亚低温治疗对脑缺血大鼠AQP4基因表达及血脑屏障通透性的影响.pdf

文章编号:1003?2754(2011)05?0429?04亚低温治疗对脑缺血大鼠 AQP4基因表达及血脑屏障通透性的影响任?丽1,?王玉凯2,?李红芳1,?陈?芸1,?郝永楠1,?徐?鹏1?收稿日期:2011?01?12;修订日期:2011?03?15作者单位:(1.济宁医学院附属医院神经内科,山东 济宁 272029;2中山大学附属佛山医院神经内科,广东 佛山 528000)通讯作者:任?丽,E?mai:l lily.rensd ?摘?要:?目的?观察亚低温治疗对脑缺血大鼠 AQP4表达和血脑屏障通透性的变化的影响,探讨亚低温减轻缺血性脑水肿的可能机制。方法?线栓法制作脑缺血大鼠模型,实验分常温组、亚低温组和假手术组,分别在缺血后 6h、24h、48h、72h用干湿重法测脑组织含水量,荧光法检测血脑屏障通透性的改变,原位杂交检测 AQP4的表达变化。结果?假手术组脑组织含水量、血脑屏障通透性、AQP4表达无变化。缺血组脑组织含水量和血脑屏障通透性增加,AQP4表达上调,缺血 48 72h变化最显著。相同时间点常温组脑组织含水量和血脑屏障通透性增加、AQP4的表达上调比亚低温组明显,两组之间的差异具有统计学意义(P 0.05)。结论?亚低温条件下 AQP4表达下调、血脑屏障通透性和脑水肿程度减轻。亚低温可能通过下调 AQP4表达、减轻血脑屏障通透性,减轻缺血性脑水肿。关键词:?亚低温;?脑缺血;?AQP4;?血脑屏障中图分类号:R743.3?文献标识码:AInfluence ofm ild hypother m ia on the expression ofAQP4 and the per m eability of blood?brain barrier after rat cer?ebral ische m ia?REN Li,WANG Yu?kai,LIH ong?fang,et al.(Depart ment ofN eurology AffiliatedH ospital of JiningM edi?calCollage,Jining 272029,China)Abstract:?Objective?To study the influence ofm ild hypother mia on the expression ofAQP4 and the per meability ofblood?brain barrier(BBB)after rat cerebral ische m ia,and to detect themechanisms ofmild hypothermia that decreases thewater content in ische m ic brain tissue.M ethods?Cerebral ische m ic models were established by occluding unilateralmid?dle cerebral arteries of rats w ith threads.The rats were divided into nor mal te mperature(NT)group,m ild hypother m ic(MHT)group and sham operation group.The brainwater contentwasmeasured by thewet?dryweighingmethod at the sameti mes.The per meability ofBBB was observedw ith fluorophoto metrymethod and the expression ofAQP4wasmeasured within situ hybridizationmethod on 6h,24h,48h and 72h after cerebral ische m ia.Results?In sham operation group,the brainwater content,the permeability ofBBB and the expression ofAQP4 had no changes.The expression ofAQP4was up?regula?ted.The brain water content and the permeability ofBBB in ische m ic tissue increased.The changes beca me most obviousduring 48h to 72h after cerebral ische m ia.And the changes inNT weremore serious than those inMHT group at the sameti me(P 0.05).Conclusions?Underm ild hypother m ia,the expression ofAQP4wasdown?regulated,and the per meabilityofBBB and the brain edema decreased after cerebral ische m ia.One of themechanisms ofmild hypother m ia could decreasethe water content in ischemic brain tissue,may be through down?regulation the expression ofAQP4 and decreasing the per?meability ofBBB.K ey words:?M ild hypother m ia;?Cerebral ische m ia;?AQP4;?Blood?brain barrier?水通道蛋白家族中的水通道蛋白 4(aquapor?in4,AQP4)与脑水肿的发生有着密切关系 1,抑制AQP4表达或降低它的活性可以控制脑水肿的发生、发展 2。血脑屏障(B lood?Brain Barrier,BBB)通透性的增加与脑水肿形成有关。亚低温治疗可以减轻脑水肿、降低颅内压,对缺血性脑损伤具有保护作用 3 5。亚低温条件下,AQP4表达和 BBB通透性是否有变化?故本研究通过脑缺血的大鼠模型,观察亚低温条件下 AQP4基因表达和 BBB通透性的变化,探讨亚低温治疗减轻缺血性脑水肿的可能机制。1?材料与方法1.1?主要试剂?兔抗 C?AQP4(Che m icon公司?429?中风与神经疾病杂志?2011年 5月?第 28卷?第 5期产品)。SAP法免疫组化试剂盒(武汉博士德公司产品)。1.2?动物模型及分组?SPF级健康雄性 SD大鼠 120只,体重 200 300g。符合国家卫生部颁发的实验动物清洁级标准(实验动物质量合格证许可证号:SCXK(粤)2004?0011 粤监证号 2008A010)。实验期间所用动物饲养于中山大学北校区动物实验中心,5只/笼,任意供水,颗粒鼠粮喂养,光暗周期12h。所有模型制备均在中山大学北校区实验动物中心实验室完成(屏蔽动物实验室使用证明编号:NO.0021275),手术场所及所用器具严格消毒,全部操作在无菌条件下进行。按照随机原则将大鼠分为脑缺血常温组(nor?mal temperature group,NT)(48只)、脑缺血亚低温组(m ild hypother m ic group,MHT)(48只)和假手术对照组(sha m operation group,SO)(24只)。大鼠术前 12h禁食 6h禁水,线栓法制作大鼠脑缺血动物模型 6。假手术组:除不插鱼线外,其余操作与脑缺血组相同。常温组手术过程中用电取暖器维持肛温在36?37?。术后置于 25?的房间。亚低温组在缺血后立即采用喷洒酒精和电扇降温的方法在10m in内使温度维持在 32?34?,以直肠温度代表全身深部体温,术后置于 5?房间。脑缺血 6h、24h、48h和 72h取材观察。各组每一时间点各随机选取大鼠 4只分别用于脑组织含水量、AQP4表达、BBB通透性的观察。1.3?脑组织含水量(采用干湿重法)?各组在相应时相点处死动物,取梗死侧大脑半球(包括缺血及非缺血脑组织)称湿重,然后放入 100?烤箱中烤干至恒重再称干重(两次干重之差?0.2mg),以公式:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重?100%计算含水量。1.4?血脑屏障功能测定:甲酰胺荧光法 7?各相应时间点处死动物前 2h自股静脉注入 1%伊文思蓝(Even blue,EB,Sigma公司生产)生理盐水(2m l/kg),断头取脑,按 3m l/100mg脑组织加入甲酰胺溶液(甲酰胺:Sigma公司生产),60?水浴抽提24h,RF?540荧光光度计在发射光 620 nm,激发光683 nm 测定光度值,倍比稀释法作出 EB标准曲线,得到脑组织 EB含量,以 EB含量代表 BBB通透性的变化。1.5?原位杂交?各组动物模型在相应时间点依次经心脏灌注 DEPC 处理的 0.9%生理盐水和4%多聚甲醛,断头取出脑组织浸泡于相同的固定液中后固定 24h,然后 DEPC处理的蔗糖中脱水,待组织沉底后,置恒温冰冻切片机中切片,标本粘贴于经APES处理过的载玻片上,片厚 15?m。5?端地高辛标记的 AQP4 cRNA探针(上海生工公司设计合成,序列为 5,?GACTCCTGTTGTCCTCCACCTCCATG?TAGCTCCCTTTTTGTT?3,)。敏感性加强型原位杂交检测试剂盒?(碱性磷酸酶,武汉博士德公司产品)。按照试剂说明书进行实验操作。镜下观察,每张切片选择 5个不同视野采用 CM?2000B生物医学图像分析系统进行定量分析,结果以细胞平均光密度值表示。1.6?统计分析?实验中所得数据用 SPSS13.0进行分析,用?s表示,进行单因素方差分析,组间数据比较采用 t检验,P 0.05 为差异有显著性。2?结?果2.1?脑组织含水量?假手术组大鼠脑组织含水量没有变化。脑缺血大鼠脑组织含水量比假手术组明显增加,且随缺血时间延长脑组织含水量亦增加,在缺血 48 72h脑组织含水量达高峰。亚低温组脑组织含水量随缺血时间延长也增加,但相同时间点与常温组相比含水量下降,而且差异有统计学意义(见表 1)。2.2?血脑屏障通透性的改变?假手术组大鼠脑组织 EB含量为零。脑缺血后常温组和亚低温组大鼠缺血侧脑组织中 EB含量随缺血时间延长逐渐升高,在缺血 48 72h缺血侧脑组织中 EB含量最高。相同时间点亚低温组缺血侧脑组织中 EB含量比常温组明显减少,差异有统计学意义(见表 2)。2.3?AQP4基因表达?AQP4在海马、视上核、下丘脑、脉络丛等部位的星形胶质细胞上呈阳性表达,表现为胞膜染色较深,胞浆淡染,胞核不着色,细胞轮廓清楚,大小不一。随缺血时间的延长,AQP4表达上调明显,缺血后 48 72h表达上调最显著。亚低温组与常温组相比,相同时间点各部位 AQP4表达均下调(见表 3、图 1、图 2)。?430?JApoplexy and NervousD iseases,M ay 2011,Vol 28,No.5AOP4表达(?视上核、?视束)(100?)图 1?原位杂交:常温组 48h视上核 AQP4AOP4表达(?视上核、?视束)(100?)图 2?原位杂交:亚低温组 48h视上核 AQP4表 1?不同时段两组缺血侧脑组织含水量(%,?s)组别6h24h48h72h假手术组常温组亚低温组76.57?0.8979.23?0.54?77.53?0.70?77.34?0.2282.25?0.39?79.18?0.98?78.13?0.3185.36?0.75?80.92?0.43?76.85?0.2584.95?0.56?80.58?0.14?注:?:常温组、亚低温组与假手术组对比 P 0.05;?常温组与亚低温组对比 P 0.05表 2?两组缺血侧脑组织 EB含量(?s,?g/g湿脑组织)组别6h24h48h72h假手术组常温组亚低温组08.36?0.647.78?0.32?09.25?1.058.69?0.58?012.04?0.5811.26?0.45?011.32?1.0310.76?1.27?注:亚低温组与常温组对比 P 0.05表 3?各组 AQP4基因表达图像分析结果(平均光密度?s)组别6h24h48h72h假手术组常温组亚低温组0.13?0.0150.19?0.024?0.18?0.062?0.13?0.0290.25?0.051?0.21?0.018?0.14?0.0070.28?0.013?0.24?0.025?0.13?0.0340.30?0.031?0.25?0.017?注:常温组与假手术组对比?P 0.05,亚低温组与假手术组对比?P 0.05,亚低温组与常温组对比?P 0.05?3?讨?论脑水肿是急性脑血管病最常见的病理变化和并发症之一,它可以引起颅内高压,加重病情,甚至形成脑疝导致病人死亡。目前已发现的 AQP 家族成员中,AQP4在脑组织中分布最为广泛,它主要分布在中枢神经系统的星形胶质细胞膜以及与脑脊液密切接触的界面上。提示 AQP4参与脑组织内水分子转运和平衡调节,可能与脑水肿发生、发展密切相关 8。我们的前期实验发现在缺血再灌注后 6h脑组织含水量比正常脑组织增加,且随缺血再灌注时间延长脑组织含水量亦增加,在 48 72h脑组织含水量达高峰。脑缺血再灌注后 AQP4表达上调,在 48 72h表达最显著。随缺血再灌注时间延长,脑组织?431?中风与神经疾病杂志?2011年 5月?第 28卷?第 5期水肿程度加重,AQP4的表达逐渐增强 9。AQP4在涉及调节水、钠摄入的神经结构中,如下丘脑前核、杏仁核及海马的锥体细胞层等部位也呈阳性表达 10。实验中我们观察到 AQP4在视上核、海马表达强烈,其表达也随缺血时间延长呈上调趋势,在 48 72h表达上调最明显,在 48 72h脑组织含水量也达高峰。我们的实验结果进一步证实AQP4与脑缺血性脑水肿的形成有关。与近年来国内外的动物实验及临床观察的研究结果一致 11 14。亚低温组与正常体温组的实验结果比较,相同时间点亚低温组脑组织含水量比正常体温组减少,AQP4表达下调,缺血 48 72h差异最明显且具有统计学意义。伊文思蓝(EB)是经典的 BBB通透性示踪剂,它与血清蛋白结合形成伊文思蓝白蛋白,该大分子复合物不能透过完整的 BBB。当 BBB受损通透性增加时,EB随血管内的蛋白成分进入组织间隙,其渗出量与 BBB破坏程度呈正相关。用荧光比色法测定脑组织中的 EB 含量,则可精确计算蛋白的渗出量,从而推测 BBB的损害程度,作为判断 BBB改变的一种定量指标 7。脑缺血后缺血侧脑组织中 EB含量随缺血时间延长逐渐升高,说明缺血区 BBB结构受损,通透性增加,脑水肿加重。亚低温组缺血侧脑组织中 EB含量、脑组织含水量比正常体温组减低,说明亚低温组 BBB通透性、脑组织含水量减轻。证实 BBB结构破坏、通透性增加与缺血后脑水肿的形成相关。实验中观察到脑缺血后 BBB通透性增加、脑水肿加重、AQP4表达上调,提示缺血后 AQP4 表达上调可能与 BBB通透性增加相关。这与文献 15报道的结果一致。星形胶质细胞足突是 BBB的重要组成部分,AQP4在星形胶质细胞足突呈极性分布 1,与 BBB结构及功能关系密切。脑缺血后 BBB结构破坏,通透性增加,加重脑水肿;BBB结构破坏激活了星形胶质细胞终足上的 AQP4,使 AQP4表达增加,进一步加重脑水肿。总之,随脑缺血时间的延长,AQP4表达上调BBB通透性增加、脑水肿程度加重。亚低温状态下,AQP4表达下调、BBB通透性降低、脑水肿程度减轻。根据实验结果我们认为,AQP4表达上调与 BBB通透性增加相关。亚低温可以减轻缺血性脑水肿的可能机制之一是通过下调 AQP4表达、降低 BBB通透性增加来实现的。亚低温对缺血脑组织具有保护作用,应具有良好的临床效果,是值得推广的有效治疗方法。参考文献 1 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