四氯化碳综合法制备大鼠肝硬化模型.pdf

论著?四氯化碳综合法制备大鼠肝硬化模型叶春华?刘浔阳(中南大学湘雅三医院普外科,湖南?长沙?410013)?摘要?目的?探讨建立一种理想的大鼠肝硬化模型的复制方法并加以评价,为下一步探索肝硬化门脉高压症治疗方法提供可靠、稳定的模型动物。?方法?90只雄性 SD 大鼠随机分为两组:实验组(70 只)采用四氯化碳(CCl4)+苯巴比妥钠+食用白酒进行诱导,诱导期间 CCl4浓度在一定范围内逐步增加,并用食用白酒替代医用乙醇溶液;对照组(20 只)给与普通饮水和饲料,频度及剂量同实验组。同时采用一系列的检查方法加以评估。?结果?实验组 70 只大鼠造模结束时,死亡 9 只,死亡率 12.86%。实验结束时,按照成模标准,造模成功大鼠共 61 只,均可观察到肝硬化结节及镜下假小叶形成,成模率 87.14%。实验组门静脉压力比对照组明显增高(P 0.05);血清总胆红素、谷丙转氨酶及谷草转氨酶较正常对照组明显升高(P 0.05),而血清白蛋白较之正常对照组明显降低(P 0.05)。对照组 20 只全部存活。?结论?该方法可形成稳定的肝硬化门脉高压症模型,可用于肝硬化门脉高压症方面的相关研究。此模型制作周期短(仅需 9 周),成模率高,死亡率低,具有简便、快捷、高效的优点,适于大批量制作。?关键词?肝硬化,实验性;?疾病模型,动物;?大鼠;?四氯化碳Study on Method of Inducing Hepatic Cirrhosis Model in Rats by Carbon Tetrachloride?YE Chun?hua,?LI U Xun?yang(Department of General Surgery,the T hird Xiangya H osp ital,CentralSouth University,Changsha,410013,China)?Abstract?Objective?To develop and evaluate an ideal means to induce cirrhotic model in rats for nextstudy on liver cirrhosis with portal hypertension treatment.?Methods?Ninety male SD rats were randomly di?vided into two groups,The experiment group(n=70)was treated with CCl4,PBS and eatable alcohol and theconcentration of CCl4and eatable alcohol were increased stage by stage in a certain range during the experi?ment.T he control group(n=20)was treated with common drinking water and animal feeds,the frequencyand dose were the same as the experiment group,meanwhile evaluated by a series of check methods.?Results?After being induced with above means,the rat mortality of the experiment group was 1286%,and the forma?tion rate of liver cirrhosis false lobe was 87.14%.The portal venous pressure of the experiment group washigher than the control group(0.05),STB,GPT,GOT were higher than the control group,but SAB de?creased(P 0.05).The control group was all survival.?Conclusion?The procedure is fairly stable and relia?ble,the model is useful for research in liver cirrhosis with portal hypertension.T he cycle time of inducing cir?rhosis model is short the mortality is low.?Key words?liver cirrhosis,experimental;?disesase models,animal;?rats;?carbon tetrachloride 中图分类号?R575.2?文献标识码?A?文章编号?16717171(2005)05?0619?04?由于病毒性肝炎、酒精性肝病等原因造成的慢性肝病和肝硬化患者有增多的趋势,近十年来有关门脉高压症的研究成为消化学界的热点。本实验通?作者简介?叶春华(1967?),男,湖南安乡人,博士,主治医师,主要从事肝胆外科临床工作。?收稿日期?2005?04?01过腹腔内注射四氯化碳(CCl4)加饮用苯巴比妥钠和食用酒精,探讨建立一种理想的肝硬化模型的方法。1?材料与方法1.1?材料1.1.1?实验动物?90 只 Sprague?Dawley 鼠(简称SD 大鼠),全部雄性,体重 180 220 g,普通大鼠饲?619?医学临床研究?2005 年 5 月?第 22 卷?第 5 期?J Clin Res,May 2005,Vol 22,No5料,均购于中南大学湘雅医学院实验动物中心。1.1.2?动物分组?20 只大鼠作为对照组,其余 70只构建肝硬化门脉高压模型。1.1.3?试剂?乙醚,75%医用酒精,10%甲醛,10%硫化钠,蒸馏水,生理盐水,肝素,CCl4(分析纯,浓度99.5%,批号 XK13?001?0969?16)均购自苏州市第二化工研究所,苯巴比妥钠(0.1g/ml)购自深圳晶美生物工程有限公司。市售食用白酒(乙醇体积分数为 45%)。1.1.4?实验准备?将 CCl4(分析纯,浓度为99.5%)与中性菜籽油溶液混合配制成 40%,50%CCl4中性菜籽油溶液(即 5 份 CCl4+5 份中性菜籽油溶液,混匀),?大鼠购回后应在新环境中适应性饲养 3 d 后再开始实验。大鼠喜暗,白天休息、夜间进食,食量大、对营养缺乏敏感,尤其是对维生素 A和蛋白质。食物缺乏和供水不足的情况下会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足,一笼内饲养大鼠 5 只。1.2?方法1.2.1?构建肝硬化模型?将实验大鼠分为试验组和对照组,模型制备分为两期。诱导期和成模期。?诱导期:实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含0.35 g 苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的惟一饮用水,时间为 1周。饲料使用普通大鼠饲料。?成模期:实验组:按 0.5 ml/100 g 剂量予以腹腔注射 40%CCl4中性菜籽油溶液,每周 2 次,持续 4 周;同时以10%乙醇溶液(由上述食用白酒加蒸馏水配制,下同)为其惟一饮用水。第 5 周开始改为用 50%CCl4中性菜籽油溶液,以 0.5 ml/100 g 标准腹腔注射,每周2 次,持续 4 周;同时改为以30%乙醇溶液为其惟一饮用水至实验结束。对照组:按 0.3 ml/100 g 体重予以腹腔注射生理盐水,每周 2 次,对照组给与普通饮水和饲料,频度及剂量同实验组。制备肝硬化门脉高压症大鼠模型时间共计 9 周。1.2.2?实验组成模标准?门静脉穿刺测压大于对照组的门脉压力区间;?以肉眼观察到肝硬化结节形成及肝脏组织切片要求能够看到假小叶的形成。1.2.3?检测指标?成模后开腹测门静脉压力(PVP),取其血液检测肝功能:血清总蛋白(T SP)、白蛋白(SAB)、球蛋白(SG)、总胆红素(STB)、谷丙转氨酶(GPT)及血液细胞:血色素(HB)、血小板(PLT)、红细胞(RBC);肝组织送病理切片。1.3?统计学分析方法?采用统计分析软件 SPSS10.0 中文版,统计方法采用独立样本 t 检验。2?结果2.1?一般情况?大体观察:大部分实验动物在诱导过程中活动减少,精神萎靡,食欲不振,每日饮水约20 ml,对外界刺激反应迟钝,动物皮肤无光泽,体重下降明显。2.2?实验组病理切片?肝内假小叶广泛形成,假小叶内可见纤维再分隔现象,同时伴有明显的肝细胞再生结节。2.3?肝硬化模型的制作成功率及死亡率情况?实验组 70 只大鼠造模结束时,死亡 9 只,死亡原因为注射 CCl4过量引起中毒所致,存活大鼠 61 只,死亡率 12.86%。实验结束时,按照成模标准,造模成功大鼠共为 61 只,成模率87.14%。对照组 20 只全部存活。2.4?两组大鼠门静脉压力变化?对此两组大鼠开腹穿刺测压结果表明:对照组(8.58?2.02)mmHg、实验组(15.72?2.76)mmHg;两组比较差异有显著性(P 0.05)。2.5?两组大鼠血液细胞和肝功能的检测?见表 1。表 1?实验组与对照组大鼠肝功能及血液细胞比较(x?s)组别TSP(g/L)SAB(g/L)SG(g/L)HB(g)RBC(?109/L)PLT(?109/L)ST B(umol/L)GPT(u/L)正常组71.17?4.2734.03?2.1736.25?2.43168.96?6.376.83?1.27802.27?79.21.25?1.4145.98?10.1试验组50.25?4.0822.51?2.1437.02?2.02140.11?5.633.7?1.32558.69?99.09.54?2.3570?27.42P 值 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.053?讨论肝硬化门脉高压动物模型在探求此种疾病的病理生理,治疗等方面的重要性是不言而喻的。实验性肝硬化模型已有较多报道,CCl4诱发肝硬化动物模型是一个较为经典的方法,染毒方法有口服、腹腔注射等,均以小动物大鼠为多。小动物模型相对稳定,对饮食调控要求不高,大动物也有报道方法包括?620?医学临床研究?2005 年 5 月?第 22 卷?第 5期?J Clin Res,May 2005,Vol 22,No5口服二甲亚硝酸胺等肝毒性药物 1,或结扎胆总管等手术方法 2。早在 1969 年 McLean 3用 CCl4+苯巴比妥钠造模,饮水中加入苯巴比妥钠 350 mg/L,CCl4蒸汽吸入。以后 Proctor 4CCl4灌胃,在大鼠饮用含苯巴比妥钠 350 mg/L 的水 2 周肝脏极度肿大后,以 CCl4灌胃,用量为 CCl40.2 ml/kg 体重,5 d 1 次,按耐受情况调整 CCl4用量,此方法可缩短造模时间,8 10 周可形成肝硬化,但死亡率高达40%。1981 年 Chatamra 采用 50%CCl4、10%乙醇为主的多因素综合法来诱导大鼠肝硬化模型,诱导时间约 12 周,目前已成为一种标准的诱导方法 5。但也有作者认为该方法存在一定的缺陷,如动物模型形成周期长(12 周)、形成率低(低于 80%),部分大鼠还出现拒饮乙醇水导致脱水乃至死亡,因各种原因导致的死亡率甚至可超过 30%6,7。CCl4它是最早,最广泛应用、最能诱导肝硬化动物模型(Cirrhosis Model,CM)的化学毒物 8。经肝微粒体细胞色素 P450激活生成三氯化碳(?CCl3),攻击肝细胞膜的磷脂,引起脂质过氧化破坏膜性结构;?CCl3还与蛋白质形成共价键,损害线粒体还原性辅酶 A(NADH)与三磷酸腺甘(AT P)在肝内生成减少,脂肪酸氧化受到限制,影响三羧酸循环致肝细胞?窒息?死亡;内质网受损则脂蛋白合成障碍,甘油三酯和脂肪酸在肝细胞内蓄积。低浓度的 CCl4反复应用损害肝肾,肝脏损害-修复-损害最终形成肝硬化 8,9。早先报道用 CCl4造模多选用小鼠,选用大型动物亦有成功的报道 10。一般采用 30%60%CCl4油剂皮下注射,剂量因动物种类而不同。小鼠采用 1 3 ml/kg 体重,每周两次,肝硬化可在 12 15 周形成,但皮下注射过快吸收入全身循环系统,脑肾毒性大,注射位置易发生浸润性脓肿和溃疡,故死亡率可高达 30%40%。降低 CCl4浓度可降低死亡率,马学惠 11采用 20%的 CCl4死亡率为 11%。亦用腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物快速口服的方法。腹腔内注射门静脉浓度高,肝硬 化 形 成 时 间 短,但 死 亡 率 较 高(20%35%)10,12;灌胃法 CCl4亦可直接吸收入肝,但操作复杂,肠道反应大 13;蒸汽吸入需快速吸入,呼吸道刺激大,动物不耐受,中枢毒性大,易污染环境和伤害实验人员 11,溶于少许食物快速口服,少吃多餐,挥发减少,浓度低胃肠刺激减小,但受动物食欲影响,剂量难掌握,实验终点不明确,周期长 12,14。CCl4诱导慢性肝损伤的机理是直接损害肝细胞,破坏细胞的各种成分,造成肝细胞的脂肪变性与坏死,而乙醇为酶诱导剂,损害线粒体,增加肝细胞氧耗量,还可增强 CCl4对肝细胞的毒性作用,两者同时作用可促进肝硬化的形成 15。苯巴比妥钠通过提高细胞色素 P450活性,从而增加肝细胞对 CCl4的敏感性,在饮用水中加入苯巴比妥钠可促进大鼠产生持久的肝硬化 16。在此研究中,作者共选择了 90 只 SD 大鼠,到第 9 周造模成功,成模率 87.14%;而死亡率 12.86%,低于文献报道 17。实验结果显示实验组门静脉压力高于对照组,实验组肝功能明显损害,血液细胞显著降低,与对照组比较,均有显著差异。多因素致动物肝硬化是目前最常用方法,可节约时间,提高成模率与降低死亡率。韩德五等 17是国内最早采用复合因素制作大鼠肝硬化模型,采用高脂低蛋白食物,30%酒精为惟一饮料,皮下注射CCl4(第一次用 5 ml/kg,以后每隔 3 天皮下注射40%CCl4油剂 3 ml/kg),第 6 周末即可形成肝硬化;该方 法简单,成功率 高(100%)且死 亡率低(20%)。本实验对 CCl4的浓度进行改进,先用40%CCl4诱导 4 周,使大鼠对诱导药物产生一个耐受过程,再提高 CCl4的浓度至 50%,为了提高 CCl4的吸收率,故采用腹腔注射方法;乙醇溶液由食用白酒替代后动物饮水情况正常,即使浓度由 10%递增至 30%亦无一例出现拒饮现象,说明食用白酒在保证乙醇含量的前提下较医用乙醇溶液更适于大鼠饮用,这样诱导 9 周即可达到用 50%CCl4、10%乙醇诱导 12 周 的 效 果,肝 硬 化 模 型 成 功 率 较 高(87.14%)、死亡率低(12.86%),且诱导时间较传统的诱导方法明显缩短。综上所述,本实验成功地制备了大鼠肝硬化模型,为以后的实验研究打下了基础。本试验采用的大鼠模型制作方法能够制作肝硬化门脉高压症大鼠动物模型,此模型制作周期短(仅需 9 周),成模率高,死亡率低,具有简便、快捷、高效的优点,适于大批量制作。参?考?文?献 1?Madden JW,Gertman PM,Peaeock EE.Dimethylnitrosamine?induced hepatic cirrhosis:A new canine model of anancient human disease J.Surgery,1970,68(1):260?268.2?Martin J.Intrasplenic hepaticocellular transplantation as a he?patic support measure in cirrhotic dog s preliminary results J.Transp lant Proc,1987,19(5):3930.3?Mclean E,Mclean AEM,Sutton PM.Instant cirrhosis:An?621?医学临床研究?2005 年 5 月?第 22 卷?第 5 期?J Clin Res,May 2005,Vol 22,No5improved method for producing cirrhosis in rats by simultane?ous administration of carbon tetrachloride and phenobarbiton J.Br J Exp Pathol,1996,50(3):502?510.4?Proctcr E,Chatamra.High yield micronodular cirrhosis in therat J.Gastroenterology,1982,83(5):1183?1190.5?M ulen KD,Mropi M D,Mocollough AJ.Problems with animalmodels of chronic liver disease:suggestions for improvementin standardization J.Hep atology,1989,9:500?503.6?T amayo RP.Is cirrhosis of the liver ex perimentally producedby CCl4anadequatemodelofhumancirrhosis J?H ep atology,1983,3:112?120.7?Chae HB,Jang L C,Par SM,et al.An ex eperimetal model ofhepatic fibrosis induced by alcohol and CCl4:can the lipopo?lysaccharide prevent liver injury induced by alcohol and CCl4 J?Taehan K an H akhoe Chi,2002,8:173?178.8?Sherlock S.Progress report,heptic reaction to drugs J.Cut,1999,20(4):634?642.9?Cameron GR,Karunaratne WAE.Carbon tetrachloride cirrho?sis in liver regeneration J.J Pathol Bacterial,1986,42(1):1?5.10?吕明德,黄洁夫.腹腔注射四氯化碳配合营养控制制备犬肝硬化模型 J.中华实验外科杂志,1993,10(2):58?61.11?马学惠.肝纤维化动物模型的制作方法 J.中华肝脏病杂志,1996,4(1):58?61.12?Runyon BA,Sugano S,Kanel G,et al.A rodent 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时,如果胫骨远端较短,且腓骨已愈合,下胫腓关节相对较稳定时,应用骨节段转移应注意骨折端的对位。由于瘢痕的作用,某些病例可出现节段偏心移动并可在此情况下产生畸形愈合,在操作时应尽量避免。尽管切除外露骨过多加重了骨折端的创伤,增加了骨痂延长的长度,但由于其愈合能力低,可相对延长骨折愈合的时间。因此主张当外露骨过大时,应切除外露骨至软组织保护缘内,同时尽可能迟缓延长的时间及速度,在伤口出现愈合倾向后再延长 7。因此,骨节段转移术为治疗长骨创伤感染性骨不连接提供了一种新的、有效的治疗方法,可同时有效地解决软组织覆盖差,骨缺损,肢体缩短的问题,有利于局部感染的控制与骨不连接的治疗。参?考?文?献 1?张湘生,黎志宏,张冬,等.骨痂延长术治疗长骨创伤感染性骨不连接 J.医学临床研究,2003,20(8):586?588.2?杨柳,李起鸿,周印安,等.骨节段转移延长治疗长骨大段骨缺损的实验研究 J.中华创伤杂志,2000,5(6):276?278.3?王少卿,甄鑫刚,刘少辉.骨延长治疗胫骨感染性骨缺损 J.中国矫形外科杂志,2003,10(10):707?708.4?Pearson R,Perry CK.The ilizarov technique in the treatmentof infected tibial nonunions J.Orthop Rev,1989,241:146.5?Aland Aaron.Results of the wagner and llizarov methods oflimb Lengthening J.J Bone and J oint Surg,1996,78?A(1):20?29.6?张湘生,黎志宏,曾文,等.骨痂延长术治疗儿童长骨干大段病理性骨缺损 J.中国现代医学杂志,2003,8(6):64?66.7?江捍平,王大平.骨延长术治疗骨缺损进展 J.中国现代医学杂志,2004,4(14):66?68.(本文编辑:詹道友)?622?医学临床研究?2005 年 5 月?第 22 卷?第 5期?J Clin Res,May 2005,Vol 22,No5