ED1单克隆抗体标记的是来源于血液的MC/MP,这说明肾间质中MC/MP的聚集是从血液中浸润并进一步增殖而来。MC/MP通过产生TGF2、血小板源性生长因子(PDGF)、IL21、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等直接促进固有的成纤维细胞增殖活化、合成细胞外基质增多、抑制细胞外基质降解,导致间质纤维化2,MC/MP本身也可以分泌纤黏连蛋白直接参与纤维化。另一方面MC/MP分泌活性氧基团、NO、TNF等又可进一步损伤肾小管3,损伤的肾小管上皮细胞是多种炎症因子和促纤维化因子如IL21、RANTES、TGF2、PDGF、ET21、CTGF、bFGF的主要来源4,这些因子在肾脏早期炎症和晚期纤维化进程中都起了重要作用。MC/MP还通过分泌金属蛋白酶损伤肾小管基底膜,使肾小管上皮细胞与间质成分直接接触而受损2,并可直接向成纤维细胞转化5。505郭 华,等 肾小管间质纤维化与单核巨噬细胞的关系图1 术后10 d,肾小管弥漫变性损伤,肾间质中大量单个核细胞浸润 HE200Figure 1Ten days after operationThe renal tubules degenerated diffusely.There are many mononuclear cells in the interstitial spaceHE200图2 术后5 d,肾间质中可见大量单核巨噬细胞 免疫组化 200Figure 2Five days after operation There are a large number of mononuclear2macrophages in the renal interstitial spaceIH200图3 肾间质中可见ED1、PCNA双重阳性的细胞 双重免疫组化 400Figure 3ED1、PCNA double positive cells can be seen in the renal interstitial spaceDouble IH400图4 肾间质中部分单核巨噬细胞和部分肾小管表达TNF 免疫组化 200Figure 4Mononuclear2macrophages in the interstitial space and some tubular epithelial cells are TNFpositiveIH200图5 术后5 d,MCP21在肾组织中的表达,阳性信号位于肾小管上皮细胞胞浆内 原位杂交 200Figure 5Five days after operation Expression of MCP21 mRNA in the renal tissue,positive signals are located in the cytoplasm of proximal tubulesISH200图6 术后5 d,M2CSF在肾组织中的表达,阳性信号位于肾小管上皮细胞胞浆内 原位杂交 200Figure 6Five days after operation Expression of M2CSF mRNA in the renal tissue,positive signals are located in the cytoplasm of proximal tubulesISH200表1 各时间点大鼠肾组织病变、免疫组化、原位杂交结果比较(n=5,?xs)Table 1Comparison of the pathological changes of renal tissue,IH and ISH results at every point(n=5,?xs)GroupMC/MP in theInterstitial spaceProliferatingmonocyteMCP21M2CSFTubuledegenerationTIFControl 5.21.9000005 d206163 324.83.83 35.60.63 35.00.73 34.003 303 310 d105133 3#14.63.63 3#4.00.73 3#4.00.73 33.003 3#0.80.43 3#15 d1873#6.21.83 3#2.60.53 3#2.40.63 3#2.60.63 3#1.60.63 3#20 d103#3.41.83#2.20.43 3#1.21.1#1.60.63 3#2.60.63 3#25 d144#1.21.1#1.81.13#0.81.1#1.003 3#2.80.43 3#MC/MP,monocyte/macrophage;TIF,tubulointerstitial fibrosis.3P 0.05,3 3P 0.01 compared with control group;#P 0.05,#P0.01 compared with 5 d group;P 0.05,P 0.01 compared with 10 d group;P 0.05,P 0.01 compared with 15 d group.605北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)Vol.35No.5Oct.2003图7Western blot显示MCP21的表达Figure 7MCP21 Western blot表2 各项指标的相关性分析Table 2Correlation analysis of every indexProliferatingmonocyteMCP21TubuledegenerationTIFMC/MP0.81230.85430.8373-0.8903Proliferatingmonocyte0.8653-0.8643M2CSF0.85730.86730.8593-0.8243MCP210.7713-0.7993MC/MP,monocyte/macrophage;TIF,tubulointerstitial fibrosis.3P 0.011 本实验通过免疫组化、原位杂交及Western blot显示,损伤变性的肾小管上皮细胞可以产生MCP21、M2CSF,前者是MC/MP的趋化因子,后者是单核细胞集落刺激因子。动物模型早期MCP21、M2CSF表达明显增高,晚期MCP21、M2CSF表达明显降低。间质中MC/MP的数量也是早期多于晚期。肾小管上皮细胞MCP21和M2CSF的表达分别与肾间质中MC/MP的聚集和增殖数目高度相关。MCP21、M2CSF的表达与肾小管变性高度正相关,而与肾小管间质纤维化负相关。说明肾小管的损伤在肾小管间质纤维化进程中具有启动作用,即肾缺血首先导致肾小管损伤,损伤的肾小管上皮细胞产生MCP21、M2CSF,导致肾间质出现大量MC/MP,后期肾小管萎缩,MCP21、M2CSF合成分泌减少,MC/MP也减少。文献报道损伤的肾小管上皮细胞还能合成、分泌多种细胞因子和趋化因子,如MIF(单核细胞移动抑制因子)、IL21、ICAM21(细胞间黏附分子1)、VCAM21(血管间黏附分子1)、骨桥蛋白等活性分子3,促进单核细胞浸润于肾间质中。在肾小管上皮细胞分泌的众多因子中与MC/MP浸润、增殖关系最为密切的是MCP21和M2CSF6,7。在Thy1肾炎模型中注射抗MCP21血清后肾小球内MC/MP浸润减少40%;用MCP21基因敲除小鼠制作肾毒性血清肾炎模型,间质中MC/MP的浸润减少30%,肾小管损伤变性减少40%;在抗肾小球基底膜肾炎动物模型中注入MCP21反义寡核苷酸后发现MC/MP浸润减少50%,小管间质损伤减轻,肾功能改善8。提示损伤的肾小管上皮细胞通过产生MCP21并促进MC/MP浸润进而损伤肾小管上皮细胞。以往认为血液中的单核细胞到达炎症部位后即向巨噬细胞转化,不再增殖。但近来的研究发现大鼠新月体肾炎中45%60%的单核细胞表达PCNA,且PCNA阳性的单核细胞数目与肾小球和肾间质中MC/MP总数高度相关,同时血液和其它组织中的单核细胞没有增殖9;人类狼疮性肾炎中发现肾组织中50%60%的单核细胞表达PCNA10。本实验也发现肾间质中部分ED1阳性的MC/MP有增殖功能(PCNA阳性)。这些都提示单核细胞的增殖是局部聚集的重要机制。肾小管上皮损伤有变性和萎缩两种表现。以往的研究中不加以区分,统称为肾小管损伤。本文将肾小管变性单独统计,结果显示肾间质MC/MP的聚集、增殖与之高度相关,而与小管萎缩间质纤维化呈负相关。MC/MP在间质的聚集是启动肾间质纤维化病变的重要始动环节,在此过程中,变性的肾小管上皮细胞起了重要作用。可见通过局部阻断肾小管上皮细胞分泌MCP21、M2CSF等因子抑制MC/MP在肾间质的聚集与增殖,可达到减轻炎症反应、减轻肾小管损伤、抑制纤维化的目的。参考文献1应建明,金燕燕,王 衡,等.hTRT催化功能区基因克隆及其在肿瘤中的表达J.中华病理学杂志,1999,28:852882Henke C,Marineili W,Jessurun J,et al.Macrophage productionof basic fibroblast growth factor in the fibroproliferative disorder ofalveolar fibrosis after lung injuryJ.Am J Pathol,1993,143(4):1189211993Nikolic2Paterson DJ,Atkins RC.The role of macrophages inglomerulonephritisJ.Nephrol Dial Transplant,2001,16 Suppl5:3274Zeisherg M,Strutz F,Muller GA.Renal fibrosis:an updateJ.Curr Opin Nephrol Hypertens,2001,10(3):31523205Stahl PJ,Felsen D.Transforming growth factor2,basement mem2brane,and epithelial2mesenchymal transdifferentiation:implicationsfor fibrosis in kidney diseaseJ.Am J Pathol,2001,159(4):1313213216Tesch GH,Schwarting A,Kinoshita K,et al.Monocyte chemoat2tractant protein21 promotes macrophage2mediated tubular injury,but not glomerular injury,in nephrotoxic serum nephritisJ.J ClinInvest,1999,103(1):732807Stephens ND,Barton SL,Smith AY,et al.GM2CSF secretion inprimary cultures of normal and cancerous human renal cells J.Kidney Int,1996,50(3):1044210508Okada H,Moriwaki K,Kalluri R,et al.Inhibition of monocytechemoattractant protein21 expression in tubular epithelium attenu2ates tubulointerstitial alteration in rat Goodpasture syndrome J.Kidney Int,2000,57(3):92729369 Lan HY,Nikolic2paterson DJ,Mu W,et al.Local macrophageproliferation in the progression of glomerular and tubulointerstitialinjury in rat anti2GBM glomerulonephritisJ.Kidney Int,1995,48(3):753276010陈伟英,杨念生,尹培达,等.巨噬细胞局部浸润和增殖在狼疮肾炎中的作用J 1 中华风湿病学杂志,1998,6:88291(2003201222收稿)(本文编辑:任英慧)705郭 华,等 肾小管间质纤维化与单核巨噬细胞的关系