蟾蜍骨骼肌兴奋收缩实验-实验报告.docx

生理科学实验报告
实验1：蟾蜍骨骼肌兴奋收缩实验
实验组成员：刘谨、杨莹莹、张敏霞
浙江大学医学院 临床医学（七年制）1008班
【摘要】实验目的：学习使用RM6240多道生理信号采集处理系统和换能器的使用。掌握制备具有正常兴奋收缩功能的蛙类坐骨神经-腓肠肌标本基本操作技术。观察不同刺激强度、频率对肌肉收缩的影响。观察神经-肌肉接头兴奋传递和骨骼肌兴奋的电变化与收缩之间的时间关系及其各自特点。
【关键词】神经-肌肉、刺激强度、频率、电位变化、张力变化
【实验原理】蛙类的某些基本生命活动和生理功能与哺乳类动物有相似之处，而且其离体组织的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此，蛙或蟾蜍的坐骨神经-腓肠肌标本常被用来观察神经-肌肉的兴奋性、刺激与反应的规律及肌肉收缩特点等实验。肌肉组织的兴奋主要表现为收缩活动，一个刺激是否能使组织发生兴奋，不仅与刺激形式有关还与刺激时间、强度、强度-时间变化三要素有关，若用方形电脉冲刺激则组织兴奋只与刺激强度、时间有关，终板电位可引起肌肉产生兴奋在宏观上表现为肌肉收缩。肌肉的收缩形式不仅与刺激本身有关而且还与刺激频率有关。若刺激频率较小，则表现为单收缩，逐渐增大刺激频率则变现为不完全强直收缩，继续增强则表现为完全强直收缩。
【实验步骤】
1. 实验材料
1.1 实验动物：蟾蜍
1.2 实验试剂：任氏液，甘油高渗任氏液
1.3 实验器材：一维微调器，BB-3G屏蔽盒，针形引导电极，张力换能器，RM6240多道生理信号采集处理系统
2. 实验方法
2.1 蟾蜍坐骨神经神经-肌肉标本的制作
取蟾蜍一只常规方法毁脑脊髓，剪断脊柱并且剪除蟾蜍躯干上部以及内脏，避开神经剥除蟾蜍的皮肤，于任试液中清洗，剪除骶骨分离坐骨神经于坐骨神经根部结扎，将标本固定于木板上，分离大腿部坐骨神经，直至分离至腘窝胫神经分叉处。然后剪断股二头肌腱、半腱肌和半膜肌肌腱，并绕至前方剪断股四头肌腱。用剪刀刮除股骨上的肌肉，在距膝关节约1cm处剪断股骨。在腓肠肌肌腱处结扎然后剪断分离出坐骨神经-腓肠肌，并置于任试液中待用。
2.2 实验系统连接和参数设置
张力换能器输入RM6240系统第一通道，刺激输出接标本盒刺激电极。开启计算机和RM6240多道生理信号采集处理系统的电源。启动RM6240多道生理信号采集处理系统软件，在其窗口点击“实验”菜单那，选择“刺激强度（或频率）对骨骼肌收缩的影响”项。仪器参数：第1通道模式为张力。采集频率400Hz~1kHz，扫描速度1s/div，灵敏度10~30g，时间常数为直流，滤过频率100Hz。在“选择”下拉菜单中选择“强度/频率”项，显示刺激参数。
2.3 实验装置连接
将离体的坐骨神经腓肠肌标本的股骨插入标本盒的固定孔中，旋转固定螺钉固定标本，腓肠肌的跟腱结扎线系于张力换能器的悬臂梁上。坐骨神经放在刺激电极上，保持神经与电极接触良好。调节一维微调器，将前负荷调至2g。
2.4 实验观察项目
2.4.1 毁脑脊髓前后蟾蜍四肢肌张力的变化。用锌铜弓分别刺激坐骨神经和腓肠肌，观察肌肉的反应。
2.4.2 刺激强度对骨骼肌收缩的影响 刺激方式：单次，刺激波宽：0.1ms。电极记录窗口的记录按钮，开始记录，按刺激器的“刺激”按钮，刺激强度从0.1V逐渐增大，强度增量为0.05V，连续记录肌肉收缩曲线。记录阈刺激与阈刺激时的张力和最大刺激与最大刺激是的张力。
2.4.3 刺激频率对骨骼肌收缩的影响 将刺激强度设置为最大刺激强度，波宽：0.1ms。刺激模式为频率递增方式，起始频率1Hz，步长为1Hz，组间延时大于10s，连续记录不同频率是的收缩曲线，观察不同刺激频率时的肌肉收缩张力变化。
2.4.3 同步记录神经干动作电位、骨骼肌动作电位、肌肉收缩曲线。通道1记录肌张力、通道2记录肌膜电位、通道3记录神经干电位。刺激模式为双刺激，刺激强度为最大刺激强度，刺激波宽为0.1ms，同步出发。针形引导电极插入腓肠肌并固定。观察记录刺激间隔0.5、2、10ms情况下神经干动作电位、肌膜电位波形和腓肠肌的收缩曲线。
2.4.4 观察甘油高渗任试液处理肌肉后的肌肉动作电位和收缩 用浸润20%~30%甘油高渗任试液的棉花包裹腓肠肌，每隔30s用单刺激标本一次。记录出现有动作电位无腓肠肌收缩的时间。
2.5 统计方法 结果以表示，统计学分析采用Student’s t-test方法。
【实验结果】
3.1蟾蜍坐骨神经干阈刺激是0.540±0.211V,此时的收缩张力为1.437±0.828g，最大刺激为0.999±0.409V,此时的收缩张力为11.162±5.797g。阈强度刺激时的肌肉收缩力1.437±0.828g显著低于最大刺激强度刺激时的肌肉收缩力11.162±5.797g，两者有显性差异（p=0.0002<0.05).
表1 不同刺激强度刺激坐骨神经对蟾蜍腓肠肌收缩张力的影响
样本
阈刺激
最大刺激
强度（V）
收缩张力（g）
强度（V）
收缩张力（g）
1
0.400
1.800
0.700
10.490
2
0.650
0.500
1.250
24.230
3
0.500
1.447
1.550
11.433
4
0.550
3.180
0.800
16.370
5
0.550
1.832
1.350
13.320
6
0.350
1.450
0.650
5.800
7
0.400
1.920
0.700
9.320
8
0.250
0.800
0.340
8.700
9
0.850
1.110
1.450
7.900
10
0.900
0.330
1.200
4.053

0.540±0.211
1.437±0.828
0.999±0.409
11.162±5.797
3.2 刺激强度（U）与肌肉收缩张力（T）的关系：
在阈刺激强度与最大刺激强度之间 ，腓肠肌的收缩力随着刺激强度的增大而增大，刺激强度大于最大刺激强度，腓肠肌的收缩力不再增大，见图1。

表2刺激强度与肌肉收缩张力之间关系
刺激强度（V）
0.1
……
0.9
0.95
1.0
1.05
1.1
1.15
1.2
收缩张力（g）
0
0
0.33
0.646
3.373
2.563
3.463
3.393
4.053

图1.刺激强度与收缩张力关系曲线

3.3 不同频率刺激刺激坐骨神经对腓肠肌收缩张力的影响：
刺激波宽0.1ms，最大刺激强度时，单收缩的刺激频率为1Hz，不完全强直收缩的刺激频率为5Hz 、完全强直收缩的刺激频率为20.7Hz 。不完全强直最大收缩力18.44±11.97(g)显著高于单收缩的最大收缩力为`10.46±5,81 (g)（p=0.0057<0.05）和完全强直最大收缩力`74.82±40.91 (g)显著高于单收缩的最大收缩力为`10.46±5,81 (g)（p=0.0002<0.05），见表3
表3 不同刺激频率刺激坐骨神经对蟾蜍腓肠肌收缩张力的影响
编号
单收缩
不完全强直收缩
完全强直收缩
频率（Hz）
张力（g）
频率（Hz）
张力（g）
频率（Hz）
张力（g）
1
1
2.80
5
6.65
16.0
23.05
2
1
16.00
5
40.00
21.0
101.00

3
1
14.11
5
18.32
23.0
122.01
4
1
11.55
5
32.06
18.0
129.15
5
1
11.36
5
19.24
29.0
85.74
6
1
5.50
5
7.15
29.0
58.26
7
1
7.86
5
10.97
20.0
29.16
8
1
22.00
5
31.00
15.0
105.02
9
1
8.43
5
8.98
18.0
75.84
10
1
4.94
5
10.07
18.0
18.50

1±0
10.46±5,81
5±0
18.44±11.97
20.7±4.9
74.82±40.91
3.4收缩张力与刺激频率的关系：
随着频率刺激的逐渐增大，腓肠肌的收缩力不断增加，到完全强直收缩后，再增加刺激频率，腓肠肌的收缩力增大趋缓，见图2：

表4刺激频率与肌肉张力关系表
刺激频率（Hz）
1
2
3
4

5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
张力（g）
4.94
4.95
7.14
6.78
10.07
10.26
11.17
11.91
12.64
15.02
14.84
11.72
13.37

刺激频率（Hz）
14
15
16
17
18
19
20

张力（g）
14.29
15.21
17.22
18.32
18.50
18.50
18.45

图2.刺激频率与收缩张力关系曲线

3.5 不同刺激波间隔对肌肉收缩的影响
刺激波间隔为0.5，2ms，10ms时，腓肠肌的收缩张力如表3
表3 不同波间隔与肌肉收缩张力关系
编号
0.5ms
2ms
10ms
1
12.97
18.58
22.50
2
11.01
11.56
22.43
3
5.24
5.35
18.65
4
24.18
9.09
14.03
5
14.80
15.57
15.90
6
2.71
3.77
7.84
7
1.54
1.85
7,13
8
6.36

7.02
7.40
9
1.69
1.76
6.31

8.94±7.53
8.28±5.97
13.58±6.66
3.6 由于神经干在前几项实验中受到损伤导致用甘油高渗任试液处理肌肉后的肌肉动作电位和收缩的实验失败，未记录到有动作电位无腓肠肌收缩的时间。
【讨论】
4.1锌铜弓刺激神经和肌肉时，腓肠肌的收缩反应机理：通常将金属浸入电解质溶液中，如Zn便溶解而成Zn离子。而在Zn的里面则形成负离子。Cu在溶液中则相反，金属与溶液之间便产生了电位差——电极电位。如果将Zn和Cu一端接触，则在接触部位电流由Cu向Zn方向流动；而在溶液中则相反，由Zn向Cu流动。当锌铜弓接触组织时（注意：表面必须湿润），电流便沿Zn→可兴奋组织→Cu方向流动，而产生流动作用。这样，锌铜弓好像一个电池，Zn如同其阳极，Cu好像阴极而发挥作用。神经或肌肉的电刺激阈值非常小，所以仅用锌铜弓接触，即可构成刺激，以便检验组织的机能活性。
4.2刺激强度、刺激频率对肌肉收缩的影响及机制：
（1）刺激强度方面：由实验结果分析，观察图1、表1、表2可知刺激强度达到一定值时，腓肠肌产生收缩，刺激强度继续增加腓肠肌收缩也随之增强，当达到一定强度的时候肌肉收缩的强度便不再增强。这是由于骨骼肌收缩需要刺激强度达到一定的阈值，因为在神经肌肉接头处存在终板电位，而终板电位不是动作电位，只有刺激强度达到阈值是才能使得终板电位影响周围的肌肉组织，是肌肉组织产生去极化，进而产生收缩，后随着刺激强度的继续增加，会有较多的运动单位兴奋，肌肉收缩幅度、产生的张力耶不断增加，此时的刺激均称为阈上刺激。但当刺激强度增大到某一临界值时，所有的运动单位都被兴奋，引起肌肉最大幅度的收缩，产生的张力也最大，此时再增加刺激强度，不会再引起反应的继续增加。
（2）刺激频率方面：由实验结果分析，观察图2，表3、表4分析当刺激强度为最大刺激时，刺激频率由1Hz开始增加，以最大刺激电压的连续脉冲刺激坐骨神经干，剌激波的间隔时间大于单收缩的持续时间，肌肉收缩波呈现与刺激频率相同的单收缩波；刺激波间隔小于单收缩的持续时间肌肉收缩波发生融合(总和），融合发生于舒张期，出现不完全强直收缩；融合发生于收缩期，出现完全强直收缩波，但神经干动作电位不发生融合。
随着刺激波间隔的减小，腓肠肌收缩张力也逐渐增大，强直收缩产生的张力显著大于单收缩。肌肉单收缩时，胞浆内Ca2+浓度升高的持续时间太短，被激活的收缩蛋白尚未产生最大张力时，胞浆Ca2+浓度即已开始下降，单收缩产生的张力不能达到胞浆内Ca2+浓度相应的最大张力。强直收缩时，肌细胞连续兴奋，引起终池中的钙连续释放胞浆内的Ca2+浓度持续升高，使肌肉未完全舒张或未舒张时进一步收缩，使收缩张力逐渐增大，完全强直收缩时收缩张力达到了一个稳定的最大值。
4.3神经干动作电位、骨骼肌动作电位、肌肉收缩曲线三者之间的关系：当仪器给与一个最大刺激时，RM6240记录出神经干动作电位、骨骼肌动作电位、肌肉收缩曲线，有图形分析，最先产生出神经干的动作电位图像，随后出现骨骼肌的动作电位图像，最后出现的是日肉收缩张力曲线。这是由于神经肌肉接头处事化学突触，是由化学物质乙酰胆碱传递兴奋信号，化学传到是有延时性的，所以最先产生的是神经干的动作电位，然后是腓肠肌的动作电位，动作电位肌细胞T管传入肌浆网使得钙离子释放引起肌肉收缩，这一过程也是有延时性，所以最后产生的是骨骼肌收缩张力曲线。
4.4改变刺激波间隔神经干动作电位、骨骼肌动作电位、肌肉收缩曲线的变化及机制：刺激波波间隔越大，肌肉产生的肌肉收缩张力越大。刺激波间隔小于0.5ms时，神经干的第2个动作电位消失，肌肉的收缩显著降低。刺激波间隔小于神经干不应期，第二个刺激落在神经干的绝对不应期内，神经纤维不发生兴奋。
4.5甘油高渗任试液处理肌肉后神经干动作电位、骨骼肌动作电位、肌肉收缩曲线的变化及机制：甘油高渗任试液处理肌肉后，随着时间的延长，记录曲线由有动作电位与腓肠肌收缩，腓肠肌收缩的强度逐渐减弱，直到出现有动作电位，无腓肠肌收缩。其原理甘油高渗任试液处理肌肉后甘油可选择性地破坏肌细胞的T管细胞而阻断兴奋-收缩偶联过程。甘油选择性地破坏肌细胞的T管结构后，阻断兴奋-收缩偶联过程，应只能记录到肌电，而不发生肌肉收缩反应。
4.6影响实验的主要干扰因素以及改进方法：在实验过程作标本的制作是非常关键的，在分离坐骨神经时一定要注意不能用剪刀等金属仪器触碰神经干，在剪下腓肠肌是要注意肌膜的完整，而且在实验过程中要不时地用任试液湿润标本，以防标本干燥，丧失正常生理活性。在做刺激强度与收缩强度关系时，刺激的强度不宜太大，否则会损伤神经，而且肌肉收缩后应该让肌肉休息一定时间再做下一次刺激，特别是高频连续刺激时。
【参考文献】
陈季强 基础医学导论 科学出版社 北京 2004.8第一版P47~51
陈季强 基础医学各论（上）科学出版社 北京 2004.8第一版P85~93
姚泰 生理学 人民卫生出版社 北京 2010.12第二版P50~60
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