肠道营养支持对烧伤大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用及其机理.pdf

收稿日期：2000-08-24修回日期：2000-12-07基金项目：全军“九五”指令性攻关课题专项基金（96L043）文章编号：1001-6325（2001）04-0352-04肠道营养支持对烧伤大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用及其机理彭曦，汪仕良，王斐，陶凌辉，赵云，尤忠义（第三军医大学 西南医院 烧伤研究所，重庆 400038）摘要：观察不同营养支持途径对严重烧伤所致肠粘膜屏障功能损害的影响并探讨其机制。采用 30%体表面积!度烧伤大鼠模型，随机分成正常对照（COntrOI），静脉营养（PN）及肠道营养（EN）组，观察了烧伤后肠粘膜屏障功能的变化及 PN 和 EN 对其的影响。结果显示，烧伤后肠粘膜通透性、血浆二胺氧化酶（DAO）活性明显高于对照组（!0.01），而肠上皮细胞增殖指数、肠三叶因子（ITF）含量、肠粘液层厚度及己糖和唾液酸的含量则明显降低（!0.05）。同 PN 相比，EN 对上述指标均有一定的逆转作用。提示 EN 较 PN 更有利于减轻肠粘膜受损程度，促进肠粘膜修复。关键词：肠道营养；静脉营养；肠粘膜屏障；大鼠；烧伤中图分类号：R644文献标识码：A严重烧伤后，肠腔中存在的细菌及内毒素可穿越肠粘膜，形成“肠源性感染”。此外，细菌及内毒素的移位可造成巨噬细胞过度活化，释放大量炎性介质，引发“肠源性高代谢”。无论是肠源性感染还是肠源性高代谢，其发生发展的关键都是肠粘膜屏障功能损害1。因此，如何有效维护和重建肠粘膜屏障已成为目前烧伤研究的重要课题。我们以往的研究发现合理的营养支持在维护肠粘膜屏障功能中具有重要作用，特别是实施肠道营养后，可明显减轻严重烧伤所致的肠道损害2。但是，对于烧伤后实施肠道营养的效果尚存在不同看法，多数学者持肯定态度，但也有相反的意见，认为肠道营养可加重胃肠负担，引起恶心 呕吐胃潴留及反流性肺炎等不良反应3。此外，对肠道营养的胃肠道保护机制尚缺乏深入研究。为此，本实验比较了肠道营养和静脉营养两种途径对严重烧伤所致大鼠肠粘膜屏障功能损害的影响并探讨其机制，以期为烧伤病人的营养支持提供理论依据。!材料与方法!动物模型1.1.1模型制作及分组健康成年 Wistar 大鼠 88只，体重 215 1 25g，雌雄不拘。随机分成三组，静脉营养（parenteraI nutritiOn，PN）组，肠道营养（enteraInutritiOn，EN）组及正常对照（cOntrOI，C）组。对照组不予烧伤，其它两组烧伤前禁食 121，1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉，背部电推剃毛，称重后置剃毛区于 92C水浴中 18s，造成 30%体表面积!度烧伤（病理切片证实）。伤后按 50 mL/kg 腹腔注入乳酸林格氏液抗休克。大鼠静脉营养模型制作参见文献4，为了尽可能使 PN 和 EN 两组具有可比性，EN组亦采用同样的手术程序，暴露颈外静脉并予以结扎后逐层缝合。1.1.2时相设置：实验分烧伤后（PBD）1、2、3、5、7d五个时相点（每时相点包括 PN 和 EN 两组，每组每时相8 只大鼠），其中 PN 组于伤后21 开始以微量泵静脉泵入营养液，速度为 1 2mL/1，自由饮水。EN组也于伤后 21 开始灌喂营养液，每天计划量分 4 6 次喂完，不限饮水。1.1.3营养液的配制：按糖 54.5、脂 31.5、蛋白 14的比例配制营养液。其中糖占 15.3%（w/V），卡氮比为 18311，糖、脂供热比为 1.7311。在层流台上将各种营养成份混匀后分装，4C保存，用前复温至37C。253基础医学与临床Basic MedicaI Sciences and CIinics2001.21（4）1.1.4营 养 素 供 应 量：按 每 天 732.2KJ/kg 即152mL/kg 的标准供给。伤后第一天摄入标准量的1/3，第二天摄入 1/2，第三天起摄入全量。1.2检测指标1.2.1肠粘膜通透性测定：经股静脉注入 99mTcDTPA-HAS，剂量为 1480kBg/kg，30 min 后断头处死大鼠，测定肠腔灌洗液的 cpm 值，以对照大鼠肠粘膜通量为 1，用烧伤后各时相与之的比值来反映肠粘膜通透性的改变。由于99mTc 半衰期仅 6h，实验中要设衰变对照，校正所测 cpm 值。1.2.2流式细胞术测定肠上皮细胞增殖指数：分离肠上皮细胞，调节细胞数为 1 X 105，75%乙醇固定，弃 固 定 剂，PBS 洗 2 次，加 5g/L 的 RNA 酶0.5mL，混匀，37C水浴 30min，加 50mg/L 的 PI 染色液 0.5mL，摇匀，避光冷藏 30min，上机检测，每份标本分析1 万个细胞。据 G1、S、G2及 M 各期细胞所占百分比，计算增殖指数（S+G2+M）。1.2.3血浆二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）活性测定：DAO 测定参见文献5。除辣根过氧化物酶由深圳晶美公司提供外，其余均购自 Sigma。1.2.4粘液厚度：采用阿利新兰结合法间接反映粘液层厚度。实验当天用缓冲液（0.2mOI/L NaH2PO4，0.1mOI/L 柠檬酸，pH 5.8）配制浓度为 1g/L 的阿利新兰溶液，准确量取各时相大鼠回肠 10cm，等渗盐水漂洗后立即浸入 10mL 染液中，室温孵育 2h 后取出肠段，吸取染液约 5mL 离心（3 000r/min X 15min）取上清清比色（!=615nm），以缓冲液调零，阿利新兰液为标准管（OD 标准），测定各管 OD 值（OD 样品）。阿利新兰结合量（mg）=10-（OD 样品/OD 标准）X 101.2.5粘液已糖含量测定：定量刮取肠粘液，稀释离心去除杂质后采用酚磺法测定，取 1mL 样品加入1mL 6%苯酚反应 10min 后，加入 5mL 98%硫酸，静置 30min，波长 495nm 比色。以 D-半乳糖为标准制作标准曲线。1.2.6粘液唾液酸含量测定：取样品 0.1mL 加入0.06N 硫酸 0.8mL 加盖后 100C 水浴 10min，取出流水冷却后加 50g/L 钨酸钠 0.1mL，充分混匀，3000r/min 离心 5min 吸取 0.1mL 上清液待测。加入 10mL高碘酸钾，37C水浴 30min，再加入 60mmOI/L 亚砷酸钠 0.2mL 混匀，静置 5min，待碘的黄色出现并完全消退后加入 0.15mOI/L 硫代巴比妥酸 1.0mL 混匀后沸水中煮 8min，流水冷却后加入二乙醇乙醚 2.5mL充分混匀，静置 5min 后 549nm 比色。以 N-乙酰神经氨酸为标准制作标准曲线。1.2.7肠粘膜中 ITF 含量测定：rITF 由丹麦 NOVO研究院 L.Thim 教授惠赠。色谱条件及标准曲线制作均参见文献6。采用考马氏亮蓝 G-250 法测定蛋白含量。1.3统计学处理所有数据在华西医科大学 PEMS 程序包上作统计学处理，结果以（X1 S）表示，进行 检验。2结果2.1烧伤大鼠肠粘膜通透性的变化烧伤后大鼠肠粘膜通透性明显增高，第一天就达峰值，分别为对照组的 3.48 和 3.21 倍，此后虽有下降，但至伤后 7d 仍明显增高。EN 组在伤后 3 7d明显低于 PN 组（P 0.01）。表 1烧伤大鼠肠粘膜通透性的变化Table 1Changes of intestinal mucosal permeability in burned rats（!1，mg，n=8）grOupPBD12357C1.00 1 0.041.00 1 0.041.00 1 0.041.00 1 0.041.00 1 0.04PN3.48 1 0.36!2.53 1 0.34!1.85 1 0.23!1.96 1 0.14!2.72 1 0.23!EN3.21 1 0.45!2.02 1 0.31!1.32 1 0.19!1.40 1 0.27!1.49 1 0.18!P 0.01 US C grOup；P 0.05，P 0.01 US PN grOup2.2烧伤大鼠血浆 DAO 活性的变化DAO 活性在伤后第 1d 达峰值，PN、EN 组分别为对照组的 3.8 和 3.6 倍，后有逐渐降低的趋势，至伤后 7d 仍明显增高，EN 组在伤后 3d 明显低于 PN组（P 0.01）。2.3烧伤大鼠肠粘膜增殖指数的变化3532001.21（4）基础医学与临床Basic MedicaI Sciences and CIinics烧伤后肠粘膜增殖指数降低，但 EN 组大鼠肠粘膜增殖受抑的程度较 PN 组轻，两组在伤后 3、5d间存在显著差异（!0.05）。表 2烧伤大鼠血浆二胺氧化酶（DAO）活性的改变Table 2Changes of the activity of DAO in rat plasma after burn injury（!i U/mL，n=8）groupPBD12357C60.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.82PN1.23 1 0.53!1.05 1 0.31!0.88 1 0.21!0.60 1 0.14!0.70 1 0.16!EN1.14 1 0.36!1.02 1 0.27!0.51 1 0.14!0.62 1 0.10!0.61 1 0.14!0.05，!0.01#C group；!0.05，!0.01#PN group表 3烧伤大鼠肠粘膜细胞增殖指数的变化Table 3Changes of the index of intestinal epithelial proliferation in burned rats（!i，%，n=8）groupPBD12357C60.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.8260.14 1 6.82PN38.60 1 15.26!35.05 1 12.56!40.16 1 13.04!42.28 1 6.83!45.16 1 20.68EN38.38 1 21.8829.33 1 6.83!51.83 1 4.6251.88 1 4.57!44.16 1 11.84!0.05，!0.01#C group；!0.05#PN group2.4烧伤大鼠肠粘膜 ITF 含量的变化与对照组相比，ITF 在伤后第1d 有一过性增加，随后逐渐降低，从第 3d 起大幅下降，伤后 7d 降至最低点。EN 组在伤后 3 7d 天显著高于 PN 组（!0.01）。2.5烧伤大鼠粘液层厚度的变化烧伤可导致肠道粘液层变薄，其表现为粘液结合阿利新蓝的能力下降。除伤后第 1d 粘液厚度高于对照组外，其余各时相均显著降低（!0.01）。EF 组在伤后 5、7d 显著高于 PN 组（!0.05）。表 4烧伤大鼠肠粘膜中 ITF 含量的变化Table 4Changes of the content of ITF in rat mucosa after burn injury（!i ，ng/g，n=8）groupPBD12357C369.33 1 65.56369.33 1 65.56369.33 1 65.56369.33 1 65.56369.33 1 65.56PN588.16 1 100.30!343.67 1 51.83127.67 1 45.51!98.67 1 40.25!15.83 1 4.40!EN555.83 1 209.43362.17 1 50.91258.83 1 45.72!258.00 1 66.07!129.16 1 46.16!0.01#C group；!0.01#PN group表 5烧伤大鼠肠粘液层厚度的变化Table 5Changes of the mucus layer depth in burned rats（!i ，mg，n=8）groupPBD12357C7.84 1 0.727.84 1 0.727.84 1 0.727.84 1 0.727.84 1 0.72PN8.62 1 0.26!7.20 1 0.44!6.85 1 0.63!6.26 1 0.34!5.02 1 1.33!EN8.36 1 0.456.22 1 0.38!7.42 1 0.247.50 1 0.476.69 1 0.32!0.05，!0.01#C group；!0.05，!0.01#PN group453基础医学与临床Basic MedicaI Sciences and CIinics2001.21（4）2.6烧伤大鼠肠粘液中已糖含量的变化烧伤后肠粘液中已糖含量呈下降趋势，EF 组明显高于 PN 组，两组在伤后 5、7d 间存在显著差异（P 0.01）。2.7烧伤大鼠肠粘液中唾液酸含量的变化烧伤后粘液中唾液酸含量呈下降趋势，伤后 3d起明显低于对照组，EN 组在伤后 5 7d 明显高于PN 组。表 6烧伤大鼠肠粘液中已糖含量的变化Table 6Changes of the content of hexose in rat mucus after burn injury（!1，g/L，n=8）groupPBD12357C2.7 1 0.602.7 1 0.602.7 1 0.602.7 1 0.602.7 1 0.60PN3.27 1 0.862.95 1 0.161.84 1 0.38!1.63 1 0.31!1.96 1 0.27!EN3.48 1 0.753.08 1 0.182.36 1 0.422.92 1 0.832.79 1 0.28!P 0.05，!P 0.01 Ls C group；P 0.01 Ls PN group表 7烧伤大鼠肠粘液中唾液酸含量的变化Table 7Changes of content of acetylneuraminate in rat mucus after burn injury（!1 ，g/L，n=8）groupPBD12357C0.65 1 0.110.65 1 0.110.65 1 0.110.65 1 0.110.65 1 0.11PN0.72 1 0.090.63 1 0.060.43 1 0.08!0.25 1 0.04!0.22 1 0.09!EN0.79 1 0.150.66 1 0.120.49 1 0.100.46 1 0.130.39 1 0.06!P 0.05，!P 0.01 Ls C group；P 0.01 Ls PN group3讨论结果显示，烧伤后反映肠粘膜受损的酶学指标血浆 DAO 活性明显增高，与之对应，肠粘膜通透性增加而粘膜细胞增殖能力则显著下降。与 PN 组相比，EN 组大鼠肠粘膜通透性及血浆 DAO 活性均显著下降，粘膜细胞增殖指数却明显增高。提示尽管EN 不能完全逆转伤后肠粘膜屏障受损的趋势，但粘膜细胞损伤和增殖受抑的程度明显低于 PN 组。烧伤后肠粘液层厚度的变化趋势是不断变薄，伤后第1 天粘液层厚度曾有一过性增加，可能是由于杯状细胞应激性分泌增加所致。随着伤情发展，杯状细胞结构受损，粘液分泌量减少，粘液层不断变薄。两组相比，EN 组粘液层厚度明显大于 PN 组。另外，烧伤后粘液中己糖和唾液酸的含量均明显低于伤前，说明伤后肠粘液成分发生了改变。但 EN 组的变化幅度小于 PN 组，提示 EN 能稳定肠粘液层，其机制可能与 EN 能促进肠杯状细胞的成熟和分化有关7。另外，EN 能促进 ITF 的合成可能是其在维护肠粘液层稳定方面优于静脉营养的重要原因8。创伤后长期使用 TPN，尽管机体得到了营养支持，营养状态和大部分脏器功能尚可，但肠道长期处于无负荷状态使肠粘膜屏障功能严重受损。而肠腔中的食物可直接作用于吸收部位，刺激粘膜增生，是肠粘膜生长最重要的刺激剂。但这种作用并非食物直接供能所致，因为一些不能代谢吸收的物质也能促进粘膜增生。因此，笔者认为肠道营养促进肠粘膜增殖的实质是“肠道工作负荷”决定其粘膜增殖反应。参考文献：1Schroder J，KahIke V，Fandrich F，et al.GIutamine dipep-tides-suppIemented parenteraI nutrition reverses gut mucosaIstructure and interIeukin-6 reIease of rat intestinaI mononucIearceIIs after hemorrhagic shock J.Shock，1998，10（1）：26-5532001.21（4）基础医学与临床Basic MedicaI Sciences and CIinics31.2彭曦，冯晋斌，汪仕良，等.早期肠道营养改善烧伤后肠道血液灌流机制的探讨 J.中华外科杂志，1999，37（8）：507-509.3Hansbrough JF.EnteraI nutritionaI support in burn patients J.Gastrointest Endosc CIin N Am，1998，8（3）：645-651.4彭曦，汪仕良，谭银玲，等.烧伤大鼠静脉营养模型的建立及应用 J.第三军医大学学报，2000，22（1）：1-4.5Hosida NB，Masahaur N，Manabu K，et al.StructuraI andfunctionaI aIterations in the gut of parenteraIIy or enteraIIy fedrats J.J SurgicaI Research，1989，47（1）：129-133.6王毓三，贺福如，杨金陵，等.血清唾液酸的硫代巴比妥酸法测定 J.临床检验杂志，1981，3（3）：46-48.7Cheever KH.EarIy enteraI feeding of patients with muItipIetrauma J.Crit Care Nurse，1999，19（6）：40-51.8彭曦，谭银玲，陶麟辉，等.肠三叶因子在大鼠肠道中表达的实验研究 J.第三军医大学学报，2000，22（7）：635-638.Effect of enteraI nutrition support route on intestine mucosaI barrierfunction in burned rats and its mechanismPENG Xi，WANG Shi-Iiang，WANG Fei，et al（Institute of Burn Research，Southwestern HospitaI，Third MiIitary MedicaI University，Chongging 400038，China）Abstract：To observe the effect of enteraI nutrition support on intestine mucosaI barrier damage induced by severe burninjury.Wistar rats were infIicted with 30%totaI body surface fuII thickness burns and randomIy divided into threegroups：burned and enteraI nutrition（EN），burned and parenteraI nutrition（PN），and normaI controI（C）.After burninjury，the intestinaI mucosaI permeabiIity and the activity of pIasms diamine oxidase（DAO）were significant increased（P 0.01）.On the other hand，intestinaI epitheIiaI proIiferation index，content of intestinaI trefoiI factor（ITF），mucusIayer depth as weII as the content of hexose and acetyIneuraminate were remarked decIined（P 0.05）.In EN group，the change extent of these indices were Iower than those in PN group.SO，compare with PN，EN is beneficiaI in mini-mizing intestine injury，promoting intestinaI mucosa reparation.Key words：enteraI nutrition；parenteraI nutrition；intestine mucosaI barrier；rat；burns收稿日期：2000-04-20修回日期：2000-06-05文章编号：1001-6325（2001）04-0356-02产毒性大肠杆菌肠毒素对豚鼠回肠上皮细胞的影响陈清1，申洪2，俞守义1（第一军医大学 1.流行病学教研室；2.病理学教研室，广州 510515）中图分类号：378.2+1文献标识码：A产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coIi，ETEC）是引起人和家畜急性腹泻病的主要病原菌之一1。ETEC 的致病主要与肠毒素有关。它能产生两类肠毒素：不耐热肠毒素（heat-IabiIe enterotoxin，LT）和耐热肠毒素（heat-stabIe enterotox-in，ST）。为进一步探讨 ETEC 肠毒素的作用机制，本研究观察了 LT 和 ST 对豚鼠离体回肠上皮细胞的影响。1材料与方法1.1豚鼠：为非纯种短毛白色豚鼠，体重 350 450g，雌雄不限，由本校动物所提供。1.2ETEC 标准菌株：E44822（LT+）和 E44823（ST+）菌株购于卫生部生物制品鉴定研究所，E129（LT+）及 E130（ST+）菌株购于上海市卫生防疫站。653基础医学与临床Basic MedicaI Sciences and CIinics2001.21（4）肠道营养支持对烧伤大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用及其机理肠道营养支持对烧伤大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用及其机理作者：彭曦，汪仕良，王凤君，陶凌辉，赵云，尤忠义作者单位：第三军医大学西南医院烧伤研究所刊名：基础医学与临床英文刊名：BASIC MEDICAL SCIENCES AND CLINICS年，卷(期)：2001,21(4)被引用次数：5次 参考文献(8条)参考文献(8条)1.彭曦;汪仕良;谭银玲 烧伤大鼠静脉营养模型的建立及应用期刊论文-第三军医大学学报 2000(01)2.Hansbrough JF Enteral nutritional support in burn patients 1998(03)3.彭曦;冯晋斌;汪仕良 早期肠道喂养改善烧伤后肠道血液灌流的实验研究期刊论文-中华外科杂志 1999(08)4.Schroder J;Kahlke V;Fandrich F Glutamine dipeptides-supplemented parenteral nutrition reverses gutmucosal structure and interleukin-6 release of rat intestinal mononuclear cells after hemorrhagicshock外文期刊 1998(01)5.彭曦;谭银玲;陶麟辉 肠三叶因子在大鼠肠道中表达的实验研究期刊论文-第三军医大学学报 2000(07)6.Cheever KH Early enteral feeding of patients with multiple trauma外文期刊 1999(06)7.王毓三;贺福如;杨金陵 血清唾液酸的硫代巴比妥酸法测定期刊论文-临床检验杂志 1984(03)8.Hosida NB;Masahaur N;Manabu K Structural and functional alterations in the gut of parenterally orenterally fed rats外文期刊 1989(01)引证文献(5条)引证文献(5条)1.唐明贵.邱方 危重患者肠屏障的保护期刊论文-华北煤炭医学院学报 2007(3)2.曹建春 通腑汤对腹腔间隔室综合征肠黏膜屏障的干预作用学位论文博士 20063.彭曦.孙勇.尤忠义.王裴.汪仕良 谷氨酰胺对烧伤后大鼠肠道损伤及炎症反应的影响期刊论文-中国临床营养杂志 2005(4)4.徐世伟.汪仕良.冯怀志.尤忠义.王裴 早期肠道营养减轻烧伤后内脏缺血损害的效应期刊论文-中华创伤杂志2004(6)5.彭曦.汪仕良.尤忠义.王裴 谷氨酰胺强化的肠内营养对烧伤后肠源性高代谢的影响期刊论文-外科理论与实践2004(5)本文链接：http:/