SCAP在培养肝细胞脂肪变性模型中的表达及意义.pdf

A 现在武警重庆总队医院消化内科工作 400061A 通讯作者论 著SCAP 在培养肝细胞脂肪变性模型中的表达及意义杨林辉A，陈东风!（第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科，重庆 400042）摘 要：目的 探讨油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（srebp cieavage activating protein，SCAP）的表达及意义。方法 以正常肝细胞株 L-02 进行细胞培养，用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型。采用油红 0 染色观察细胞内的脂滴，并检测细胞内甘油三酯含量，RT-PCR 法检测 SCAP mRNA 的表达，Weston biot 检测 SCAP 蛋白的表达。结果 油红 0 染色显示 241 开始出现脂肪变性，1201 脂肪变性最重；模型组肝细胞内甘油三酯（TG）含量在各时相点较对照组显著升高，差异有统计学意义（P 0.01），1201 增高最明显；模型组 SCAP mRNA 的表达上调，于 241 开始增高，721 表达最强，与对照组相比差异有统计学意义（P 0.01）；SCAP 蛋白的表达 241 开始增高，1201 最强，与对照组相比差异有统计学意义（P 0.01）。结论 油酸诱导的脂肪变性肝细胞模型 SCAP 的表达增强，细胞内 TG 的合成增加，SCAP 可能参与了肝细胞的脂代谢及脂肪变性的形成。关键词：油酸；脂肪变肝细胞甘油三酯；SCAP中图分类号：R575.5文献标识码：A文章编号：1671-8348（2007）08-683-03Expression and role of SCAP in models of cultured steatosis hepatocytesYANC Lin-hui，CHEN Dong-feng（Department of Castroenterology，Institute of Field Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical Uniuersity，Chongging 400042，China）Abstract：Objective To expiore t1e expression and roie of SCAP in t1e modeis of cuitured steatosis 1epatocytes.Methods Steatosismodeis of 1epatocytes was estabiis1ed by adding oieic acid to t1e growing L-02 ceii strain.T1e expression of SCAP mRNA was measuredwit1 RT-PCR and t1e protein expression of SCAP were measured by Western biot，iipid dropiets in t1e 1epatocytes were observed wit1 oiired staining and t1e contents of trigiyceride in 1epatocytes were measured wit1 anaiyzed kit.Results In modei groups，mRNA expression ofSCAP increased at 241，and eievated remarkabiy at 721 compared wit1 t1e normai controi group（P 0.01），and protein expression ofSCAP increased at 241，and eievated remarkabiy at 1201 compared wit1 t1e controi group（P 0.01）.Trigiyceride contents in 1epatocytesof t1ese groups aiso increased.T1roug1 oii red staining，a few iipid dropiets were observed at 241 and steatosis 1epatocyte increased greatiyat 1201.Conclusion T1e overexpression of SCAP in modei groups couid iead to disturbance of iipid metaboiism and probabiy SCAP par-ticipates t1e process of steatosis of 1epatocytes.Key words：oieic acid；steatosis 1epatocyte；trigiyceride；SCAP 非酒精性脂肪性肝病（non-aico1oiic fatty iiver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史，肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，其发病机制未完全明确。研究显示胰岛素抵抗、脂质代谢异常和线粒体功能障碍、氧应激及脂质过氧化损伤等多种因素参与了非酒精性脂肪肝的发病过程，其中脂质代谢异常被认为是最关键和基础的环节之一1。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（srebp cieavage activatingprotein，SCAP）被认为是哺乳动物脂质合成和摄入的中心调节因子，在脂质代谢的平衡调节中起着非常重要的作用。研究表明人类 SCAP 基因遗传变异将会导致血浆脂质代谢改变和组织中脂质代谢紊乱2，SCAP 异常是促成动脉粥样硬化的重要因素，而 SCAP 在 NAFLD 形成过程中的变化及作用鲜见报道。目前对 NAFLD 的研究主要采用的是动物模型，鲜有进行细胞模型的研究。本实验采用油酸诱导建立培养的肝细胞脂肪变性模型，并探讨 SCAP 在肝细胞脂肪变性形成过程中的作用。1 材料与方法1.1 主要试剂 L-02 肝细胞株购自中科院上海细胞所，胎牛血清（杭州四季青公司），山羊抗人 SCAP 多克隆抗体（SantaCruz 公司），Trizoi（invotrigen 公司），RT-PCR 试剂盒（南京博大泰克公司），油红 0（Sigma 公司），甘油三酯检测试剂盒（南京建成生物研究所）Western biot 检测试剂盒购自美国 Pierce 公司。1.2 培养肝细胞脂肪变性模型的建立 正常成人肝细胞株L-02，用含 10%胎牛血清的 1640 培养基培养于 96 孔板中，分别加入含不同浓度的油酸，用 MTT 比色法确定诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓度。然后在正常培养基中添加该浓度的油酸培养 1201，用油红 0 染色3进行鉴定。实验分组：对照组和模型组，同时设立 24、48、72、1201 等时相点。1.3 肝细胞内甘油三酯含量的测定 细胞种植于 6 孔培养板内，每孔为 1 个样本，每组设 6 个样本，分别于培养 24、48、72、1201 后收集细胞，反复冻融裂解细胞，3 000r/min 离心 10min，取上清检测甘油三酯的含量，方法按试剂盒说明进行。1.4 检测肝细胞 SCAP mRNA 的表达 细胞种植于 6 孔培养板内，分为对照组和模型组，对照组 481 后收集细胞，模型组分别于培养 24、48、72、1201 后收集细胞。用冰预冷的 PBS 液冲洗培养孔 3 遍，加入 Invotrigen 公司的 Trizoi 试剂 1mi，吹打细胞，室温静置10min，按 Trizoi 说明书操作，提取细胞总 RNA，电泳分析其完整性，测纯度，定量，-70C保存。引物采用 Primerdesign 软件设计，由上海生工合成。SCAP：sense：5-GGC ATCAAG TTC TAC TCC ATT C-3，antisense：5-AGC ACA GAG GGCACA TAC AC-3扩增片段长度 257bp；-actin sense：5-CGTGGA CAT CCG CAA AGA C-3，antisense：5-CAA GAA AGG386重庆医学 2007 年 4 月第 36 卷第 8 期GTG TAA CGC AAC T-3扩增片段长度 307bp，反转录合成 cD-NA 反应体系：在 0.2mI 薄壁管中加入样品总 RNA l.0!g，Rnasin 0.4!I，M-MLV 逆转录酶 l!I，逆转录 5 X 反应缓冲液5!I，oIigo（CT）l6 l!I，l0mmoI/L CNTP l!I，去离子水补足20!I，37C反应 l20min，95C变性 5min 终止反应，-20C保存备用。设立阴性对照，即用 DEPC-去离子水代替样品总 RNA。扩增条件：95C预变性 5min，95C变性 30s，56C退火 30s，72C延伸 30s，32 个循环。RT-PCR 产物的鉴定和产量分析：各组的同一目的 mRNA 以相同的条件同时进行逆转录及 PCR 扩增，扩增产物在同一张琼脂糖凝胶上进行电泳，电压 l00V，电泳30min，在紫外灯下观察电泳结果，于 GeIDoc 2000 凝胶图像分析系统进行扫描，用 BanCScan 软件分析。测定产物条带的积分吸光度，以目的产物和内参照比值表示其相对含量。1.5 肝细胞 SCAP 蛋白表达（Western bIot）细胞种植于 6 孔培养板内，分为对照组和模型组，对照组收集培养 721 的细胞，模型组分别于培养 24、48、72、l201 后收集细胞。在培养肝细胞的 6 孔板中，每孔加入预冷 RIPA 缓冲液（50mmoI/L Tirs-HCI 缓冲液：含 l50mmoI/L NaCI、l%NP-40、l%脱氧胆酸钠、0.l%SDS、l0mmoI/L EDTA、2l5mmoI/L EGTA、lmmoI/L 钒酸钠）l00!I，吸管吹打数次以充分裂解细胞，4C l5 000r/min 离心l5min，取上清并用 FoIin 酚法测定蛋白浓度。各组取 l0!g 细胞蛋白 SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳采用 80g/L 的分离胶，50g/L 的积层胶，上样后 60V，恒压电泳约 50min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处，换恒压 80V 电泳 21，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部，电转法将分离胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜（20V，l71）。膜用 50g/L 脱脂奶粉+l0g/L BSA 的 l X TBS 溶液封闭l21，再用一抗（SCAP lf 500）4C下孵育l21，二抗室温孵育 60min，用发光试剂检测结合的辣根过氧化物酶标记的二抗，X 线片显影。1.6 统计学处理 实验所得计量资料采用!1 表示，采用SPSSl0.0 软件进行单因素方差分析，#0.05 表示差异有统计学意义。2 结 果2.1 油红 0 染色显示培养肝细胞脂肪变性 对照组细胞边缘清晰，细胞内未见橘红色脂滴（图 l），油酸诱导浓度为l0!g/mI，处理 721 的肝细胞油红 0 染色见细胞内有大小不等的橘红色脂滴聚集（图 2），表明成功建立了肝细胞脂肪变性模型。表 l 培养肝细胞内甘油三酯含量 mg/（l07ceII），$=6组别01241481721l201对照组2.4l 10.482.48 10.6l2.54 10.562.53 10.542.67 10.66模型组-4.2l 10.565.37 10.786.45 1l.208.32 1l.45 与对照组比较，#0.0l。表 2 肝细胞脂肪变性模型 SCAP mRNA 及蛋白表达的变化（积分吸光度 A，$=6）组别对照组模型组241481721l201SCAP mRNA0.l5 10.020.45 10.030.82 10.05l.54 10.l0l.27 10.09SCAP 蛋白l68.30 1l3.24236.34 1ll.474l3.50 132.97687.42 14l.36l 039.40 126.52 与 C 组比较，#0.0l。图 l 对照组（油红 0 染色 Xl00）图 2 模型组（油红 0 染色 X400）2.2 肝细胞内 TG 含量的比较 实验结果表明：模型组肝细胞中甘油三酯含量较对照组明显升高，差异有统计学意义（#0.0l），各时相点比较差异有统计学意义（#0.0l），提示肝细胞内 TG 合成随时间延长而增加（表 l）。图 3 RT-PCR 显示 SCAP mRNA 的表达（C 为对照组）图 4 weston bIot 显示 SCAP 蛋白的表达2.3 肝细胞 SCAP mRNA 的表达 由表2 和图3 可以看出：各组各时相点均有 SCAP mRNA 的阳性扩增条带，扩增长度为257bp。模型组从 241 开始 mRNA 转录增多，721 增加最明显，l201 开始下降，但仍高于 C 组，提示模型组肝细胞 mRNA 表达486重庆医学 2007 年 4 月第 36 卷第 8 期较对照组增强，差异有统计学意义（!0.01）。!.肝细胞 SCAP 蛋白表达 由表 2 和图 4 可看出：各组各时相点均有 SCAP 蛋白的表达，模型组从 24h 开始表达增强，48、72h 进一步增加，120h 时增加幅度最明显，与正常组相比差异有统计学意义（!0.01），见图 2。#$讨$论非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制至今尚未完全明确。在发达和发展中国家，超重及肥胖个体日益增多，临床医生面临着更多的 NAFLD 患者。近来的研究表明，非酒精性脂肪肝并不是一种良性及静止的病变，它可在较短期内发展为不可逆的肝损害，部分患者可进展为肝硬化4，有报道它还可发展成原发性肝癌5。因此，加强对 NAFLD 的深入研究具有重要意义。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）被认为是哺乳动物脂质合成和摄入的重要调节因子6，在脂质代谢的平衡调节中起着非常重要的作用。SCAP 定位于内质网膜，与膜结合转录因子胆固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）等调节因子共同控制一系列酶编码基因的转录过程。当细胞内胆固醇浓度降低时，SCAP 激活 SREBP 的 2 次蛋白酶解过程，从而释放有活性的转录因子片段。这些片段进入细胞核，激活维持细胞内脂质合成的相关的靶基因如脂肪酸合成酶7等和 LDL-R 摄入脂质过程中所需的酶基因转录8。本实验发现用油酸作用于培养的肝细胞 24h 后，SCAPmRNA 表达及蛋白表达增强，随造模时间的延长，SCAP mRNA表达逐渐增加，到 72h 表达最强，与正常对照组比较差异有统计学意义，120h 开始下降，但仍然高于正常。SCAP 蛋白表达也逐渐增加，到 120h 后增加幅度最明显，与正常对照组比较差异有统计学意义。同时模型组脂肪变细胞增多，甘油三酯含量明显增加，120h 增加最明显，油红染色显示此时肝细胞脂肪变性最重。以上表明随着 SCAP 表达增加，肝细胞内 TG 合成也增加，肝细胞脂肪变性加重。推测可能是 SCAP 的表达增强，激活了 SREBP 的裂解，进入核内的 SREBP 增多，从而激活其下游的 TG 合成酶、脂肪酸合成酶等系列靶基因转录，最终使肝细胞内 TG 合成大大增加，TG 堆积导致脂肪变性。这都提示SCAP 可能在肝细胞脂肪变性过程中扮演了重要角色，SCAP本身可能参与了肝细胞脂肪变性过程，与肝细胞脂肪变性密切相关。SCAP mRNA 与蛋白表达并非同时达到最高值，表明二者表达不同步，mRNA 先于蛋白的表达；另一方面，可能是随造模时间的延长，激活 SCAP mRNA 表达的因素逐渐减弱。我们的研究结果提示，由 SCAP 介导的脂代谢异常可能是肝细胞脂肪变性的重要机制。进一步探讨 SCAP 介导的脂质合成通路在肝细胞脂肪变性发生发展中的作用，有助于阐明非酒精性脂肪肝的发病机制，为脂肪肝的治疗和预防提供新的线索。参考文献：1 McCiain CJ，Sriprakash L，Barave SS，et ai.Mechanisms ofnon-aicohoiic steatohepatitis J.Aicohoi，2004，34（1）：672 Yabe D，Xia ZP，Adams CM，et ai.Three mutations in steroisensing domain of SCAP biock interaction with insig and ren-der SREBP cieavage insensitive to sterois J.Proc NatiAcad Sci，2002，99（26）：166723 杜卓民 主编.实用组织学技术 M.第 2 版.北京：人民卫生出版社，1998.3184 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