微生物菌种的筛选与保藏.pdf

微生物学微生物学 College of Marine Life Sciences,Ocean University of China 刘光磊 第六章 微生物菌种的筛选与保藏 本章要点 如何按目的要求筛选菌株 微生物菌种保藏方法 了解国内外各大菌种保藏机构 种（species）菌株（strain）第一节 从自然界中分离筛选菌种 生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育(1)用原有菌株进行遗传改造进行育种 诱变育种 基因重组育种(2)向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育(3)从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。从自然界中分离筛选菌种的一般步骤 筛选目标设计方案 采样采样 增殖培养增殖培养 平板分离平板分离 单单株纯种分株纯种分离离 筛选筛选(初筛、初筛、复筛复筛)性能考察性能考察(生生产性能试验、产性能试验、菌种鉴定）菌种鉴定）一、采样 从自然界种采集含目的菌的样品 1.环境条件对土样本中微生物分布的影响（1）营养环境 高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌；富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；油田土：石油分解菌；（2）水分 离地表5-15cm土样 含水过多、过少都不理想（3）温度：采样以秋季为好（4）通风（5）酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸 2.采样方法（1）去除表层土（2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中（3）植物根、茎、叶、花、果实。3 注意 记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离 红树林 二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制 4.方法（1）控制营养成分 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 酒精废水，可以增殖废水利用菌 *多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素 （2）控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制 （3）控制培养温度 30左右培养，可培殖嗜温微生物 5060培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株 （4）热处理增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌 （5）添加抑制剂 10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌 抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制毒菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌 三.纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养 1、纯种分离的一般方法（1）稀释平板法 倾注平板或涂布平板（2）划线法 稀释分离涂布平板 划线分离（3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇切1小块菌盖10%漂白粉消毒处理无菌水冲洗臵琼脂平板上培养长出菌丝体 或：悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内培养长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌：加1%去氧胆酸钠 察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖 2、平皿反应快速检出法定性或半定量（1）纸片培养显色法 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶（3）变色圈法 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶（4）生长圈法 工具菌：营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育 （5）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低 刚果红与纤维素等多糖物质形成红色复合物 淀粉遇碘变蓝 抑菌圈 3、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh 煮沸法：将培养基臵沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh 刃天青 偶氮间苯四酚 resazurin 氧化还原指示剂，在缺氧环境下由粉红变为无色。（2）创造无氧环境 物理除氧 空气臵换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg充入N2（反复3次）充入CO2 10%+H2 10%+N2 80%化学除氧 H2+O2 H2O (钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧指示剂 （3）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术 厌氧培养箱 四、筛选 1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶 目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法 2、复筛：每株35瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，35%接种量，培养条件可同初筛 分析测定：定量，注意副产物 复筛可进行多次，逐步淘汰，留下35株甚至最好的1株 好氧培养 五、培养工艺条件试验与生产试验 1、摇瓶发酵条件 培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接种量，培养温度 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂 第二节 菌种退化、复壮与保藏 在生物进化中：遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的；在变异中：退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。一.菌种的退化 1、菌种退化degeneration的表现 生产性状的劣化,遗传标记的丢失,原有的典型性状的不典型等 菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降，即负突变 致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱 2.菌种退化的原因：基因自发突变 退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。自发突变率10-810-9 加速退化的因素:传代次数过多;不适宜的培养条件。3.防止退化的措施（1）控制传代次数（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等 保藏培养基：细 菌：营养琼脂 放线菌：高氏一号 霉 菌：察氏培养基 酵母菌：YPD（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子（4）采用有效的菌种保藏方法 二.菌种的复壮 rejuvenation 狭义复壮 在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义复壮 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种。复壮方法 1、纯种分离法 平板表面涂布法平板表面涂布法 平板划线分离法平板划线分离法 琼脂培养基浇注法琼脂培养基浇注法 用用“分离小室分离小室”进行单细胞分离进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分用菌丝尖端切割法进行单细胞分离离 菌落纯菌落纯（菌种纯菌种纯）细胞纯细胞纯（菌株纯）（菌株纯）纯种分离法纯种分离法 2、通过宿主体复壮：病原菌 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。3、淘汰已衰退的个体 对S.microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢子采用-10-30的低温处理57天，使其死亡率达到80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到复壮的效果。三.菌种的保藏（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。（二）原理 挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。措施 低温：生长温度低限约为-30，水溶液中酶促反应温度低限-140 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白、海藻糖。添加酸度中和剂 （三）菌种保藏方法 1、斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 培养 4保藏 措施：低温：4 适用：各大类 保藏期：16个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养 基1cm415保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：12年 优点：简便 3、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：110年 4、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg）真空封口 检查真空度 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：515年或更长 5、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮 加入保藏管中 臵-70冰箱保藏 措施：低温（-70）、保护剂（1550%甘油）适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6、液氮保藏法 方法：菌种培养 保护剂悬浮 加入保藏管中 臵液氮瓶中 措施：超低温（-196）、保护剂 适用：各大类 保藏期：15年 （四）菌种保藏机构 1、中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM 中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院)中国科学院微生物研究所(AS)中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV)中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院)中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF)中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会)中国食品发酵工业研究所(IFFI)中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP)中国预防医学科学院病毒研究所 中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP),石家庄 中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部)农业部兽药监察研究所(NCIVBP)中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院)中国林业科学院林业研究所(RIF)2、美国典型培养物收藏中心 ATCC American Type Culture Collection 3、美国北部开发利用研究部 NRRL Agricultural Research Service(ARS)4、英国国家典型菌种保藏所（NCTC）National Collection of Type Cultures 4、荷兰霉菌中心保藏所 CBS 6、日本大阪发酵研究所 IFO