酶联免疫法原理及操作.pptx

酶联免疫法原理及操作酶联免疫法原理及操作酶联免疫法原理及操作第1页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.ELISA原理原理2.ELISA类型类型3.试剂准备试剂准备：免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物准备酶底物准备 4.对照设定对照设定5.标本采取和保留标本采取和保留6.结果判断结果判断 酶联免疫法原理及操作第2页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果 ELISA ELISA是一个免疫测定（是一个免疫测定（immunoassayimmunoassay，IAIA）。基础。基础:抗抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。加入酶反应底物后，原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量与标本中受检物质量底物被酶催化成为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关，由此进行定性或定量分析。直接相关，由此进行定性或定量分析。1.ELISA原理原理酶联免疫法原理及操作第3页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联免疫年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称），简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定酶联免疫法原理及操作第4页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一个动态平抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一个动态平衡，其反应式为：衡，其反应式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体亲和力（抗体亲和力（affinityaffinity），能够用平衡常数），能够用平衡常数K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb解离程度与解离程度与K K值相关。值相关。高亲高亲和力抗体抗原结合点与抗原决定簇在空间构型上非常适合，和力抗体抗原结合点与抗原决定簇在空间构型上非常适合，二者结合牢靠，不易解离。二者结合牢靠，不易解离。解离后抗原或抗体均能保持原解离后抗原或抗体均能保持原有结构和活性。有结构和活性。酶联免疫法原理及操作第5页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体结合发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。抗原抗体结合发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，含有高度特异性。化学结构和空间构型互补关系，含有高度特异性。测定某一特定物质，而不需先分离待检物。测定某一特定物质，而不需先分离待检物。酶联免疫法原理及操作第6页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.1.31.1.3最适百分比最适百分比 酶联免疫法原理及操作第7页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.1.41.1.4敏感性敏感性化学比色法敏感度为化学比色法敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法敏感度约为酶反应测定法敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法敏感度与酶反应法相仿标识免疫敏感度可提升数千倍，达标识免疫敏感度可提升数千倍，达ng/mlng/ml水平水平比如，比如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。酶联免疫法原理及操作第8页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.41.4免疫测定在临床检验中应用免疫测定在临床检验中应用因为各种抗原成份，包含小分子半抗原，均可用以制备特因为各种抗原成份，包含小分子半抗原，均可用以制备特异性抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测异性抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中对应抗原，所以免疫测定应用范围极广。标本中对应抗原，所以免疫测定应用范围极广。酶联免疫法原理及操作第9页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2 2ELISAELISA类型类型 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要试剂：法中有三个必要试剂：（1 1）固相抗原或抗体，即）固相抗原或抗体，即 免疫吸附剂免疫吸附剂（immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶标识抗原或抗体，称为）酶标识抗原或抗体，称为 结合物结合物（conjugateconjugate）；（3 3）酶反应底物。）酶反应底物。可设计出各种不一样类型检测方法。可设计出各种不一样类型检测方法。酶联免疫法原理及操作第10页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.12.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适合用于检验各种蛋白质等大分子抗原，比如此法适合用于检验各种蛋白质等大分子抗原，比如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要取得针对受检抗原异性抗体，就可用等。只要取得针对受检抗原异性抗体，就可用于于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。酶联免疫法原理及操作第11页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.2 2.2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，所以其敏感度相对高于标本不需稀释，可直接用于测定，所以其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg检测常采取本法。本法关键检测常采取本法。本法关键在于酶标抗原制备，应依据抗原结构不一样，寻找适当标在于酶标抗原制备，应依据抗原结构不一样，寻找适当标识方法。识方法。酶联免疫法原理及操作第12页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.3 2.2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病诊疗。间接法优点是只要变换包被抗原就可利用传染病诊疗。间接法优点是只要变换包被抗原就可利用同一同一酶标抗抗体酶标抗抗体建立检测对应抗体方法。建立检测对应抗体方法。酶联免疫法原理及操作第13页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.4 2.2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中干扰物质不易除去，或不易得到足够纯化抗原当抗原材料中干扰物质不易除去，或不易得到足够纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。时，可用此法检测特异性抗体。酶联免疫法原理及操作第14页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.5 2.2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法两个以上小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法两个以上位点位点，所，所以不能用双抗体夹心法进行测定，能够采取竞争法模式。以不能用双抗体夹心法进行测定，能够采取竞争法模式。其原理是标本中抗原和一定量酶标抗原竞争与固相抗体结其原理是标本中抗原和一定量酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上酶标抗原愈少，合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上酶标抗原愈少，最终显色也愈浅。小分子激素、药品等最终显色也愈浅。小分子激素、药品等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。酶联免疫法原理及操作第15页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.6 2.2.6 捕捉包被法测抗体捕捉包被法测抗体IgMIgM检测常见于传染病诊疗。用抗人检测常见于传染病诊疗。用抗人IgMIgM抗体包被固相，以抗体包被固相，以捕捉血清标本中捕捉血清标本中IgMIgM（其中包含针反抗原特异性（其中包含针反抗原特异性IgMIgM抗体和抗体和非特异性非特异性IgMIgM）。）。此法常见于病毒性感染早期诊疗。此法常见于病毒性感染早期诊疗。酶联免疫法原理及操作第16页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG（BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；酶联免疫法原理及操作第17页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.ELISA3.ELISA试剂试剂(A(A、B B、C C三个别三个别)ELISAELISA中有三个必要试剂：免疫吸附剂、结合物和酶底物。中有三个必要试剂：免疫吸附剂、结合物和酶底物。（1 1）已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标识抗原或抗体（结合物）；）酶标识抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶底物；）酶底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5 5）结合物及标本稀释液；）结合物及标本稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液酶联免疫法原理及操作第18页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果ELISAELISA试剂准备试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯含有较强吸附蛋白质性能，抗体或蛋白质聚苯乙烯含有较强吸附蛋白质性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来免疫学活性。抗原吸附其上后仍保留原来免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质吸附性能比聚苯乙烯高，但聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。空白值也略高。良好良好ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底透明度孔底透明度高高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。酶联免疫法原理及操作第19页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.2 3.1.2 包被方式包被方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合，靠是与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合，靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面疏水基团间作用。蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面疏水基团间作用。这种物理吸附是非特异性，受蛋白质分子量、等电点、浓度这种物理吸附是非特异性，受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多等影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多疏水基疏水基团团，故更易吸附到固相载体表面。，故更易吸附到固相载体表面。酶联免疫法原理及操作第20页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果不易吸附不易吸附非蛋白质抗原可用间接包被抗原经固相抗体亲和层析非蛋白质抗原可用间接包被抗原经固相抗体亲和层析作用，包被在固相上抗原纯度大大提升，所以含杂质较多抗原作用，包被在固相上抗原纯度大大提升，所以含杂质较多抗原也可采取捕捉包被法。也可采取捕捉包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化即用亲和素先包被载体，加入生物素化DNADNA，这种包被方法均匀、牢靠，已扩充应用于各种抗原物质定量测这种包被方法均匀、牢靠，已扩充应用于各种抗原物质定量测定。定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（比如乙醇）无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（比如乙醇）中溶解后加入中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：试验特异性、敏感性均由此得以改进，重复性亦佳。优点：试验特异性、敏感性均由此得以改进，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被抗原用量少，仅为直接包被1/101/10乃至于乃至于/100/100。酶联免疫法原理及操作第21页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。普通是抗原决定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。普通只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但因为分子量太只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但因为分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体吸附，小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体吸附，间接地结合到固相载体表面。间接地结合到固相载体表面。酶联免疫法原理及操作第22页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体结合段上，抗体结合点暴露于外。点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体培养液取材于抗血清或含单克隆抗体培养液.须除去杂抗体后才能用须除去杂抗体后才能用于于ELISAELISA，以确保试验特异性。，以确保试验特异性。腹水中单抗浓度较高，特异性亦较强，所以不需要作吸收层腹水中单抗浓度较高，特异性亦较强，所以不需要作吸收层析处理，直接包被。在一些情况下，用各种单抗混合包被，析处理，直接包被。在一些情况下，用各种单抗混合包被，可取得更加好效果。可取得更加好效果。酶联免疫法原理及操作第23页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.5 3.1.5 包被条件包被条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8TrisHCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保温中保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物性质可有很大改变，每批材小时。包被浓度随载体和包被物性质可有很大改变，每批材料需经过试验与酶结合物浓度协调选定。普通蛋白质包被浓料需经过试验与酶结合物浓度协调选定。普通蛋白质包被浓度为度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。酶联免疫法原理及操作第24页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.6 3.1.6 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度无关蛋白质溶液再是继包被之后用高浓度无关蛋白质溶液再包被过程。封闭就是让大量不相关蛋白质充填这些空隙，包被过程。封闭就是让大量不相关蛋白质充填这些空隙，从而排斥从而排斥ELISAELISA后步骤中干扰物质再吸附。后步骤中干扰物质再吸附。常见封闭剂：常见封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%BSA;10%BSA;10%小牛血清或小牛血清或1%1%明胶明胶;脱脱脂奶粉脂奶粉,比较价廉，能够高浓度使用（比较价廉，能够高浓度使用（5%5%）。）。全部全部ELISAELISA固相均需封闭？固相均需封闭？酶联免疫法原理及操作第25页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.4 3.4 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常见稀释液为含中，常见稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸磷酸盐缓冲液。盐缓冲液。酶联免疫法原理及操作第26页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果ELISA试剂准备试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标识抗体（或抗原）是即酶标识抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键试剂中关键试剂 1 1 酶催化活性酶催化活性 2 2抗体（或抗原）免疫活性抗体（或抗原）免疫活性 3 3含有或少含有游离抗体（或抗原）含有或少含有游离抗体（或抗原）4 4结合物尚要有良好稳定性。结合物尚要有良好稳定性。酶联免疫法原理及操作第27页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.1 3.2.1 结合物用抗原和抗体结合物用抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高制备结合物时所用纯度较高IgGIgG，以免在与酶联结时其它，以免在与酶联结时其它杂蛋白干扰。最好用层析纯化抗体，这么全部酶结合物均杂蛋白干扰。最好用层析纯化抗体，这么全部酶结合物均含有特异免疫活性，能够在高稀释度进行反应，试验结果含有特异免疫活性，能够在高稀释度进行反应，试验结果本底浅淡。在本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原模式不多，总要求是抗原中用酶标抗原模式不多，总要求是抗原必须是高纯度。必须是高纯度。酶联免疫法原理及操作第28页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.23.2.2酶酶纯度高，催化反应转化率高，专一性强，性质稳定，起源丰纯度高，催化反应转化率高，专一性强，性质稳定，起源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同酶。富，价格不贵，受检标本中不存在相同酶。酶结合物保留活性个别和催化能力，底物易于制备和保留，酶结合物保留活性个别和催化能力，底物易于制备和保留，价格低廉，有色产物易于测定等。价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲半乳糖苷酶和脲酶等。酶等。HRPHRP是一个糖蛋白，含糖量约为是一个糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一个，是一个复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一个卟啉蛋白质。是一个卟啉蛋白质。酶联免疫法原理及操作第29页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.3 3.2.3 结合物制备结合物制备酶标识抗体制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐酶标识抗体制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一个双功效团试剂，可使酶与戊二醛交联法：戊二醛是一个双功效团试剂，可使酶与蛋白质氨基经过它而联结。有效（结合率达蛋白质氨基经过它而联结。有效（结合率达60%-70%60%-70%）和重复）和重复性好。性好。交联反应是随机，结合物大小也不均一，酶与酶，抗体与交联反应是随机，结合物大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。抗体之间也有可能交联，影响效果。（2 2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高酶。过碘酸钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高酶。过碘酸钠将HRPHRP分子分子表面多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上氨基形成表面多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上氨基形成chiffchiff氏氏碱而结合。简便有效碱而结合。简便有效.酶联免疫法原理及操作第30页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果 结合物中混有游离酶普通不影响结合物中混有游离酶普通不影响ELISAELISA中最终酶活性测定。中最终酶活性测定。但游离抗体则会与酶标抗体竞争对应固相抗原，所以制备酶结但游离抗体则会与酶标抗体竞争对应固相抗原，所以制备酶结合物应予纯化，去除游离酶和抗体后用于检测，效果更加好。合物应予纯化，去除游离酶和抗体后用于检测，效果更加好。制得结合物，最适工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，制得结合物，最适工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低本底，并取得测定最正确灵敏度，到达最适当测能维护一个低本底，并取得测定最正确灵敏度，到达最适当测定条件和测定费用节约。定条件和测定费用节约。酶联免疫法原理及操作第31页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.43.2.4结合物保留结合物保留 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保留一年左右。结合物溶液中定，冻干后可在普通冰箱中保留一年左右。结合物溶液中加入等体积甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素加入等体积甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（比如庆大霉素）和防腐剂（比如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合物加硫柳泵，结合物加硫柳泵，APAP结结合物可加叠氮钠）。合物可加叠氮钠）。酶联免疫法原理及操作第32页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.5 3.2.5 结合物稀释液结合物稀释液 用于稀释高浓度结合物以配成工作液。为防止结合物在反用于稀释高浓度结合物以配成工作液。为防止结合物在反应中直接吸附在固相载体上：应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，0.05%0.05%吐温吐温20 20。试剂盒均已用适当缓冲液配成工作液，使用时不。试剂盒均已用适当缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在需再行稀释，在4-84-8保留期可达保留期可达6 6个月。个月。酶联免疫法原理及操作第33页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果试剂准备试剂准备 C 酶底物酶底物酶联免疫法原理及操作第34页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.3 3.3 酶底物酶底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP底物底物OPDOPD氧化后产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常见底物。结合物最常见底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，为供氧体，H2O2为受氢体。为受氢体。DH2普通为无色化合物，经酶作用后成为有色产物。普通为无色化合物经酶作用后成为有色产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。E酶联免疫法原理及操作第35页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果TMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成溶液性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采取。采取。HRPHRP对氢受体专一性很高，仅作用于对氢受体专一性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇过氧化物和、小分醇过氧化物和尿素过氧化物尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。酶联免疫法原理及操作第36页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果APAP底物为磷酸酯酶，普通采取对底物为磷酸酯酶，普通采取对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为底作为底物。产物为黄色对硝基酚，在物。产物为黄色对硝基酚，在405nm405nm波优点有吸收峰。波优点有吸收峰。用用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。终止酶反应后，黄色可稳定一时间。APAP也有发也有发荧光底物（磷酸荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮），可用于甲基伞酮），可用于ELISAELISA作荧光作荧光测定，敏感度较高于用显色底物比色法。测定，敏感度较高于用显色底物比色法。酶联免疫法原理及操作第37页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.5 3.5 酶反应终止液酶反应终止液常见常见HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓度按加反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液最终体积而异，在板式量及比色液最终体积而异，在板式ELISAELISA中普中普通采取通采取2mol/L2mol/L。酶联免疫法原理及操作第38页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative(negative control)control)是检验试验有效性控制品，同时也作为判断结果对是检验试验有效性控制品，同时也作为判断结果对照。照。阳性对照品基础组成应尽可能与检测标本组成相一致，多以含蛋阳性对照品基础组成应尽可能与检测标本组成相一致，多以含蛋白保护剂缓冲液为基质。白保护剂缓冲液为基质。加入量应与试剂敏感度相当；加入量应与试剂敏感度相当；在测定中得到吸光值与受检标本吸光值比较，能够预计标本物质在测定中得到吸光值与受检标本吸光值比较，能够预计标本物质量。量。酶联免疫法原理及操作第39页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用参考标准品，应包含覆盖可检测范围标准曲线用参考标准品，应包含覆盖可检测范围4-54-5个浓度，个浓度，普通均配入含蛋白保护剂及防腐剂缓冲液中普通均配入含蛋白保护剂及防腐剂缓冲液中.阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。比如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。比如HBsAgHBsAg检测阴性检测阴性对照品中不可含对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。酶联免疫法原理及操作第40页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果5 5 标本采取和保留标本采取和保留 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原纤维蛋白原和和抗凝剂抗凝剂外，外，其它成份同血清。血浆和血清可同等应用。其它成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应防止溶血：红细胞溶解时会释放出含有过氧化物血清标本应防止溶血：红细胞溶解时会释放出含有过氧化物酶活性物质，以酶活性物质，以HRPHRP为标识为标识ELISAELISA测定中，可能会增加非特异测定中，可能会增加非特异性显色。性显色。酶联免疫法原理及操作第41页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果加样加样:在在ELISAELISA中普通有中普通有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔底部，防止板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。基础操作注意事项基础操作注意事项酶联免疫法原理及操作第42页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果保温保温抗原抗体完成反应保温过程称为温育抗原抗体完成反应保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面上发生。属固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面上发生。为何为何ELISAELISA反应总是需要一定时间温育？反应总是需要一定时间温育？温育常采取温度有温育常采取温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等。（冰箱温度）等。3737是试验室中常见保温温度，也是大多数抗原抗体结合适是试验室中常见保温温度，也是大多数抗原抗体结合适当温度。当温度。酶联免疫法原理及操作第43页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果保温方式：保温方式：ELISAELISA仪器附有特制电热块，水浴。仪器附有特制电热块，水浴。若用保温箱：若用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿纱布，最终将板放在湿盒内，在盒底垫湿纱布，最终将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以确保各板温度板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以确保各板温度都能快速平衡。都能快速平衡。室温温育反应，操作时室温应严格限制在要求范围内，标准室温温育反应操作时室温应严格限制在要求范围内，标准室温温度是指室温温度是指20-2520-25，但详细操作时可依听说明书要求控制，但详细操作时可依听说明书要求控制温育。应注意温育温度和时间应按要求力争准确。为确保这温育。应注意温育温度和时间应按要求力争准确。为确保这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。酶联免疫法原理及操作第44页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着试验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着试验成败。成败。ELSIAELSIA洗涤：到达分离游离和结合酶标识物目标。洗涤：到达分离游离和结合酶标识物目标。去除残留在板孔中游离物质，以及非特异性地吸附干扰物质。去除残留在板孔中游离物质，以及非特异性地吸附干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质吸附是普遍性，而在洗涤时又应把这种非特异性聚苯乙烯等塑料对蛋白质吸附是普遍性，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附干扰物质洗涤下来。吸附干扰物质洗涤下来。能够说在能够说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要关键技术。操作中，洗涤是最主要关键技术。洗涤方式除一些洗涤方式除一些ELISAELISA仪器配有特殊自动洗涤仪外，手工操作仪器配有特殊自动洗涤仪外，手工操作有有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：酶联免疫法原理及操作第45页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体洗涤，洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已经有试验表明，流水冲洗式一样适合用于微量滴定板洗涤。已经有试验表明，流水冲洗式一样适合用于微量滴定板洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。（2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采取。洗涤液为微量滴定板多采取。洗涤液为非离子型洗涤剂非离子型洗涤剂中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质结合是中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质结合是疏水性疏水性，非离子型，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。状态，从而脱离固相载体。酶联免疫法原理及操作第46页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果显色显色显色是酶催化无色底物生成有色产物温育反应。反应温度和显色是酶催化无色底物生成有色产物温育反应。反应温度和时间仍是影响显色原因。在一定时间内，阴性孔可保持无色，时间仍是影响显色原因。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间延长而呈色加强。适当提升温度有利于加而阳性孔则随时间延长而呈色加强。适当提升温度有利于加速显色进行。速显色进行。TMBTMB受光照影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察受光照影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为确保试验结果稳定性，宜在要求适当初间阅读结结果。但为确保试验结果稳定性，宜在要求适当初间阅读结果。果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，随即逐步减弱，分钟显色达顶峰，随即逐步减弱，至至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。酶联免疫法原理及操作第47页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果比色比色拭干板底附着液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程孔），孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程孔），以统计此次试验试剂情况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以统计此次试验试剂情况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔吸光度需减去空白孔吸光度，然后进行计算。以上各孔吸光度需减去空白孔吸光度，然后进行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按要求用吸光度），现按要求用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），二者含义相同。通常表示方法是，将吸），二者含义相同。通常表示方法是，将吸收波长写于收波长写于A A字母右下角，如字母右下角，如OPDOPD吸收波长为吸收波长为492nm492nm，表示方法，表示方法为为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶联免疫法原理及操作第48页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。针对固相光度计。针对固相载体形式不一样，各有特制适合用于板、珠和小试管设计。载体形式不一样，各有特制适合用于板、珠和小试管设计。酶标仪主要性能指标有：测读速度、读数准确性、重复性、酶标仪主要性能指标有：测读速度、读数准确性、重复性、准确度和可测范围、线性等等。优良酶标仪读数普通可准确准确度和可测范围、线性等等。优良酶标仪读数普通可准确到到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分钟，测分钟，测读结果更稳定。测读读结果更稳定。测读A A值时，要选取产物敏感吸收峰，如值时，要选取产物敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。有酶标仪可用双波长式测读。波长。有酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不一样，使用中应详细阅读说明书。各种酶标仪性能有所不一样，使用中应详细阅读说明书。酶联免疫法原理及操作第49页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定定性测定结果判断作出定性测定结果判断作出“有有”或或“无无”回答，分别用回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应最高稀释度即为滴度。依据滴稀释后进行试验，呈阳性反应最高稀释度即为滴度。依据滴度高低，能够判断标本反应性强弱，这比观察不稀释标本呈度高低，能够判断标本反应性强弱，这比观察不稀释标本呈色深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。色深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应结果判中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应结果判断方法不一样，分述于下。断方法不一样，分述于下。酶联免疫法原理及操作第50页原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果A.A.阳性判定值：阳性判定值