毛细管电泳电化学发光检测及其在手性药物分离中的应用.pdf

分类号U D C：Y 15 2 4 5 0 2密级编号毛细管电泳电化学发光检测及其在手性药物分离中的应用I 二A P I L L A R YE L E C T R O P H O R E S I SW I T HE L E C T R O C H E M I L U M I N E S C E N C ED E T E C T I o NA N DI T SA P P L I c A T l 0 NI NE N A N T I O S E P A R A T I O N学位授予单位及代码：拯蚕理王盘堂(!Q 1 8 鱼学科专业名称及代码：厘且丝堂(Q 8 1 2 Q 垒2研究方向：电丝堂廛旦申请学位级别：亟指导教师：奎叁耀煎援研究生：奎霞论文起止时间：2 Q Q!：2 Q Q 窆!Q 3答辩委员会主席：王蕉至教攫摘要目前新药研究的一个发展趋势是研制和生产光学纯药物。因此，在药物研发过程中，手性药物分离和分析已成为分析化学领域研究的热点。其中，毛细管电泳(C E)技术是手性药物分离中最有效的分离手段之一。而吡啶钌电化学发光体系具有检测灵敏度高、线性范围宽等优点能够满足手性C E 高灵敏度的要求。本文将C E 与电化学发光检钡J J(E C L)相联用，旨在提高C E 在手性药物分离中的灵敏度和选择性。该论文共分为三部分。第一章详细的阐述了C E 在手性药物分离方面的进展。第二章建立了C E E C L检测方法并将其应用于二氧异丙嗪标准品(D P Z)的手性分离。在最佳条件下：1 6 5m M1 3-C D 2 5m M I r i s H 3 P 0 4 4 0m MH 3 8 0 3(p H2 5)，实现了对D P Z 的完全手性分离，还发现在电泳缓冲液中加入硼酸可以有效改善D P Z 的分离度。第三章将C E E C L 用于尿样中的D P Z 对映体的分离与检测，取得了满意的结果。关键词：电化学发光毛细管电泳手性分离盐酸二氧异丙嗪2A B S T R A C TN o w a d a y s，t h ed e v e l o p m e n ta n dp r o d u c t i o no fo p t i c a l l yp u r ed r u g si st h et r e n do fn e wd r u g sr e s e a r c h，t h e r e f o r et h es t u d yo nc h i r a ld r u g sa n a l y s i sh a sb e c o m em o r ea n dm o r ei m p o r t a n ta n di th a sb e c o m eah o tt o p i ci na n a l y t i c a ls c i e n c e C a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s(C E)i sav e r s a t i l ea n a l y t i c a lt e c h n i q u ew h i c hi ss u c c e s s f u l l yu s e df o rt h es e p a r a t i o no fc h i r a ld r u g sa n dh a sd e v e l o p e dt ob eo n eo ft h em o s tc o m m o n l ys e p a r a t i o nt e c h n i q u e s A sas e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ed e t e c t i o nm e t h o d，t r i s-(2，2 -b i p y r i d y l)-r u t h e n i u m(I I)(R u(b p y)3 口)e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n e(E C L)d e t e c t i o ni sc o u p l e dw i lC Ei no r d e rt oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yi nc h i r a lC E T h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft h r e ec h a p t e r s C h a p t e r1r e p o r t st h ea c h i e v e m e n t so fc h i r a ls e p a r a t i o nb vC Ei nd e t a i l s C h a p t e r2d e v e l o p e sas e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o db yc o u p l i n gC Ew i t he l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n ed e t e c t i o n(C E-E C L)，w h i c hi su s e df o r t h es e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fd i o x o p r o m e t h a z i n eh y d r o c h l o r i d e(D P Z)e n a n t i o m e r s T h ee n a n t i o m e r sa r ec o m p l e t e l ys e p a r a t e du n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n：16 5m MB C Di n2 5m MT r i s-H 3 P 0 4-4 0m MH 3 8 0 3b u f f e rs o l u t i o na tp H2 5 A ni m p r o v e ds e p a r a t i o no fD P Ze n a n t i o m e r sc o u l db ea c h i e v e da f t e ra d d i n gb o r a t ea c i d(H 3 8 0 3)i nb u f f e r C h a p t e r3e x a m i n e st h es e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fD P Ze n a n t i o m e r si nh u m a nu r i n eb yt h eC E-E C Lm e t h o dw i t hal i q u i d-l i q u i de x t r a c t i o np r o c e d u r e，a n ds a t i s f a c t o r yr e s u l t sa r eo b t a i n e d K e y w o r d s：E l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c eC a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sE n a n t i o s e p a r a t i o nD i o x o p r o m e t h a z i n eh y d r o c h l o r i d e3长春理工大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，毛细管电泳电化学发光检测及其在手性药物分离中的应用是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：蒸 垂缉年土月业日长春理工大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版权使用规定”，同意长春理工大学保留并向中国科学信息研究所、中国优秀博硕士学位论文全文数据库和C N K I 系列数据库及其它国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。作者签名：盔区型2 年j 月址日指导导师签名：年一月一同第一章手性药物分离与毛细管电泳介绍1 1 手性药物分离概述1 1 1 手性药物分离的历史进展手性药物对映体的分离和分析在药物研发中具有非常重要的意义，已成为分析化学领域中广泛研究的课题之一。这是因为手性药物的两个对映体一般具有不同的药理和毒理作用，往往是其中的一个异构体是药物的有效成分，而另一个则可能是低效的甚至是对人体有害的。例如药品中比较有名的酞咪哆啶酮(T h a l i d o m i d e)，也称为反应停，有研究发现其(R)异构体具有减缓孕妇妊娠反应作用，而(S)异构体则具有强烈的致畸作用。又如多巴胺是治疗帕金森症的药物，临床实验证明仅仅(S)异构体有效，(R)异构体则有严重的副作用。而在现有的1 8 5 0 种药物中，天然与半合成药物占5 2 3 种，合成药物1 3 2 7 种。在天然和半合成药物中，非手性的仅有6 种，手性的却有5 1 7 种；在合成药物中，具有手性的有5 2 8 种，其中只有6 1 种是单对映异构体，其它均为外消旋混合物。如何对这些手性药物进行手性分离分析并提供单一的手性异构体，己成为医药界乃至分析化学界倍受关注的课题。对手性药物分离具有开创性的工作首推G i l A v 小组。该小组在19 6 6 年提出的用毛细管气相色谱法对一些手性氨基酸衍生物进行分离，为以后手性药物分离奠定了理论基础。6 0 年代前后，薄层液相色谱法(T L C)、气相色谱法(G C)堙一1 逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分为数不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。8 0 年代初高效液相色谱法H 1(H P L C)迅速成为最为广泛的手性药物分离方法。虽然H P L C 具有很好的分离能力，但是手性固定相的种类和数量有限，成本较高，分离效率不高，许多化合物还不能直接分离分析，在应用方面受到一定的限制。毛细管电泳陆H9(C a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s，C E)技术由于其高效快速，方法简易，分离模式多且容易改变，不需要昂贵的手性固定相，样品和试剂消耗量小，操作成本相对较低等优点，在短短十几年中，成为手性分离方面极其活跃的一个领域。由于目前面临的手性药物分离任务艰巨，因此对手性分离方法的要求也越来越高。1 2 手性分离方法手性拆分的基本出发点就是在手性助剂的作用下将外消旋体拆分为纯对映体化合物。拆分方法主要有：结晶法、酶或微生物法和色谱拆分法。结晶法是目前工业上应用最广泛的制备拆分方法。在晶体中，分子的空间取向和排列是有序且相对固定的。而非对映体之间的晶间力不同，因而可使其得到拆分。结晶法包括直接拆分和利用手性酸、碱试剂成盐后的间接拆分两种。该法主要用于工业制备，一般不能用于旋光纯5度测定。酶法拆分是利用酶对特定光学异构体的高度立体专一性催化反应(多数为水解反应)，使之生成完全不同的化合物后再与其对映体分离。因此，得到的产物旋光纯度很高，适于作各种生物活性和药理实验。这是一种近年来逐渐受到重视的拆分方法。色谱法较传统的方法有许多优点，是目前光学拆分最有用的方法之一。它可以满足多种条件下的对映体的分离和测定的要求，如微量的测定，快速定性与定量，制备规模的分离等。常用的色谱手性分离技术包括：高效液相色谱法(H P L C)、气相色谱法(G C)、超临界流体色谱法(S P F C)、薄层色谱法(T L C)、逆流色谱法。在色谱法中高效液相色谱法分离时不会破坏生物活性，而且色谱柱容量高，为对映体选择性定量测定提供了有效手段。具体如下：1 2 1 手性高效液相色谱法利用H P L C 拆分对映体通常有三种方法：一是利用手性试剂与被拆分物进行柱外衍生化反应生成非对映异构体n0 1 1 1，从而可被传统的非手性H P L C 拆分；二是在流动相中加入手性添加剂，与待测物形成非对映体离子对或络合物，便可在色谱上进行分离。与第一种衍生化法色谱法相比，两者均是建立在非对映异构体的能量差异基础上且均使用非手性固定相，!l a C l8 n 别。但在手性流动相色谱法中，手性添加剂构成色谱系统的一部分且与待测对映异构体之间并未形成共价键结合。手性流动相色谱法按添加剂的不同又可分为手性配位体交换色谱法、手性复合色谱法、手性离子对色谱法。其中，手性配位体交换色谱法即在色谱系统中引入某种金属离子和手性配位体，与待测物形成非对映络合物，经色谱过程实现对映异构体的分离。例如以L-脯氨酸配合剂、以C u 2+为配合离子，用R P H P L C 非手性固定相(O D S 柱)测定青霉胺的对映体n 引。而手性复合色谱法经常采用B 一环糊精这种添加剂与各种极性、非极性分子以及离子形成包含复合物。手性离子对色谱法n 钔则通常在流动相中加入手性离子对试剂，与对映体生成非对映离子对，利用这两种非对映离子对具有不同的稳定性和分配行为而实现分离。H P L C 中的方法之三是利用手性固定相(C H I R A LS T A T I O N A R YP H A S E 简称C S P s)直接对手性物质进行拆分。C S P s H P L C 法之所以能拆分对映体，是因为在C S P s 与外消旋体相互作用时，其中一个对映体与C S P s 生成不稳定的对映体复合物，造成在柱淋洗时保留时间不同，从而达到拆分的目的。目前高效液相色谱手性固定相很多，主要有以下6 大类：(1)多肽或蛋白质手性固定相。蛋白质是一类由手性单元L 氨基酸组成的高分子物质，分子中含有众多的手性中心，而且具有独特的一、二和三级结构。这使得蛋白质分子具有优良的手性识别性能。将蛋白质固定于某种载体(如硅胶)上，从而可以形成手性固定相。K o i d l 5 1 通过1，(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷将L 脯氨酸键合到硅胶上，发现对甲状腺氨酸的分离特别有效。这类色谱通常在反相H P L C 条件下操作，要求低浓度和低荷载量，其选择性和保留时间易受p H、有机调节剂以及离子强度等因素的影响。(2)大环手性固定相n6 1 7 1。本类固定相主要系手性环糊精(C y c l o d e x t r i n，C D)通过某种方式键合到硅胶表面而成。C D 为环状低聚糖，分子呈桶状的特殊结构。C D 分子中含有6多个手性中心，其手性识别主要来自环内腔对脂肪烃和芳烃类侧链的包容作用以及环外侧羟基的氢键作用，从而显示对映体选择性。各类水溶性和不溶性手性药物均能与之形成非对映体复合物。C D 按其组成的不同分为仅、B、干C D 三种，以B C D 应用最广。(3)多糖类手性固定相：主要包括纤维素和淀粉两大类手性固定相。Z h a n g 与L u c i e将纤维素固定到硅胶凝胶表面，制得一种新型手性柱n 印叫叫。与普通的糖肽手性柱相比，该手性柱有更高兼容性、更好的手性识别性能。(4)P i k l e 型手性固定相：主要是氢键型固定相。(5)糖肽类手性固定相：主要是用万古霉素、利福霉素B 等制成的手性固定相。(6)分子印迹手性固定相：利用分子模板而生成的有机高分子固定相。虽然上述固定相具有较高的兼容性和手性识别性能，但H P L C 仍存在费用偏高，分离效率偏低等不足。高效毛细管电泳(1 l i g hp e r f o r m a n c eC E，H P C E)以其高效、快速、消耗溶剂少、样品用量少、成本低、样品处理相对简单等特点，在手性药物分离领域博得人们的亲睐，迅速发展起来。1 2 2 手性毛细管电泳法高效毛细管电泳(H P C E)是8 0 年代后期迅速发展起来的一种新的分析技术，因其多(分离模式多)、快(分析速度快)、高(分辨率高)、省(操作简便、分析费用省)等特点已成为药物分析特别是手性药物分析的重要手段之一。C E 是以毛细管柱为分离通道，高压电场为驱动力，依样品中各组分淌度(溶质在单位时间间隔内和单位电场下移动的距离)和分配行为的差异而实现分离的一种液相分离技术。C E 是电泳技术和层析技术结合的产物，兼有高压电泳的高分辨率和H P L C 的高效率等优点，由于分离原理不同，其选择性与H P L C 有很大互补性。但C E 用迁移时间取代H P L C 的保留时间，C E 分析较H P L C 快、柱效高、所需样品少(n L 级)，缓冲溶液用量少。而对手性药物而言，对映体具有相同的分子量和电荷数，它们的电泳迁移率也相同，采用一般的电泳溶液无法实现分离，有必要在电泳液中添加具有光学活性的分子识别试剂，如光学活性金属配位配合物、环糊精、可溶性冠醚、大环化合物等能与手性对映体形成不同稳定性的对映体，从而达到手性分离的目的。1 2 2 1H P C E 手性分离策略在手性C E 分离中，可以借鉴手性H P L C 法的策略：直接手性分离和间接手性分离。前者系在缓冲液中加入手性添加剂以形成非对映体对，利用非对映复合物稳定性的差异实现手性分离；后者系将手性药物衍生化成非对映体，然后进行分离的。毛细管电泳中普遍采用构建手性环境的方法。例如，使用手性添加剂、手性填充毛细管或制作手性涂层。这三种技术中，后两种涉及到毛细管的填充和涂层技术，操作上较复杂，不如手性添加剂方便，应用相对较少。1 2 2 2 手性药物拆分的C E 模式手性药物拆分的C E 模式主要分为：毛细管区带电泳(C Z E)，胶束电动毛细管色谱(M E C C)、毛细管凝胶电泳(C G E)、毛细管等速电泳(C I T P)和毛细管电色谱(C E C)等。根据分离对象在溶液中的存在形态采用不同的电泳模式。例如，对不带电荷的中性化合物，一般采用M E C C 法。对于带电荷的化合物，往往采用C Z E 法。由于C Z E 模式操作最为简单且具有多样化特点，本节将对此着重介绍。而且它有多种手性添加剂可供选用，这些添加剂可以借手性H P L C 中所用的添加剂。如金属离子配合物C Z E 体系，环糊精C Z E 体系，冠醚C Z E 体系、蛋白质C Z E、低聚糖和多聚糖C Z E 体系以及大分子抗生素C Z E 体系，从而使C Z E 成为最强有力而又最为通用的手性分离方法。下面将作一一介绍。1 2 2 2 1 手性配位体交换C Z E 体系(C L E C E)在金属离子配合物手性拆分的毛细管电泳中，通常用C u(I I)金属离子和L 型氨基酸或缩二氨酸的络合物作为手性添加剂。通过改变实验条件如p H 值、金属离子和配体的比例、温度、配体的种类及表面活性剂来改变手性选择性。它手性分离的机理是基于金属离子络合物和手性对映体形成三元络合物的稳定性不同而实现分离。在1 9 8 5 年，Z a r e 等担2 3 利用铜(I I)与L 组胺的配合物对一系列的丹磺酰氨基酸进行了手性拆分，发现向该体系中加入S D S 或环糊精后，C L E C E 的手性拆分效果得到很好的改善幢3，2 4 。据报道，H e i k e 等人口5 1 在电泳液中加入铜(I I)、钴(I I)、镍(I I)、锌(I I)与葡萄糖和葡萄二酸的配合物，有效地分离了多种芳香氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺二肽手性化合物。在p H=1 2条件下，铜(I I)葡萄糖配合物与钴(I I)葡萄糖分离芳香氨基酸效果最好，但是只有铜(I I)葡萄糖配合物能有效分离甘氨酰谷氨酰胺二肽，镍(I I)配合物的分离能力较弱，而锌(I I)配合物对上述氨基酸没有任何的分离。而L i 口印小组却发现锌(I I)配合物对分离芳香族的氨基酸对映体比较有效。1 2 2 2 2 环糊精C Z E 体系(C D s c z E)环糊精乜7 冽(C D s)是一类常用的手性选择剂，它是由淀粉酶解而成。它是由椅式构象的D(+)吡喃葡萄糖以1，4 糖苷键连结形成的环状葡萄糖聚合物。由于环糊精中的各个葡萄糖基都不能绕糖苷键自由旋转，因此C D 的形状呈锥体圆桶形。圆筒的内侧是以糖苷氧原子连结C H 组成的环，呈现疏水性，可以接受不同类型的客体化合物，尤其是那些非极性基团。空穴的直径依赖C D 的构型。C D 空穴的外环为一级和二级羟基，使得环糊精外部呈亲水性，其中C 2 和C 3 原子上的仲羟基均位于锥体较大的开口端，而C 6 上的伯羟基则位于较小的开口端。当客体分子进入疏水空穴时，C 2 上的羟基与临近糖环上的C 3 上的羟基形成氢键网络，会进一步稳定分子构象。由于C 2 和C 3 位置的羟基均为手性，而且C 2 上的羟基按顺时针方向指向，C 3 上的羟基按逆时针方向指向，这为客体分子提供了一个良好的手性环境，由于这种独特的结构，C D 能够选择性的包合客体分子，从而分离客体手性化合物。由于C D 分子的空腔表面覆盖着带未成键的孤电子对糖苷氧原子氢原子，这不仅使得C D 分子内空腔具有较强的电子密度和L e w i s碱的特点，还使得整个C D 分子具有两亲性能，即腔内疏水，腔外亲水。这种特殊的结构赋予环糊精与大小适合的疏水性客体化合物形成包合物的能力并能改变客体分子的物理、化学、生物学等性质。尽管含有6 1 2 个D 吡喃葡萄糖的环糊精均已经分离获得纯品，但是含有6、7、8 个葡萄糖基的a、p 及丫环糊精最常用，以I B-C D 最易得。其结构示意图见图1 1。L i 啪1 和F a n a l i 啪3 等对I B-C D 的结构、性质及其在手性拆分的应用作了较为详细的总结。一般来说，a C D 憎水腔的尺寸大小与含有一个苯环的化合物相匹配，可以形成包合物，p C D 和T-C D 的空穴可以容纳一个或者多个苯环的化合物。其主要性质见表1 1。所谓包合作用(i n e l u s t i o n)是指客体分子进入环糊精空腔内，并与之发生相互作用的过程，这是一个快速可逆的平衡过程，平衡常数K 也称包合常数。不同的化合物由于立体构型不同，同环糊精的包合作用力有差别，从而实现分离。表1-1 环糊精的一般性质I图1 1B-C D 结构示意图H a n s e n 1 在评价C E 体系中环糊精的作用中指出：环糊精种类的选择是一个反复尝试的过程，最佳的环糊精的浓度取决于所选用的环糊精的种类及其分析物，这两者对成功实现手性分离至关重要。适当的添加一些可以抑制电渗流的物质有利于手性识别和分离。周围环境的温度也会对分离有一定的影响，但这要因所分离的物质而定。此9外，选择合适的缓冲液的p H 值对有效手性分离同样起决定作用。要实现手性分离就要对以上各种影响因素进行一一优化。最先在手性分离领域中得到广泛应用的手性添加试剂是中性的环糊精及其衍生物。早在1 9 8 7 年，S n o p e k 小组口首次将B C D 和二甲基环糊精(D M B C D)成功的用于伪麻黄碱对映体的分离与检测。1 9 9 1 年口羽F a n a l i 用中性C D s C Z E 法分离了用于治疗心绞痛的药物特布他林和心得安，并发现在含有4 0m Mf I-C D 的p H 值为2 5 的磷酸缓冲液中加入尿素和3 0 的甲醇可以大大提高心得安的分离度。1 9 9 3 年，M i c h e l 等人副用a C D、p C D、7-C D 以及二甲基环糊精(D M B C D)对十种结构复杂的物质进行手性拆分，发现分离电压对于分离度有很大影响，尤其对于阳离子的分析物。与色谱方法相比，本方法的分离效果要好得多，其中有九种分析物的分离度(R s)均大于1 4，理论塔板数高达2 6 5 万。1 9 9 6 年，W e s t e r l u n d 口4 1 小组，用D M 6 C D 作为手性选择试剂，对马比佛卡因、罗哌卡因、布哌卡因等麻醉品进行手性分离，发现加入三乙醇胺的添加能逆转电渗流的迁移方向，故能显著提高上述物质的分离度。1 9 9 8 年，I n g a m 用D M p C D 作为手性选择试剂，对止痛药布洛芬及其代谢产物进行手性拆分，发现在p H 值为5 2 6 的条件下，向缓冲液中加入溴化己二甲胺使电渗流迁移方向逆转，而且该方法可以实现尿样中布洛芬对映体的分离与检测。2 0 0 0 年，Z e r b i n a t i 等人m 1 采用Q C D、H P B C D 为手性分离试剂，对含苯氧基的除草剂进行手性分离，并对所形成的包合物的结构进行了预测，为以后的手性分离模式的提出奠定了基础。在以上手性添加剂中以中性环糊精(C D)及其衍生物口刀叫删使用最多，其机理是C D s 内腔呈疏水性，与分析物发生疏水性相互作用，同时C D s 外壳的羟基等与分析物存在氢键、静电等作用，分析物两对映体与C D s 形成的复合物的稳定常数不同，在电场与电渗流作用下对映体得以分离。由于存在电渗流，正负离子均可采用C Z E 予以分离，但中性溶质由于在电场中不移动，故C Z E 不适于中性药物的手性分离。虽然，目前应用最多的手性选择剂是环糊精。然而天然环糊精的分子键合能力和水溶性等物理化学性能存在着一定的局限性，因此，通过化学修饰将功能基引入到环糊精上以增强其分子识别能力，近年来，实现了在C D 环的某一特定位置引入如氨基、磷酸基、磺酸基、羧基等具有离子化特性的功能团，使得这些C D 衍生物带有一定的电荷H 叫48|，它们不但能溶于水，而且在一定的p H 条件下以离子形式存在，所以它们在C Z E 条件下，既可分离带有电荷的手性化合物，也可分离不带电荷的非离子性的化合物。1 9 8 9年，T e r a b e H 鲥首次合成并用带负电的环糊精对丹酰化氨基酸进行了手性拆分。从此，带电荷的环糊精在手性药物分离领域逐渐得到应用。1 9 9 3 年，N a r d i 嘞3 等人合成了一系列新的含有氨基的C D 衍生物，它们能使一些治疗泌尿感染的手性药物及其衍生物得到很好的分离，如对扁桃酸(m a n d e l i ca c i d)及其衍生物的分离度达3 5 以上。1 9 9 8 年，W a n g等人啼妇合成一种阳离子的环糊精一季胺类p 环糊精，简写为(Q A p C D)，成功实现了医药学上常用的胺类物质的手性分离，该体系能有效地抑制峰形拖尾。与此同时，带负电的环糊精逐渐引起人们的关注。其中，磺丁基B 环糊精(S B E B C D)是一种在C E 中应用较广泛的带负电的环糊精衍生物畸2 卜嘲1，S B E B C D 分子中由于磺酸基团的存在使l O得它在很宽的p H 范围内解离而带负电，而且磺酸基团的亲水性使得S B E B C D 在水中的溶解度也大大提高。S B E p C D 在C E J 中的电泳迁移方向和电渗流相反，可同时分离酸性和碱性的手性药物。而另一种带负电的环糊精：磺酸1 3 环糊精(S B C D)畸耵叫5 7 1 在整个p H 范围内均呈负电性，1 9 9 6 年，S t a l c u p m l 合成了取代度在7 1 1 之间的S p C D，在p H3 8 的条件下，成功地对5 6 个外消旋体进行了拆分。2 0 0 1 年，W h 鲫等人利用取代度在7 1 l 之间的S B。C D，在p H 为3 0 时，对1 4 个三唑杀真菌剂的外消旋体进行了拆分。M o r i n 旧1 将S p C D 与S B E p C D 对碱性吡喃衍生物的拆分效果作了对比，发现S p C D 对吡喃衍生物的分离更有效，因而所需要的浓度愈低。羧甲基B 环糊精(C M B C D)也是一种常用的手性选择剂。Z h a n g 哺在拆分噻吗心安、比索洛尔等六种阻滞剂时，发现在p H4 0-7 0 时，选用1 3-C D 和H P 1 3 C D 为手性选择试剂时不能实现分离，而采用C M 1 3 C D 却能有效地对其进行分离。这也是首次报道用C M D C D 对噻吗心安、比索洛尔对映体进行分离。L e l i e v r e 呻幻等合成了两性的环糊精：单(6 谷氨酞基氨基6 脱氧基)一p C D(M o n o 一(6 一g l u t a m y l a m i n o 6 d e o x y)1 3-C D，简写为1 3-C D G l u)，因为它在p H=2 3 时带正电，在p H=1 0 3 1 1 2 时带负电。利用1 3-C D G l u 作为手性选试剂，成功地实现对中性对映体的拆分。由于在许多情况下，单一的中性环糊精或带电环糊精都不能很好地拆分某些手性药物。这种情况下，某些环糊精的混合物，例如：两种中性或一种中性和带电相混合能使某些手性药物得到很好的分离。如M a y e r 呻3 3 等人用带电荷的s-g C D 和全甲基1 3-C D 使S 一(+)一1，l 联萘酚磷酸酯得到了基线分离。C r o m m e n 吼1 小组用带正电的P M M A B C D 和带负电的H S B C D(结构如图1 2)组成双环糊精体系，对四种中性物质：苯氧布洛芬、氟吡洛芬、布洛芬、酮洛芬成功地进行拆分，而且最高的分离度达到1 2 5，并提出了环糊精混合体系的理论模型来优化中性化合物的拆分。2 0 0 8 年，C h u 等人哺即也提出利用S B C D 和甲基B 环糊精(M B C D)双环糊精体系对罗替戈汀对映体进行了手性拆分，取得了令人满意的分离效果。由此可见，双环糊精体系分离中性化合物有其独特的优势。2 0-N 矗+1 7(O M e)7(O M 0 7B图1 2H S 一1 3-C D(A)和P I M A 一1 3-C D(B)结构示意图1 2 2 2 3 冠醚C Z E 体系当客体化合物与冠醚的空穴大小相匹配时，它们可以与客体分子形成包合物。但是这里的包合物完全不同于C D s，是分析物的亲水部分被包合，而C D s 贝J J 是憎水部分。虽然一般的冠醚不具有手性选择能力，但是修饰后的冠醚在手性识别作用中却起着非常重要的作用。例如：通过引入羧基基团形成的1 8 冠一6 羧酸(+)一(1 8-c r o w n 6)2，3，1 1，1 2 t e t r a c a r b o x y l i ca c i d)(1 8 C 6 H 4)是常用的冠醚类手性选择剂，其结构如图1 3 所示。它分离胺类对映体的原理是冠醚上的氧原子与胺的氢原子之间形成氢键，冠醚四个手性碳上的羟基向两侧交叉对映，形成一个手性位阻，使两对映体和冠醚形成有差异的主客体包合物而得到分离。o 八II蝴胁，。oo c 删IH o o e OO c HIlV 图1 31 8 冠6 四羧酸的化学结构图K _ u b n 旧6 力首先使用上述手性冠醚对2 0 多种光学活性胺基苯类物质实现了基线分离，并研究了它们的手性识别机理。之后该小组又对酪氨酸、色氨酸以及多巴胺进行手性拆分，取得了满意的分离效果。林金明等人旧1 采用C D 和1 8 C 6 H 4 混合识别剂，成功地分离了既具有位置异构又含有手性异构的氟化苯丙氨酸，发现酸度的影响非常明显。这可能是因为1 8 C 6 H 4 含有4 个羧基，是一弱酸性化合物，受电泳缓冲液酸碱作用比较敏感。利用1 1 8 C 6 H 4 作为手性选择试剂同时还受到试样结构的限制，只有含有氨基的试样才能有效的与冠醚环形成配合物，所以目前所报道的所有分析对象都是含氮化合物。N i s h i 等人哺引用冠醚作为分子识别剂，比较了H P C E 和H P L C 对胺类化合物的分离效果，一些分子量在1 0 0 0 左右的甲氨基化合物用H P L C 无法获得满意的结果，而用C E 分离效果良好。K u h n 口们还针对冠醚在C E 手性分析方面的研究与应用做了较详细的综述和评论。如果能够开发新型且使用面广的C E 手性化合物分离用的冠醚，将对手性化合物分子识别起到重要的贡献。直至U 2 0 0 8 年，N a g a t a 等人n“利用X 射线对1 8 C 6 H 4 在手性分离胺类以及氨基酸过程中的构象变化进行深入研究，并提出1 8 C 6 H 4 从它的一级构象转变到适合手性识别的其他构象的一些可能路径。1 2 2 2 4 大分子抗生素C Z E大分子抗生素结构中含有多种功能团，如羟基、氨基、多环等。羟基的基团使得它们具有很好的水溶性，而多环结构使得它们具有一定疏水性。在分离过程中，分析化合物的疏水部分可以被包进抗生素疏水结构中，且极性部分可以与分析物形成氢键。这些功能团以及环状分子中的光学异构部位的原子对于分子间的相互作用和手性分子识别都具有重要的作用。目前主要有两大类大环抗生素用于手性分离：糖肽类抗生素1 2和安莎霉素类抗生素。己经被广泛使用的霉素类抗生素有万古霉素(v a n e o m y e i n)、瑞斯托菌素A(R i s t o e e t i n A)、利福霉素B(R l f a m y e i nB)、T e i e o p l a n i n 和e r y t h r o m y c i n(红霉素)。A r m s t r o n g 等盯2 1 用v a n o o m y c i n 成功地分离了1 0 0 多种酸性手性药物，其中包括多种氨衍生化氨基酸和含有羧基功能团的药物等。他们 踟还报道了用R i s t o c e t i n A 作为识别剂分离酸性手性化合物的研究，这一大环化合物与v a n c o m y c i n 的结构和分子识别特性有许多相似点，但是有些能用R i s t o c e t i n A 分离的化合物，如苯乙醇酸、2 甲氧基苯乙醇酸等用v a n c o m y c i n 作为识别剂时无法得到满意的分理效果。T e i e o p l a n i n 也属糖肽抗生素大环化合物中的一种，可溶于水，含有一个自由氧基、一个自由羧基，它的结构与v a n e o y m e i n 有一定的相同点，但主要的不同在于含有D 甘露糖，以及一个脂肪酸残基。处于分子同一尾部的葡糖氨基和脂肪酸残基倾向于相互结合形成一个亲水性的分子末端，所以在水溶液中T e i c o p l a n i n 具有表面活性剂的特性，高于一定浓度时自聚合形成胶束，其临界浓度受p H 的影响较显著，所以这一化合物被认为是具有手性识别的表面活性剂，成为分子识别表面活性剂的一个典型例子。近年来，大环抗生素作为C E 手性化合物分离的分子识别剂已受到普遍重视口钔叫7 7 1。1 2 2 2 5 蛋白质一C Z E蛋白质也被成功地用于C Z E 手性分离。在C Z E 过程中蛋白质作为手性选择剂的分离机理是基于分离过程中蛋白质和两个对映体之间的亲和作用的差异，形成两个不稳定的非对映异构体配合物。用于C Z E 手性拆分的蛋白质有牛血清白蛋I 刍(B S A)、卵类粘蛋白(o v o m u e o i d)、血清类粘蛋t 兰t(o r o s o m u e o i d)、纤维素酶等。B u s c h 等m 1 应用B S A、o v o m u e o i d、o r o s o m u e o i d 和菌质纤维素酶作为C Z E 添加物对华法林(w a r f a r i n)等5 种药物的手性分离做了比较研究，结果以B S A 最为有效。蛋白质浓度对手性分离的影响因手性化合物在蛋白质分子上作用点的不同而不同，将蛋白质与环糊精联用可以取得更好的分离效果H 叫1 船1。1 2 2 3 手性分离的机理D a l g l i e s h 提出三点作用模式图如1 4 所示，他指出三点同时作用对于手性选择性是必需的。后来P