自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座.pptx

广东药学院广东药学院药理系药理系自由基损伤学说及抗氧化剂自由基损伤学说及抗氧化剂周四桂周四桂1自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第1页 铁器在空气中暴露日久会生器在空气中暴露日久会生锈，雪白，雪白银器也会因器也会因为氧化氧化变黑。人机体与金属一黑。人机体与金属一样也会受到氧化而造成也会受到氧化而造成“生生锈”，罪魁，罪魁就是自由基。就是自由基。2自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第2页 1956 年英国分子生物学家年英国分子生物学家Harman 首次提出首次提出：“氧化氧化应激决定寿命激决定寿命”，即自由基衰老学，即自由基衰老学说，认为衰老是自由基引衰老是自由基引发组织随机毒害随机毒害结果。果。Harman,D.J.Gerontol.1956;11:298-300 氧化氧化应激是因激是因为氧自由基氧自由基过量生成和量生成和(或或)细胞内抗氧化防御系胞内抗氧化防御系统受受损,造成氧自由基造成氧自由基及其相关代及其相关代谢产物物过量聚集量聚集,从而从而对细胞胞产生各种毒性作用病理状生各种毒性作用病理状态。3自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第3页生成生成增加增加，消除，消除降低降低Physiol Rev.;82:4795.4自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第4页Free Radical Biology&Medicine (IF=5.423)Free Radical Res (IF=2.878)Antioxid Redox Signal (IF=8.456)Redox Report (IF=1.732)Journals of impact factor5自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第5页Impact Factor DistributionsIF10.0=102 journals(1.6%)EliteIF5.0=228 journals(3.6%)ExcellentIF3.0=597 journals(9.3%)Very GoodIF2.0=869 journals(13.5%)GoodIF1.0=2,020 journals(31.5%)FairIF1.0=2,601 journals(40.5%)PoorFrom a total of 6,417 SCI indexed journals as of March,6自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第6页自由基概念自由基概念7自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第7页自由基自由基（Free radicals）是指外层电子轨道带有一个或多个是指外层电子轨道带有一个或多个未成未成对电子对电子分子、原子、离子或者基团。分子、原子、离子或者基团。8自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第8页活性氧活性氧（ROS）是指分子氧在还原过程中一系列中间产是指分子氧在还原过程中一系列中间产物。物。活性氧包含活性氧包含以自由基形式存在以自由基形式存在和和不以自不以自由基形式存在由基形式存在含有高活性中间产物。含有高活性中间产物。O2-H2O2 OHSOD Cat 活性氧自由基活性氧自由基活性氧自由基活性氧自由基GPX9自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第9页常见自由基常见自由基理化性质理化性质10自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第10页常见自由基常见自由基活性氧活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）活性氮活性氮（Reactive Nitrogen Species，RNS）以碳、氧、氮或硫原子为中心自由基以碳、氧、氮或硫原子为中心自由基 11自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第11页 活活 性性 氧氧（ROS）O2H2O2 OHSOD Cat NO.+O2-ONOO-活活 性性 氮（氮（RNS）过氧亚硝基阴离子过氧亚硝基阴离子12自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第12页超氧阴离子超氧阴离子(O2-)化学性质化学性质：O2-在细胞内可直接造成在细胞内可直接造成DNA损伤，损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要经过衍生产酸激酶失活，其细胞毒性作用主要经过衍生产生生H2O2和和OH。去除去除：细胞内有：细胞内有SOD起去除作用起去除作用。13自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第13页过氧化氢过氧化氢(H2O2)化学性质化学性质：H2O2性质较稳定，半衰期最长，性质较稳定，半衰期最长，能够穿透大部分细胞膜，因而能够发挥主要信能够穿透大部分细胞膜，因而能够发挥主要信使功效，但这一特征也增加了其细胞毒作用。使功效，但这一特征也增加了其细胞毒作用。去除去除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。为水和氧气。“长期有效长期有效”“”“稳定稳定”14自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第14页羟自由基羟自由基(OH)化学性质化学性质：OH是已知活性是已知活性最强氧化剂最强氧化剂，化学，化学性质极为活泼，几乎能够与全部细胞成份发性质极为活泼，几乎能够与全部细胞成份发生反应，对机体危害极大。不过因为其作用生反应，对机体危害极大。不过因为其作用范围小，仅能与它邻近分子反应。范围小，仅能与它邻近分子反应。去除去除：主要经过抗坏血酸、：主要经过抗坏血酸、GSH（或其它硫（或其它硫醇）、褪黑色素、醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞等活性物质及细胞色素色素P450体系降解和去除。体系降解和去除。“寿命短寿命短”“”“稳定差稳定差”15自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第15页过氧亚硝基过氧亚硝基阴离子（阴离子（ONOO-）化学性质化学性质：ONOO-作为一个强氧化剂，能作为一个强氧化剂，能够介导蛋白巯基和非蛋白巯基氧化，并可够介导蛋白巯基和非蛋白巯基氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，造成细胞损，造成细胞损伤和疾病发生或介导信号转导。伤和疾病发生或介导信号转导。降解降解：在碱性条件下，：在碱性条件下，ONOO-比较稳定。比较稳定。一旦质子化，马上分解产生类羟基和一旦质子化，马上分解产生类羟基和NO2自由基。自由基。16自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第16页17自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第17页机体对自由基防御机体对自由基防御18自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第18页19自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第19页氧化氧化应激与心血管疾病激与心血管疾病20自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第20页 在生理情况下活性氧可在生理情况下活性氧可维持在极低水平持在极低水平，参加，参加机体机体生生长发育育调控控，信号信号转导、诱导增殖与分增殖与分化化、诱导凋亡凋亡，调整运整运动等各种生理等各种生理过程，在程，在生物体内生物体内发挥着主要功效。着主要功效。生成生成增加增加，消除，消除降低降低机体损伤机体损伤 21自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第21页动脉粥样硬化动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见一个。是动脉硬化性血管病中最常见一个。动脉内膜积聚脂质外观呈黄色粥样。动脉内膜积聚脂质外观呈黄色粥样。引发管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。引发管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。22自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第22页23自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第23页氧化应激与动脉粥样硬化氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.;25:29-38.24自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第24页AT1 ReceptorAngIIThrombinPDGFTNF-NADPH Oxidase AcitvityO2.-NADPH氧化酶与动脉粥样硬化氧化酶与动脉粥样硬化AT1 Receptor AntagnoistLack of p47phox25自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第25页氧化应激与高血压氧化应激与高血压26自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第26页自由基信号转导路径自由基信号转导路径27自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第27页氧自由基参加信号转导通路氧自由基参加信号转导通路 EGF Receptor Protein Tyrosine Phosphatases Insulin Receptor Kinase Activity Cytoplasmic Protein Kinases MAPK Cascades Protein Kinase C Isoforms Cytosolic Ca2+Concentrations Transcription Factor 28自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第28页Role of ROS in EGF Receptor-Mediated Signalling29自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第29页MAPK信号级联反应StimulusGrowth factors,Mitogen,GPCRp38 MAPKStress,GPCR,Inflammatory cytokines,Growth factorsStress,Growth factors,Mitogen,GPCRMEKK1,4,MLK3,ASK1MEKK2,3,Tpl2MLK3,TAK,DLKRaf,Mos,Tpl2MKK3/6MEK1/2MKK4/7MEK5ERK1/2MAPKKKGrowth,Differentiation,DevelopmentInflammation,Apoptosis,Growth,DifferentiationGrowthDifferentiation,DevelopmentERK5/BMK1JNK1,2,3MAPKKMAPKBiological responses自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第30页自由基检测自由基检测31自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第31页化学发光法化学发光法检测原理：检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。放能量，产生化学发光。检测对象：检测对象：超氧阴离子、羟自由基、超氧阴离子、羟自由基、H2O2 和脂质过氧和脂质过氧化产生自由基都能够产生化学发光。化产生自由基都能够产生化学发光。优点：优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。灵敏、快速、操作简单、价格低廉。缺点：缺点：非特异性。另外，几乎全部氧化剂，如次氯酸、非特异性。另外，几乎全部氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都能够与发光增效剂反应，产生化学发光，高锰酸钾等都能够与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧检测。严重干扰活性氧检测。Fe2+也能够产生非常强化学发也能够产生非常强化学发光。光。32自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第32页二氢乙啶二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)检测原理原理：可自由透：可自由透过活活细胞膜胞膜进入入细胞内，并胞内，并被被细胞内超氧阴离子氧化，形成氧化乙胞内超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化；氧化乙乙啶可可掺入染色体入染色体DNA中，中，产生生红色色荧光光。用。用流式流式细胞胞仪或或荧光光显微微镜可直接可直接观察，是一个快察，是一个快速速简便便组织或或培养活培养活细胞胞中中ROS经典典检测方法。方法。33自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第33页Circulation.;117:1045-1054.Determination of ROS by DHE Staining34自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第34页检测原理：在碱性条件下，光泽精与检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴超氧阴离子离子等过氧化物作用形成激发态等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶甲基吖啶(N2methylacridan)。并发出。并发出450nm激发光，激发光，测量此激发光强度即可定量产生测量此激发光强度即可定量产生超氧阴离子超氧阴离子浓度。能够定量，但浓度。能够定量，但检测时间长检测时间长，并需要，并需要新新鲜鲜组织组织样本样本。Lucigenin(光泽精光泽精)-Enhanced Chemiluminescence35自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第35页Determination of ROS by Lucigenin-Enhanced Chemiluminescence36自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第36页检测原理原理：DCFH-DA本身没有本身没有荧光，能光，能够自由穿自由穿过细胞膜，胞膜，进入入细胞内后，能胞内后，能够被被细胞内胞内酯酶水解生成水解生成DCFH。而而DCFH不能通透不能通透细胞膜，从而使探胞膜，从而使探针很很轻易被易被装装载到到细胞内。胞内。细胞内胞内活性氧活性氧能能够氧化无氧化无荧光光DCFH生成有生成有荧光光DCF，检测DCF荧光就能光就能够得得到到细胞内活性氧水平。胞内活性氧水平。2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)37自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第37页Br J Pharmacol.;154(1):105-13.Determination of ROS by DCFH-DA Staining38自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第38页39自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第39页40自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第40页41自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第41页自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第42页影响自由基药品影响自由基药品43自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第43页影响自由基药品影响自由基药品1抗抗氧化氧化药品品2促促氧化氧化药品品“以毒攻毒以毒攻毒”44自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第44页抗氧化药品抗氧化药品 维生素生素类及内源性物及内源性物质，如，如维生素生素E、维生素生素C、维生素生素A、GSH等；等；活性氧防御活性氧防御酶类，如，如SOD、过氧化氧化氢酶、过氧化物氧化物酶、Co-Q类等；等化合物化合物，如，如SOD模模拟化合物、普化合物、普罗布考以及一些布考以及一些传统药品如硫酸品如硫酸锌、甘露醇、甘露醇、钙拮抗拮抗药、血管担心素、血管担心素转化化酶抑制抑制药、肼肽嗪、乙、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2受体激受体激动药及阻断及阻断药等；等；中中药及其有效成份及其有效成份，如，如银杏、丹参、云芝及其所含杏、丹参、云芝及其所含黄黄酮类、酚、酚类、多糖、多糖类等等.45自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第45页46自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第46页 化学性化学性直接直接产生自由基及活性氧；生自由基及活性氧；经过作用于机体防御机制作用于机体防御机制，促，促进机体内自由机体内自由基、活性氧基、活性氧产生。巨噬生。巨噬细胞、中性粒胞、中性粒细胞在胞在对侵入机体抗原侵入机体抗原经过吞噬作用而吞噬作用而进行消化分行消化分解同解同时，产生超氧化物、生超氧化物、过氧化物以破坏抗氧化物以破坏抗原。原。促氧化药品促氧化药品47自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第47页莫特沙芬莫特沙芬进入机体后可入机体后可选择性定位并在癌性定位并在癌细胞胞中蓄中蓄积，破坏，破坏细胞代胞代谢，产生生ROS并促使并促使细胞胞凋亡。凋亡。临床前研究床前研究显示莫特沙芬可加示莫特沙芬可加强放放疗及及几个几个惯用化用化疗药疗效。效。促氧化药品促氧化药品48自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第48页