Toll样受体mRNA在慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞中的表达.pdf

作者单位:130031长春,吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉2头颈外科通信作者:董震(Email:dongzhen2000 hotmail1com)呼吸道炎症和免疫Toll样受体mRNA在慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞中的表达王成硕 董震【摘要】目的 探讨Toll样受体22(Toll2like receptor22,TLR22)及其Toll样受体24(Toll2likereceptor24,TLR24)mRNA在慢性鼻窦炎患者和健康成人鼻黏膜上皮细胞中的表达,分析TLR22和TLR24在鼻黏膜天然免疫中的作用。方法 应用核酸分子原位杂交技术检测30例慢性鼻窦炎患者和21例健康成人鼻黏膜上皮细胞中TLR22和TLR24mRNA的表达。结果 TLR22和TLR24 mRNA在30例慢性鼻窦炎上皮细胞中均有表达,且分别与对照组间差异有显著性意义(t=81605,P01000 5,t=91050,P 01000 5)。结论 鼻黏膜上皮细胞中可以产生TLR22和TLR24,表明鼻黏膜上皮不仅是单纯的物理屏障,更可以通过Toll样受体对病原微生物进行识别,以直接启动有效的抗感染机制。【关键词】鼻黏膜;上皮细胞;原位杂交Expression of Toll2like receptor mRNA in epithelial cell of nasal mucosaWANG Cheng2shuo,DONGZhen1Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,China2Japan Union Hospital of JilinUniversity,Changchun 130031,ChinaCorresponding author:DONG Zhen(Email:dongzhen2000 hotmail1com)【Abstract】ObjectiveTo understand the expression of Toll2like receptor22(TLR22)and Toll2likereceptor24(TLR24)in epithelial cell of nasal mucosa,and to investigate the role of Toll2like receptors in theinnate immunity of nasal mucosa1MethodsSpecimens from 30 patients with chronic sinusitis and 21healthy adults were examined by in situ hybridization for TLR22 and TLR24 mRNA1ResultsAll 30samples of chronic sinusitis showed a stranger expression of TLR22 and TLR24 than in controls(t=81605,P 01000 5,t=91050,P 01000 5)1ConclusionIt is suggested that epithelia in nasal mucosa were notjust a physical barrier,which could represent a novel defense mechanism of the host during bacterialinfections through Toll2like receptors1【Key words】Nasal mucosa;Epithelial cells;In situ hybridization 鼻黏膜上皮细胞在呼吸道黏膜免疫中的作用近年来越来越受到重视。人们已经认识到呼吸道上皮不再是一个单纯的物理屏障,而是一个多重身份的宿主防御的参与者。它可以同时作为感受器(sensors)、信号回路(signaling circuits)和效应分子(effectors molecules)调整和执行对微生物的炎症反应1。作为呼吸道天然免疫的第一道防线。它自身可以分泌多种细胞因子和杀菌物质来参与炎症反应和宿主防御。我们以往的研究已经证明鼻黏膜上皮细胞可分泌调节激活,正常T细胞表达和分泌(regulated upon activation,normal T cell expressedand secreted,RANTES)、血 管 内 皮 生 长 因 子(vascular endothelium growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子2(tumor necrosis factor2,TNF)等细胞因子224。那么鼻黏膜上皮是如何感受到微生物的侵袭,并通过怎样的机制识别病原微生物、偶联信号传导途径,以表达、产生细胞因子的呢?其机理目前仍不十分清楚。而Toll样受体(Toll2like receptors,TLRs)的发现给这一问题的解决带来一线曙光。Toll样受体是近年来新发现的一个介导天然免疫的古老家族。该受体的发现最早缘于对果蝇Toll(dToll)蛋白的研究5。该蛋白是果蝇细胞负责信号传递的一类跨膜受体。人们首先发现若人为敲除编码Toll蛋白的基因将导致果蝇胚胎的死亡。随342中华耳鼻咽喉科杂志2003年8月第38卷第4期 Chin J Otorhinolaryngol,August 2003,Vol 38,No.4即又发现在成体果蝇,Toll与配体结合能激活胞浆内的转录因子,诱导针对微生物病原体的宿主防御反应。近年来,又在植物、无脊椎动物及脊椎动物中发现了一系列具有与Toll蛋白结构高度保守的蛋白质,且其信号激活途径也极为相似。例如:182wheeler6、Toll样受体等。这些蛋白历经数亿年演化而仍然保存下来并在先天宿主防御中发挥重要作用。因而成为近年来天然免疫研究中的热点。目前人类Toll样受体家族已确认的成员有10个(TLR1TLR10)。它们的配体大多为病原微生物细胞壁成分(如脂多糖、磷壁酸等)。与T、B细胞抗原受体对表位高度特异的“个性化”识别相反,人及哺乳动物Toll系统识别的是病原微生物的“共性”。如革兰阴性菌(G-)中共有的菌壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),革兰阳性菌(G+)中共有的肽聚糖、磷壁酸等。这一类物质,即存在于细胞壁,为多种微生物所共有的一类分子结构称之为病原相 关 分 子 模 式(pathogen associated molecularpatterns,PAMPs)。其化学性质多属糖脂化合物,一般不为多细胞生物所有。迄今发现的Toll样受体的配体都属PAMPs。其中TLR2识别的配体范围较广,包括:G+菌及其胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸,分支菌属的阿拉伯甘露糖脂(lipoarabinomannan,LAM),螺旋体,支原体等。TLR4的配体则主要为G-菌的LPS7,8。由此可见,TLR2和TLR4的配体已经涵盖了自然界绝大多数对人体致病的微生物类别。因此,二者在人类Toll样受体家族中最为重要。TLR主要分布于淋巴组织、白细胞、单核吞噬细胞和树突状细胞。此外,不同的TLR在非淋巴组织也有不同程度的表达。Wolfs等9就曾发现TLR2、TLR4在肾小管上皮细胞中表达,且在炎症状态下表达增强。这表明非免疫细胞也能表达Toll样受体。有鉴于此,我们推测Toll样受体在鼻黏膜上皮细胞中亦有表达。因此,我们应用核酸原位杂交技术检测了TLR2、TLR4在慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞中的mRNA表达情况。以期探讨Toll样受体在慢性鼻窦炎鼻黏膜上皮中的表达情况及其可能在鼻黏膜天然免疫中发挥的作用。资料与方法 一、研究对象本实验采用的上皮细胞来自2002年68月间本院门诊慢性鼻窦炎患者的中鼻道黏膜刮取物30例。其中男17例,女13例年龄1657岁。诊断根据病史、内镜检查、鼻窦CT扫描。对照组为21例无鼻部疾病的健康成人志愿者中鼻道黏膜刮取物。男14例,女7例。年龄2535岁。二、鼻黏膜上皮细胞的获取嘱受检者擤净鼻腔分泌物后,用灭菌后的小刮匙在受检者鼻腔下鼻甲内上方靠近中鼻道入口处刮取少量上皮细胞。立即投入2%半胱氨酸生理盐水中60 min以消化黏蛋白。3 000 r/min离心10 min后弃上清。将沉淀细胞涂于事先涂有多聚赖氨酸的载玻片上。置于室温中干燥1520 min,使其牢固地黏附于玻片上。随即置于4%多聚甲醛中固定20min。012 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebuffered salinePBS)液终止固定。011 mol/L PBS液过洗两次,梯度酒精脱水后室温完全干燥。置于-70 冰箱中备用。三、TLR2和TLR4 mRNA的检测1.原位杂交有关试剂:TLR2和TLR4寡聚核苷酸探针和原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。TLR2探针序列为:5GCTATGATGC ATTTG TTTCT TACAG TGAGC3;5TGGAT CATTG ACAAT ATCAT TGACT CCATT3;5CCCAG CGCTT CTGCA AGCTG CGGAAGATAA 3;TLR4探针序列为:5AGGAC TGGGTAAGGA ATGAG CGAGT AAAGA 3;5CTGGTGTATC TTTGA ATATG AGATT GCTCA 3;5GCAGGAACAC TTACC TGGAG TGGGA GGACA3。2.TLR2和TLR4 mRNA的检测步骤:所有器皿、玻片、缓冲液、双蒸水均予灭活RNA酶处理。上皮细胞涂片梯度酒精水化,新鲜配制015%H2O2/甲醇室温处理30 min以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤3次;涂片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37 消化15 min以暴露mRNA核酸片段,015 mol/L PBS洗5 min3次,蒸馏水洗1次;预杂交:按每张切片20L加预杂交液,恒温箱372 h;杂交:临用前按每张切片2L杂交探针稳定液和18L寡聚核苷酸探针杂交液混匀,加在载玻片上。将硅化盖玻片盖在载玻片上,37 杂交过夜。杂交后洗涤。揭掉盖玻片,372SSC洗涤15 min1次,012SSC洗涤15 min2次;滴加封闭液3730 min,甩去多余液体,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛3760 min,015 mol/L PBS洗442中华耳鼻咽喉科杂志2003年8月第38卷第4期 Chin J Otorhinolaryngol,August 2003,Vol 38,No.45 min4次;滴加SABC 3720 min,015 mol/LPBS洗5 min4次;DAB显色15 min,充分水洗;苏木素复染,充分水洗;酒精脱水二甲苯透明,封片。不加探针为空白对照,以排除非特异染色。31 结果判断:以胞浆出现定位清晰的颗粒状棕黄色物质为阳性。资料分析处理:在40倍镜下任意选取20个上皮细胞,TJ TY2300型全自动图像分析仪测定细胞内杂交产物的平均吸光度(A),取其均值为该标本测量结果。统计学分析:对两组数据进行成组设计t检验,P 0105认为有统计学意义。结果 慢性鼻窦炎鼻黏膜上皮细胞涂片中:HE染色显示鼻黏膜纤毛上皮细胞均匀分散,间夹杂一些炎性细胞及成纤维细胞。上皮细胞尚能保持未离体时形态(图1)。TLR2和TLR4寡聚核苷酸探针标记的慢性鼻窦炎鼻黏膜上皮细胞涂片中,除涂片周边少量细胞不着色或微弱着色外(分析可能是探针杂交液未能完全覆盖玻片之故),绝大部分细胞在胞浆中出现明显棕黄色颗粒状着色(图2)。而对照组表达非常稀少(图3)。采用计算机图像分析系统检测其平均(?xs)吸光度比较二者在慢性鼻窦炎及对照组中mRNA表达的差异。结果:TLR2 mRNA为01107 901010 13,TLR4 mRNA为01143 301018 40。且二者mRNA的表达分别明显高于对照组01080 401012 67(t=81605,P 01000 5)和01102 401011 33(t=91050,P 01000 5)。讨论 鼻黏膜直接与外界相通,对病原菌的攻击首当其冲。长期经受病原微生物攻击的鼻黏膜上皮通过自身表达TLR2和TLR4,识别病原体所携带的PAMPs并与之结合,同时激活胞内信号传导途径,产生编码多种,能扩大炎症反应,增强杀菌作用的细胞因子7,10。人的TLRs与果蝇结构类似,由胞外区,跨膜区和胞内区3部分组成,属于 型跨膜受体,其胞外段均有1731个富含亮氨酸的重复序列(leucine2rich repeats,LRRs)。胞内段则与人白细胞介素1受体(interleukin 1 receptor,IL21R)的胞质区结构相似。被称为TIR(Toll/IL21R)结构域。它是和向下游进行信号传导的核心元件。这一位点的突变或缺失将阻断信号向下游传递。TLRs精细的结构和广泛的表达是其发挥生物学作用的必要条件。目前胞内信号传导机制研究得比较清楚的是NF2 B激活途径11:TLRs在胞外区在识别PAMPs成分后,经胞内段TIR结构域与转接蛋白MyD88结合,进而将激活信号传递给胞浆中的NF2 B2I2 B复合物,促使I2 B磷酸化、泛素化、降解,NF2 B与之分离,转至细胞核内并与相应的转录单位结合,编码多种细胞因子(IL21、IL26、IL212,TNF等)、NO(杀伤微生物的有效成分)和防御素(defensins),以清除入侵的病原微生物。而TLR4缺陷的C3H/HeJ小鼠极易患G-菌败血症而死亡,是由于阻断了TLR4介导的胞内信号传导途径,无法有效激活细胞防御机制所致。众所周知,感染是鼻窦炎发病的必要条件。在我们的实验中,慢性鼻窦炎组和对照组之间TLR2、TLR4 mRNA的表达存在明显差异。这说明病原菌(或菌壁有效成分)的刺激可上调Toll样受体在鼻黏膜上皮中的表达,使之更适应感染状态,并对这种感染状态及时作出应答。正是由于鼻黏膜上皮表达的Toll样受体及其多种细胞因子对病原微生物的识别和杀灭,才使得下呼吸道及肺部得以保持相对无菌状态。因此将鼻黏膜上皮细胞称其为呼吸道先天防御机制的第一道防线。鼻黏膜上皮可以表达TLR2、TLR4的mRNA,再次印证了鼻黏膜上皮在呼吸道天然免疫中的重要地位。同时也给今后的临床工作指出了一个新的方向,即鼻外科医师在鼻腔手术中应注意尽量保留正常的鼻黏膜。此外,开发新的含微生物成分的免疫制剂,通过刺激Toll样受体在局部的高表达,以治疗呼吸道感染性疾病,亦将是一个饶有趣味的课题。(本文图13见插图421)参考文献1Ganz T.Epithelia:not just physical barriers.Proc Natl Acad SciUSA,2002,99:335723358.2姜舒,董震,朱冬冬.缺氧对鼻息肉上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,2002,37:34237.3刘天懿,张欣欣,董震.鼻息肉上皮细胞调节激活正常T细胞表达和分泌因子的测定和意义.中华耳鼻咽喉科杂志,2000,35:2572259.4王成硕,董震,杨占泉.TNF和CD68在鼻息肉中的表达及意义.耳鼻咽喉2头颈外科杂志,2001,5:1972198.5Morisato D,Anderson KV.Signaling pathways that establish thedorsal2ventral pattern of the Drosophila embryo.Annu Rev Genet,1995,29:3712399.6Williams MJ,Rodriguez A,Kimbrell DA,et al.The 182wheelermutation reveals complex antibacterial gene regulation in Drosophilahost defense.EMBO J,1997,16:612026130.542中华耳鼻咽喉科杂志2003年8月第38卷第4期 Chin J Otorhinolaryngol,August 2003,Vol 38,No.47Underhill DM,Ozinsky A,Hajjar AM,et al.The Toll2like receptor2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates betweenpathogens.Nature,1999,401:81128158Takeuchi O,Hoshino K,Kawai T,et al.Differential roles of TLR2and TLR4 inrecognition ofgram2negative and gram2positivebacterial cell wall components.Immunity,1999,11:4432451.9Wolfs TG,Buurman WA,van Schadewijk A,etal.In vivoexpression of Toll2Like receptor 2 and 4 by renal epithelial cells:IFN2gammaandTNF2alphamediatedup2regulationduringinflammation.J Immunol,2002,168:128621293.10Hirschfeld M,Kirschning CJ,Schwandner R,et al.Cutting edge:inflammatory signalingby Borreliaburgdorferilipoproteins ismediated by toll2like receptor 2.J Immunol,1999,163:238222386.11KaishoT,AkiraS.Toll2likereceptorsandtheirsignalingmechanism in innate immunity.Acta Odontol Scand,2001,59:1242130.(收稿日期:2002210209)(本文编辑:姬广茜)作者单位:515031广东省汕头市中心医院耳鼻咽喉2头颈外科(李创伟);北京协和医院耳鼻咽喉科(李五一)通信作者:李创伟(Email:stlcw 1631net)经验与教训糖尿病酮症伴发气管周围脓肿引起颈段气管广泛坏死一例李创伟 李五一患者女,39岁。3年前患糖尿病、糖尿病酮症,在当地医院治疗,无规律饮食控制和服降糖灵、消渴丸、康威胶囊,症状无好转,1998年10月后停药。1998年12月10日患感冒,未服药治疗,3 d后逐渐出现嗜睡、昏迷。在外院急查血糖:44144mmol/L,尿酮体(+),给予补液、补钾、胰岛素等治疗后,意识恢复。12月23日出现咽痛、咳嗽,低烧。12月24日收住院。入院后查血白细胞1122109/L,中性0183,诊断为 型糖尿病、酮症、肾病和肺部感染,给予补液、胰岛素和西力欣治疗。1999年1月2日出现吸气性呼吸困难,进行性加重,查血气氧分压881810712 mm Hg(1 mm Hg=01133kPa),纤维喉镜示“右声带固定,左声带稍活动,声门裂34 mm”。1月4日颈胸CT示:“颈段气管壁明显增厚,软骨环受累,管腔狭窄,右肺下叶不规则实变影”。颈部B超示:“颈段气管周围低回声区,气管受压狭窄”。多科会诊意见:颈段气管周围肿物,肿瘤不除外。1月5日呼吸困难加重,急诊手术探查。因呼吸困难只能坐位手术,缺氧后引起昏迷,血氧饱和度降至30%。紧急切开标志不清的气管,插管通气后复苏成功。探查:颈段气管被厚壁脓腔包裹,气管侧壁和前壁游离,仅膜部与食管前壁相连,气管周围间隙大量脓液,25环气管呈灰黄色,气管环软化坏死,未见气管食管瘘。切开甲状腺峡部和增厚的气管前筋膜(已成为脓腔壁),向两侧展开,缝合在切口皮下,使气管周围脓腔完全敞开,引流。细菌培养:阴沟肠杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌。术后抗炎、引流后仍持续弛张高热,引流脓多。1月12日再次手术探查:见15环气管完整离断,坏死,脱垂,下断端缩至胸廓入口,上端仅剩环状软骨,食管前残留少许气管膜部黏膜,清创后更换长气管套管。术后病理:气管大片坏死,炎性渗出物及大量真菌丝(考虑为曲霉菌)。术后经脓腔引流、二性霉素B和伊曲康唑抗真菌、可乐必妥抗炎和控制糖尿病等治疗后,感染控制,未再向下纵隔发展,体温逐渐正常,伤口基本愈合。2月12日食道造影未见气管食管瘘,纤维气管镜检查下端气管无坏死,2月16日带管出院。1999年8月再次入院拔管,行气管支撑架置入术,半年后随诊,可正常生活。讨论:该患者由于糖尿病得不到有效控制,致使气管周围炎症发展至大范围的气管周围脓肿,由于未能及时确诊,尽早行脓肿切开引流脓肿压迫颈段气管并阻断其血供,导致气管缺血、坏死,值得总结经验和教训。1月2日患者出现吸气性呼吸困难进行性加重,纤维喉镜检查提示双侧喉返神经受累,结合患者有糖尿病史,应马上行颈胸CT、磁共振及颈部B超检查,尽快行气管切开,同时探查气管食管沟情况。1月4日颈胸CT示“颈段气管壁明显增厚,软骨环受累,管腔狭窄,右肺下叶不规则实变影”,颈部B超示“颈段气管周围低回声区,气管受压狭窄”,此时应高度怀疑气管周围脓肿,马上行脓肿切开引流。本例手术清创后病理检查提示有真菌感染,加用二性霉素B和伊曲康唑抗真菌后,感染控制。因此,对于糖尿病患者,长期大量应用抗生素治疗者应警惕合并有真菌感染的可能。(收稿日期:2002212226)(本文编辑:何膺远)642中华耳鼻咽喉科杂志2003年8月第38卷第4期 Chin J Otorhinolaryngol,August 2003,Vol 38,No.4