白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性.pdf

河北医科大学第四医院科研中心（石家庄#$#!）；%日本产业医科大学免疫学教研室!博士 博士之窗 白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性单保恩!张金艳!杜肖娜!李巧霞!山下优毅%吉田安宏%杉浦勉%内容提要目的：研究白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性。方法：用&介入法分析了白花蛇舌草提取物（()*+,)-,*.-*./0 1-+2 3 4-5 3，(6 7）对小鼠脾细胞的增殖活性；用$!8 4游离实验测定了小鼠和人杀伤细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性，用7 9:;-:(?处理）分析了白花蛇舌草的化学成分。结果：(6 7对小鼠脾细胞的增殖活性有很强的促进作用；(6 7增强小鼠和人杀伤细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性，增强=细胞抗体的产生以及单核细胞的细胞因子产生，并增强单核细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。白花蛇舌草的化学成分为#道尔顿的糖蛋白。结论：(6 7对小鼠和人有免疫调节作用，并通过刺激机体的免疫系统杀伤或吞噬肿瘤细胞，这些活性可应用于临床调节免疫功能和治疗肿瘤等疾病。关键词白花蛇舌草A细胞=细胞单核细胞抗肿瘤活性糖蛋白!#$%&#()%*+,-)./.)+($&,$).0 1#%*,-)./.)+%23&4$($&.(5.2 2#6(.$/.)*%;=-B C+,，D EF.,C G-,，6 H I.-B C,-，+3-)!#$#%#&()#*+#,+-.%/0+&1，-#2#03#4 0(&15*0 6#%0+7，8 0 9 0&:;&*=?）3 7 8 4-)./4：A B 1 3 0*G 3 J+/+5 3 B/()*+,)-,*.-*./0 1-（(6）B,)G K L J B 5 G 3+1-,*3 0 K B 4 5+)1.,M.3 4 B N 9 4):0%&6：7/+5 3 1 B/(6+2 3 4-5 3（(6 7）B,L 4 B)./+4-3.B,B/1 L)+,5+)1 B/K.5+-,*3 J+L J-O B 5 G 3 B 1.1 B/K B,B 5 G 3+1 3 B3 0 K B 4 5+)1 0 1.,O&.,5 B 4 L B 4-3.BP+4+-,-)G 1+*，-,*+/+5 3 B,1 L+5./.5-5 3.M.3 GB/,-3 0 4-)Q.)+4（R）5+)1 3 BJ 0 K-,-,*K.5+S 1 3 0 K B 4 5+)1P-1*+3+4 K.,+*0 1.,O/4+$!8 4+2 L+4.K+,3 1，+/+5 3 1 B,=5+)1 S-,3.T B*GL 4 B*0 5 C3.B,-,*5 G 3 B Q.,+B/K B,B 5 G 3+L 4 B*0 5 3.B,P+4+.,M+1 3.O-3+*T G7 9:;-:(?）3+1 3 N;4 06#)6：(6 75 B 0)*M.O B 4 B 0 1)GL 4 B K B 3+3 J+L 4 B)./+4-3.M+-5 3.M.3 GB/1 L)+,5+)1.,K.5+，1 L+5./.5)+3 J-)-5 3.M.3 GB/J 0 K-,-,*K.5+S 1 R5+)3 B 3 0 K B 4 5+)1，=5+)1 S-,3.T B*GL 4 B*0 5 3.B,，K B,B 5 G 3+1 S 5 G 3 B Q.,+L 4 B*0 5 3.B,-,*.3 1L J-O B 5 G 3 B 1.1 3 B4+K B M+3 J+3 0 K B 45+)1 N=GK+-,1B/5 J 4 B K-3 B O 4-L J G，L 4 B 3+-1+7*.O+1 3.B,-,*-:(?3 4+-3 CK+,3，3 J+4+1 0)3 B/5 J+K.5-)5 B K L B 1 3.B,-,-)G 1.1 1 J B P+*3 J-3 3 J+5 B K L B,+,3 B/(6P-1#Q 6-O)G 5 B L 4 B 3+.,N%*&6()*+,)-,*.-*./0 1-，A 5+)，=5+)，K B,B 5 G 3+，-,3.C 3 0 K B 4-5 3.M.3 G，O)G 5 B L 4 B 3+.,白花蛇舌草为茜草科一年生草本植物，主要功效为清热解毒和利尿（!）。有报道动物实验结果表明白花蛇舌草有抗肿瘤作用，故也用于消化道肿瘤的治疗；也有报道白花蛇舌草有免疫学活性（%），但其免疫调节机制和抗肿瘤作用机制尚未明了。本研究应用小鼠脾细胞和人淋巴细胞研究白花蛇舌草提取物（(6 7）对小鼠和人的免调节机制和抗肿瘤机制。材料和方法!实验动物和材料实验中应用的=9=5和8&+F小鼠均购自;+.P-实验动物中心（V B 1 J.3 B CK.，(J.3-，F-L-,）。雌雄兼用，W!X周龄。白花蛇舌#Y&中国中西医结合杂志%#!年$月第%!卷第$期万方数据草的提取：!白花蛇舌草浸泡于!#$%蒸馏水中，过夜后用微火煮沸&#$(，待凉后用滤纸过滤，并用一次性针头滤器（)*+(,%*+-./0 1 23+4 5+，6 77(）抽滤后放冰箱备用。8脾细胞及人周围血淋巴细胞的分离和增殖反应分析脾细胞：将小鼠折颈处死后，采用无菌操作法取脾脏，并制成细胞悬液。人周围血淋巴细胞：肝素抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（即淋巴细胞）。脾细胞和淋巴细胞（89!#:）与!#!$%刀豆素;（/7?-7 0+-.，A 7(,+0.+，;，B A;2），!#!$%脂 多 糖（/*+*+%5 7 C C D 7-1.，/E A，A$7 D.$C 7%+2）或不同稀释倍数的F G=在含有!#H胎牛血清（I A）的J E,K!&L#培养基中，于M&孔培养板（)+2 N#O 8，I 7%C+(E%7 0 C，F P Q 7-1，;2 B A;2），在:H F8，N O R条件下（培养条件下同）培养N天。在培养结束前!:D各培养孔加入#S:!（微居里）的NT U胸腺嘧啶（NT U 3 1 J，特异性活性为&S#$+%，;$.-U D 7$E%C，V Q C 4 (D 7$D -.，B W2）。用细胞收集器（上海跃进医疗器械厂）将细胞收集（N）。细胞内结合于G);的放射线的量用多功能液体闪烁仪（/A&:#，V.C 4$7(C+(0 0.-，B A;2）测定。结果用结合于小鼠脾细胞和淋巴细胞NT U 3 1 J的平均每分钟计数（C*$）和标准差（!）来表示。N杀伤性3细胞（3/）的细胞毒活性测定小鼠脾细胞或人淋巴细胞（8 9!#与,0+$5 C (处理过的成人3细胞白血病细胞株,3 U 8（!#:）在F G=（空白加E V A）作用下，N O R培养N天，以诱导对,3 U 8有特异性的杀伤细胞。其杀伤活性用放射性铬酸钠（:!-）游离实验测定（L）：将用（:!-）标记的,3 U 8（!#L）细胞分别与&S 8:9!#L，!8 S:9!#L，8:9!#L激活的杀伤性3细胞在#S 8$%培养液中培养:D，将培养板离心收集每孔之上清液，测定上清液中的放射线活性（C*$）。特异性杀伤百分率计算公式为 （试验孔C*$X对照孔C*$）（最大释放C*$X对照孔C*$）9!#H。最大释放值为:!-标记的,3 U 8细胞与!H)+(1.0E U L#培养后所得的上清液C*$，对照孔值为:!7 C U!，对人加入Z:&N细胞），N O R继续培养L D，培养结束前!:D各培养孔加入NT U 3 1 J，收集细胞并计数由细胞吸收的NT U 3 1 J量（O）。结果用抑制百分率和标准差来表示。对肿瘤细胞抑制率的公式为!X（肿瘤细胞C*$单核细胞C*$X单独单核细胞C*$）单独肿瘤细胞C*$9!#H。O有 效 成 分 的 提 取将8$%F G=加 样 于A.*D+C-5%A U 8#层析柱（8 S#9!:C$），用E V A平衡流速至!#$%D。每管收集8$%层析液。各管中的蛋白质含量用紫外分光光度计测定8#($吸光度值；糖含量用酚X硫酸法测定，结果用L M 8($吸光度值表示（:）。各成分的增殖活性由NT介入法测定小鼠脾细胞的增殖反应，结果用NT U 3 1 J吸入量（C*$）值表示。各成分的分子量由标准分子量物质测定（V%Q.G.P 0-7(0：8#，A$7；牛血清白蛋白，0：&#，A$7；7-?+(C 7(D 5 1-7 .，0：8 M#，A$7 2各种蛋白质8$溶于!S N$%E V A后上样），根据标准分子量物质析出的管数与吸光度（F G）值绘制标准曲线，从曲线上查取各成分分子量。蛋白酶=和)7 K FL处理蛋白酶=处理：!$F G=或从层析柱分离的有效成分加入#S L E-+(7 .=（A$7）在L$%含有:#$+%/7%8的#S!$+%/3-U T%（*T S#）缓冲液中于N O R培养N&D后，再加入#S 8$E-+(7 .=继续培养N&D，然后将反应混合物于!#R加热!#$(以灭活E-+(7 .=，最后用E V A透析后备用。)7 K FL处理：!$F G=或从层析柱分离的有效成分与!#!%#2!$+%/)7 K FL于N O R培养L D后，加入=0 D 5%.(.%5 C+%（A$7）（），然后将反应液用E V A透析后备用。M统计学处理数据用平均值标准差表示。计量资料用检验，两组数据计算相关系数的显著性检验。结果!F G=对小鼠脾细胞增殖的作用见图!。!ON中国中西医结合杂志8#!年:月第8!卷第:期万方数据!#显著地刺激了小鼠脾细胞的增殖并有浓度依存图!$%&对%(%)小鼠脾细胞增殖的作用注：与$%&处理比较，!*+*,性（!*+*,）。因,-.*倍稀释的!#作用最强，所以在以后的实验中均采用,-.*倍稀释的!#。/!#增强杀伤性0细胞（1 0(）的细胞毒活性见表,，2。!#显著地增强了小鼠0细胞对3 4 5 6 3 7 8 9 6:;7特异性细胞毒活性（!*+*,）。也显著地增强了人1 0(的细胞毒活性（!*+*,）。表!#对小鼠1 0(特异性杀伤作用的影响（#-,/+-,?+/-,$%&?2,+?*+,/+2 *+,/+,?2/?+,+/!,A+?,+2!,*+A !#增强单核细胞对肿瘤细胞的吞噬功能见表.。!#对小鼠和人单核细胞的增殖无抑制作用（!$*+*），对单独肿瘤细胞也无明显抑制作用（!$*+*），当加入单核细胞后对肿瘤细胞显示了较强的抑制作用（!*+*,）。这说明!#是通过刺激机体的免疫系统来抑制肿瘤生长的。?!#的有效成分是糖蛋白最后我们提取了白花蛇舌草的有效成分，通过&;F G 5)H I 4&6/*层析柱分离并用标准分子量测定表明白花蛇舌草有效成分的分子量约为J*道尔顿，从层析分离曲线上看，对小鼠脾细胞有增殖活性的峰由蛋白质和糖重叠，该峰的成分其活性对蛋白酶消化和C 3 E!.处理都敏感，证明该成分为糖蛋白物质（图/）。表!#对小鼠%细胞E:K及单核细胞0 C D 6!、E(6?产生的影响（#）小鼠脾细胞培养与处理E:K（:(）0 C D 6!（LM 4）E(6?（:(）$%&2*+.,J+*+/.*+,*+,($&N.+/+2!?2+,N+,!.+*+!#?A+?,+.+2!?+*+/!表#!#对人1 0(活性、%细胞E:K以及单核细胞0 C D 6!和E(6,产生的影响（#）淋巴细胞培养与处理1 0(（=）E:K（:(）0 C D 6!（LM 4）E(6,（:(）$%&/+2 *+,2*+N ,J+*/.+N 2+2,A+?($&N.+*+?+!/*+2!#,A+N /+2!,/*+/+N!/*+A!表$!#对小鼠和人单核细胞吞噬功能的影响（#.+/,N J+,2 J+J /+*/*+2 +J 2.+2,?+N 2+/2 2+,/?J+.+N,A J A+.2/,+,/2+?*+,!#N N/+N ,*+/*+J +J ./+/!人单核细胞$%&.*N.+N +?,/.+?.+J.A.A,+?+N!#/?A J,+A ,+/,*,+?/J+?,*.A*+2 ,A/J+/2 2+A 月第/,卷第期万方数据图!：用层析法分离的#$各管中蛋白质、糖含量以及对小鼠脾细胞的增殖反应曲线；%：#$和经层析法分离的活性成分（&()*）用蛋白酶$和+,-*处理后测定其对小鼠脾细胞增殖活性./0是广泛应用的%细胞有丝分裂剂，./0来自于细菌内毒素，也可来自植物。该实验中#$的%细胞刺激活性不是来自./0的污染，因为，虽然1)22 3 4小鼠脾细胞对./0呈低反应性，但#$仍能显著刺激其增殖（结果未显示）；另外，/5 6 7 8 7 9:;%可以抑制./0的反应，但不能抑制#$的活性（结果未显示）。#$刺激单核细胞产生细胞因子如和-.=?等，并增强单核细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。以上这些结果可以说明#$对小鼠和人有免疫调节作用，并通过刺激机体的免疫系统抵抗肿瘤的生长。有些中药有抗诱变和抗肿瘤活性（），抗肿瘤活性是与其增强免疫功能有关（A）。本研究着重进行了体外实验研究，但作为预实验我们也发现向患肿瘤小鼠体内投入#$后明显抑制了肿瘤的生长，恢复了被抑制的免疫功能，与对照组相比，寿命明显延长（结果未显示）。这说明#$不仅在体外，在体内也有免疫调节作用和抗肿瘤作用。我们认为在体内#$作用于免疫系统，使，B）。我们的结果显示白花蛇舌草的有效成分其分子量约为 A道尔顿，在其活性峰上有蛋白质和糖质峰重叠，为了进一步证实该有效成分是一种糖蛋白，对该成分分别进行了蛋白酶消化和+,-*处理，结果该成分对这两种处理均敏感，证明该有效成分是一种糖蛋白。白花蛇舌草对小鼠和人有免疫调节作用，并通过刺激机体的免疫系统抵抗肿瘤的生长和其他疾病的发生。该结果对更有效地开发白花蛇舌草的药理活性提供有效的数据。参考文献(崔树德(中药大全(哈尔宾：黑龙江科学出版社，C D)A B(B(吴厚铭，黄胜余，劳霞飞(白花蛇舌草免疫多糖研究(有机化学 B；B（*）D*)()(0 E,;%$，F 3 G:H，0 I J:I ,D)C)C (*(0 E,;%$，T,5 L E:M,T，0 I J:I ,；C D*C(U(S I Q QSV，W:Q Q 5 M$W(/I :Q:N,K:5;,;MP E 7 L:N 5 N E 3 8:N,6 N E,=,N K 3 :X,K:5;5 Q,O O:KK I 8 5;3 N 5 L:LQ,N K 5 (4(-8 8 I;5 6 C A；B D?Y?Y Y(?(0 E,;%$，T,5 L E:M,T，H I 5 M,$，3 K,6(-8 8 I;5 8 5 M I 6,K:;J,N K:R:K 75 Q L 3,Z 3 3 M 3 9 K ,N K 5;E I 8,;6 7 8 P E 5 N 7 K 3 L:;R:K 5(-;K4(-8 8 I;5 P E,8,N 5 6 ；B D U Y A(Y(H I ,K,0，L I N E:7,，+5 :8 I ,，3 K,6($R:M 3;N 3 Q 5 N 7 K 5=L K,K:N 3N 3 6 6,N K:R:K 7:;K E 33 Q Q 3 N K 5 8 3 N E,;:L 8,J,:;L KL 7;=J 3;3:N V 年U月第B 卷第U期!#$%&()*；*+,-(./+0)0 1 2 34，4 5 6 7 8 9 3 4，1$%:，8 9 3&0;$8 6 9%6?6$7 6$3=A%B5 C?=3 9 8 5 3 6$%D 8 3 E#6=93$9 6 7 8$9 8=8?F 6=8 0 G 0;&8=7 CH&6$!#$%&()I；)+,/I.*0(0 J 8 G，K 6$7L，M 5 3$7N，8 9 3&0 1$9 5 8=%&8%D 5 C?=%O C&=3?6 3&3$?9 5 8 8 D D 8 9%D 9 8 9=3$?=6$8%$#&8 3=D 3 9%=B 2 3 3P3 9 6 Q 3 B9 6%A C 9 3 9 8*B 3 8 9 3 9 8 0;$0H&6$0S 3 A 04 6R+；*+,./I 0+0 T 3$7G M，U#=3V，4 5 6#=3:，8 93&0;$9 6 9#%=3 9 6 Q 6 9 C%D 3 5 3=6?8D=%3 H 5 6$8 8 8?6 6$3&5 8=A，;3$B9 5%0 H 3$8=S 8 9 9(R；./,I()-0 0 1 5 9 3 2 8W，4#X#2 6Y，K 6 3 2#5 3=3V，8 9 3&0L%?#&3 9 6%$%D&#$7&%3&6#$8=8 8 A C%=3&3?6$6 9=3 9 6%$%D35 8=A 3&8?6 6$8 4 V%B 3%2%B 9%0!$9 0 G 0!#$%9 3 9 6 8 D D 8 9%D3$3#9%O 6?3 9 6%$B=8 6 9 3$93$?&6%=A 6 3 6?8=6 Q 3 9 6%$9 5=%#7 56$5 6 A 6 9 6%$%D 9#%=6$Q 3 6%$0;$9 6 H 3$8=Y 8 R+；R+,*)0（收稿：R+.+.修回：R+R +/）-I*中国中西医结合杂志R+年/月第R 卷第/期万方数据白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性作者：单保恩，张金艳，杜肖娜，李巧霞，山下优毅，吉田安宏，杉浦勉作者单位：单保恩,张金艳,杜肖娜,李巧霞(河北医科大学第四医院科研中心石家庄 050011)，山下优毅,吉田安宏,杉浦勉(日本产业医科大学免疫学教研室)刊名：中国中西医结合杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF INTEGRATD TRADITIONAL AND WESTERN MEDICINE年，卷(期)：2001,21(5)被引用次数：104次 参考文献(12条)参考文献(12条)1.Wang JZ;Tsumura H;Shimura K Antitumor activity of polysaccharide from a Chinese medicinalherbAcanthopanax giraldii Harms 19922.崔树德 中药大全 19893.Ye J;Ding M;Zhang X On the role of hydroxyl radical and the effect of tetrandrine on nuclear factor-kappa B activation by phorbol 12-myristate 13-acetate 20004.Oka S;Shigeta S;Ono K An epitope residing in carbohydrate chains of sea squirt antigen termed Girep外文期刊 19875.Kurata S;Tsuchiya T;Norimura T 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