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综述：综述：Treg Treg 细胞治疗自身免疫性疾病新策略细胞治疗自身免疫性疾病新策略 调节 T 细胞（Treg 细胞），是一类调控机体免疫功能的细胞群，能维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。这类细胞以表达 Foxp3、CD25、CD4 为细胞表型特征。在过去 20 年内，研究已经证实了 Treg 细胞在感染、肿瘤、器官移植、同种异体胎儿免疫相关疾病方面具有抑制各种途径的病理生理免疫应答的作用。最近一篇由法国学者 Miyara 等撰写的关于 Treg 细胞治疗自身免疫性疾病的综述发表在 Nature Reviews Rheumatology 上，这篇文章详细论述了 Treg 细胞在以 RA、SLE 为代表的自身免疫性疾病方面可能的治疗策略。综述要点 1.Treg 细胞通过抑制效应 T 细胞的活化增殖达到机体的免疫耐受和预防自身免疫性疾病的作用；2.组成性表达和诱导性表达 Foxp3 分别是天然型 Treg 细胞(nTreg 细胞)和诱导型 Treg 细胞(iTreg 细胞)的分子标志；3.人类 Foxp3+CD4+Treg 细胞的功能是多样化的，并不是所有的这类细胞均能发挥免疫抑制作用；4.小鼠会因为 Treg 细胞功能缺陷而引发自身免疫性疾病；5.风湿病患者(如 SLE、RA)体内的 Treg 细胞在功能和数量上处于正常水平；6 根据目前对 Treg 细胞的生物学治疗学等方面的认识，Treg 细胞可以通过体内外扩增和体外诱导的方法用于治疗风湿病。小鼠体内缺乏 CD4+CD25+T 细胞或者 Foxp3+T 细胞会导致很多疾病，如胃炎、关节炎、唾液腺炎、卵巢炎、糖尿病等；而小鼠的 Foxp3 基因突变则导致严重的系统性自身免疫性炎症性疾病(称作 Scurfy 病)，相应的人类 Foxp3 基因突变则引起 X 染色体连锁的先天性免疫缺陷综合征(简称 IPEX)。这些证据无不提示我们，Treg 细胞的功能缺失在自身免疫性疾病发病过程中占重要地位。1 Treg 细胞概述 众所周知，Treg 细胞是机体调控不适当或者过强免疫应答的关键机制之一，它们可以主动抑制普通 T 细胞的功能，维持机体的免疫稳态。1.1 人和小鼠的 Treg 细胞异同点 相同点 均表达细胞表面分子 CD25 和 CTLA-4 均能对效应 T 细胞的活化增殖产生抑制作用 是机体产生免疫耐受和维持免疫自稳不可或缺的细胞 Foxp3 基因突变会导致人类的 IPXE 和小鼠的 Scurfy 病 不同点 人类的效应 T 细胞可以在抗原刺激的条件下表达 Foxp3 基因 人类 Foxp3+T 细胞较小鼠 Foxp3+T 细胞表现出更加多样化的功能 1.2 Treg 细胞的免疫抑制功能 目前研究发现了 Treg 细胞发挥免疫抑制功能的多种可能机制：1.Foxp3+Treg 细胞通过产生免疫抑制因子如 IL-10、IL-35、TGF-等抑制普通 T 细胞，并通过颗粒酶 B 和穿孔素-1 杀伤靶细胞 2.Treg 细胞也能通过上调 IL-2 受体的表达，达到抑制其他 T 细胞与 IL-2 结合，从而影响其活化增殖 3.Treg 细胞表达共抑制分子 CTLA-4 与抗原提呈细胞(简称 APCs)表面分子 CD80和 CD86 高亲和力结合而启动抑制信号 4.CTLA-4 还能诱导树突状细胞产生吲哚胺 2,3-双加氧酶，催化色氨酸分解为犬尿素导致周围细胞死亡 5.小鼠 Treg 细胞还能诱导树突状细胞分泌其他氨基酸相关酶，从而抑制效应 T细胞的增殖 总之，Treg 细胞发挥免疫抑制作用在机体免疫调控方面起着十分重要的作用，而这些调控机制是否存在协同作用还未得知。倘若所有与相同 APCs 接触的 T 细胞或者所有存在于同一微环境的 T 细胞均能被 Treg 细胞从不同的途径抑制，那么引起自身免疫反应的特异性效应 T 细胞也同样可以被相对应的 Treg 细胞调控而达到治疗效果。1.3、Treg 细胞的分化发育和分类 Treg 细胞来源可分为三个途径：产生于胸腺的胸腺源性 Treg 细胞(tTreg 细胞)，由普通 T 细胞在体外诱导分化的体外诱导 Treg 细胞(iTreg 细胞)和外周组织中由抗原刺激 T 细胞分化出来的内源性诱导 Treg 细胞(pTreg 细胞)。在人外周血中，按细胞表面分子可以分为 3 个不同的功能亚细胞群体(图 1)。图 1：静息状态的 FOXP3-T 细胞通过 TCR 活化，并可在 IL-2 和 TGF-作用下低表达 FOXP3；重叠的两个细胞表示目前尚无法通过细胞表面标志区分它们；标记问号的地方表示是否能使不表达或低表达的 T 细胞高表达 FOXP3，从而转化为 Treg 细胞 众所周知，T 细胞和 Treg 细胞均需在胸腺内通过阳性选择和阴性选择才能发育成熟，被释放到外周，胸腺的阴性选择是为了清除自身反应性 T 细胞。研究发现，Treg 细胞的抗原受体(TCR)与胸腺上皮细胞的 MHC 亲和度较普通 T 细胞的高，即 Treg 细胞的 TCR 专属性更强，提示 tTreg 细胞能够与那些逃过了阴性选择的 T 细胞高亲和力结合而发挥免疫抑制作用。小鼠的 pTreg 细胞产生以小肠粘膜，可能跟以下 2 方面有关：(1)树突状细胞产生维甲酸(retinoic acid)，和 TGF-一起刺激 T 细胞表达 Toxp3;(2)肠道菌群，特别是梭状芽孢杆菌(anaerobic Clostridium bacilli)和肠道益生菌，对 pTreg 细胞生成有一定作用。研究发现，Treg 细胞的生长发育依赖细胞因子，特别是 IL-2，而人类 Treg 细胞不能自己合成 IL-2，必须靠旁分泌获得。Toxp3+T 细胞高表达 IL-2 受体由 CD25、CD122 和 CD132 组成)，所以 CD25、CD122、IL-2 缺乏的小鼠患 scurfy 病，CD25 家族缺乏与 IPXE 有关，用单克隆抗体中和 IL-2 可引发自身免疫病相似的疾病（包括胃炎、甲状腺炎、唾液腺炎和神经炎）；相反，包含 IL-2 的免疫复合物能加强 Treg 细胞的增殖，外源性 IL-2 能维持外周 Treg 细胞的数量。2 Treg 细胞与风湿病 2.1 RA 曾经我们认为，RA 患者外周血中的 CD4+CD25highT 细胞仅能抑制效应 T 细胞的增殖，并不能抑制其分泌细胞因子。如今研究发现 RA 患者循环血中的 Treg 细胞数量和功能和健康人群一样，只是 RA 患者关节炎局部浸润的 Treg 细胞较丰富。那 Treg 细胞为什么没有起到必要的免疫抑制作用呢？有些研究认为是关节腔内炎症因子过多，掩盖了 Treg 细胞的抑制作用；另一些研究认为是炎症因子具有抑制 Treg 细胞发挥功能的作用。型糖尿病小鼠的研究却得出 TNF 能增强 Treg 细胞功能，抗 TNF 治疗导致狼疮样自身免疫病的结论。可以肯定的是，机体免疫稳态是通过免疫活化和免疫抑制达到平衡的。我们需要进一步评价炎症因子对 Treg 细胞功能的影响程度，探索经治疗病情缓解后，Treg 细胞能否或如何维持长期缓解状态。2.2 SLE SLE 患者的循环血中 Treg 细胞的情况与 RA 患者相似，但也有数量或功能低下的情况，然而从患者体内分离出的 Treg 细胞能正常发挥免疫抑制功能。研究发现 SLE 患者体内 IL-2 表达水平低下，结合 IL-2 是 Treg 细胞生长发育必要因子和狼疮急性期促炎因子丰富等，就可以解释 SLE 上述现象了。3 Treg 细胞与动物模型 3.1 自身免疫病小鼠 自身免疫病小鼠，特别是由 nTreg 细胞缺乏所致的器官特异性免疫病，可以通过重构的 Foxp3+nTreg 细胞预防发病，但接种相似的 Treg 细胞并不能完全阻断自身免疫病活动进展。NOD 小鼠和 EXE 动物模型中，具有特异性 TCR 的 nTreg 细胞能有效的抑制疾病进展，而另一项研究通过 MBP 诱导的 EXE 鼠被特异性 TCR 的 nTreg 细胞治疗恢复后，还能对相同抗原的二次免疫保持耐受。采用多克隆 iTreg 细胞治疗，能减缓型糖尿病的进展，延长 NOD 小鼠寿命 1 年以上。仍需进一步通过这些动物模型明确 Treg 细胞能否预防和阻断系统性自身免疫病。3.2 胶原诱导性关节炎(CIA)该模型主要用牛型胶原蛋白诱导出小鼠关节炎。实验通过注射体外扩增的多克隆 nTreg 细胞到达关节炎缓解和阻断病程的效果；另有研究先对 nTreg 细胞用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid)预处理，可使治疗效果更加明显；也有实验证明，在一定程度上使用 iTreg 细胞比 nTreg 细胞的疗效更佳。3.3 蛋白多糖诱导关节炎 用人类关节蛋白多糖作用于 BALB/c 小鼠诱导出的关节炎，可通过移植蛋白多糖特异性 CD4+T 细胞获益，因为 CD4+Treg 细胞能识别热休克蛋白(HSP70)并表达淋巴细胞活化基因 3(LAG3)。这也提示自身抗原特异性 Treg 细胞在治疗自身免疫病方面的潜能。3.4 SKG 小鼠 该模型是 TCR 信号分子酪氨酸蛋白激酶 ZAP-70 基因突变的小鼠，会自发 T 细胞介导的自身免疫性关节炎并伴随间质性肺炎等关节外表现。通过移植野生鼠的 Roxp3+nTreg 细胞可以阻断 SKG 小鼠的疾病进展，所以 nTreg 细胞的主动移植对人工关节炎模型有治疗效果。3.5 SLE 模型(NZBNZW)F1 小鼠，先天患有狼疮肾炎和 SLE 相似的免疫病。把 610 周 T1 小鼠的 nTreg 细胞移植给 6.57.5 个月的 F1 小鼠，可以达到阻断肾炎进展和延长生存期的效果，因为年轻 F1 鼠 Treg 细胞表达 CD25 分子的水平较年长鼠高，故 IL-2 低表达可能引起 SLE 患者 Treg 细胞 CD25 表达下调。MRL-Faslpr 小鼠可通过移植表达有趋化因子受体 Ccr2 的 nTreg 细胞得到治疗，可能是因为 Cc2 影响了 T 细胞的趋化作用。3.6 动物模型给出的经验 Treg 细胞移植治疗风湿病的疗效取决于 Treg 细胞数量和移植时机：最好在疾病表现症状之前给以多克隆 nTreg 细胞治疗。若已经表现出症状，则需大剂量的抗原特异性 nTreg 细胞才有望显效。当然，对 Treg 细胞的预处理和选择方面也很重要。(1)细胞移植前，应该清除引发自身反应的效应 T 细胞和记忆 T 细胞；(2)使用雷帕霉素或维甲酸处理 Treg 细胞可以增强疗效；(3)细胞因子，特别是 IL-2 能够加强 Treg 细胞的增殖和免疫抑制活性；(4)利用靶抗原处理 Treg 细胞，使 TCR 获得特异性或表达趋化因子受体，从而加强疗效；(5)根据 Treg 细胞能维持免疫系统对二次免疫无应答的特点，在缓解期予以外源性特异性 Treg 细胞强化或增加内源性 nTreg 细胞有望预防复发。4 Treg 细胞疗法 在 Treg 细胞治疗前，应利用全身放疗、免疫抑制剂和生物制剂等预处理。根据 Treg 细胞的扩增来源可分为三条途径(图 2)。图 2：在抑制效应 T 细胞增殖的同时用抗原刺激得到大量克隆的抗原特异性 Treg 细胞；通过自身免疫抗原和 IL-2 在体外诱导 Treg 细胞增殖，然后回输；在体内或体外具有 IL-2 和 TGF-的条件下，使抗原活化后的效应 T 细胞转化为 iTreg 细胞 4.1 nTreg 细胞体内扩增 临床上使用小剂量 IL-2 治疗移植抗宿主病(GVHD)和 HCV 相关的血管炎是有效的，也有联合雷帕霉素治疗型糖尿病同样有效。临床实验证明小剂量 IL-2 的输注可使 Treg 细胞增殖而不引起效应 T 细胞扩增，但 IL-2 的输注能否预防复发尚不清楚，而且除了 IL-2，其他细胞因子、激动剂、阻断剂等能否有效的使特异性 Treg 细胞增殖需要进一步研究。4.2 nTreg 细胞或 iTreg 细胞的体外扩增 临床上为了预防 GVHD，通常通过体外扩增被供体者外周血单核细胞刺激过得 Treg 细胞，然后把这些 Treg 细胞和造血干细胞一同输入患者体内。自身免疫病患者的 Treg 细胞扩增发生在炎症部位或局部淋巴结，而小鼠则在脾脏里扩增。适合用于治疗的 Treg 细胞应该是处于初始状态或静息状态的 FOXP3+Treg 细胞，可是这类细胞在体内并不增殖，但可在高浓度 IL-2 和抗原刺激条件下扩增并表达 FOXP3，同时该条件下的效应 T 细胞会发生凋亡。而且细胞培养过程加入雷帕霉素、维甲酸可使 Treg 细胞更稳定的表达 FOXP3 等相关蛋白分子。4.3 普通 T 细胞转化为 Treg 细胞 这种方法尚不成熟，但我们在知道自身免疫病相关抗原的情况下可以通过体外诱导或体内转化的方式得到自身免疫性抗原特异性的 Treg 细胞用于治疗。5 结论和展望 FOXP3+Treg 细胞在预防自身免疫性疾病方面是必不可少的，动物实验也把它用于类风湿样和狼疮样自身免疫病的治疗。目前对风湿病的治疗主要依靠传统免疫抑制剂和生物制剂，通过 Treg 细胞的治疗，可能较前两种方式显示出独特的优越性。但目前仍需要明确一些问题：(1)小剂量 IL-2 促使体内 nTreg 细胞增殖用于治疗 RA 和 SLE 已被临床试验证实是安全可靠的；(2)希望开发一种促使 nTreg 细胞体内扩增的生物制剂，将有益于免疫病的预防；(3)由于 nTreg 细胞体内扩增可能不能充分的控制自身免疫性炎症，所以如何诱导表达自身免疫病特异性抗原相对应的 TCR 的 Treg 细胞才是关键；(4)如何使 Treg 细胞的表观遗传学特征得到稳定的传代，是保证 pTreg 细胞和 iTreg 细胞用于治疗的基础之一；(5)如何准确找到自身免疫病相关抗原，是实现 iTreg 细胞体外诱导的必备条件；(6)对 Treg 细胞免疫学特性的深层次研究将有助于更好的治疗风湿病。