生物大分子的制备2蛋白质酶的分离纯化市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件.ppt

1 生物大分子制备生物大分子制备2 蛋白质（酶）分离纯化蛋白质（酶）分离纯化第四章第四章 样品全息制备样品全息制备1/2031 生物大分子制备生物大分子制备1.1 概述概述1.2 生物大分子制备前处理生物大分子制备前处理1.3 生物大分子分离纯化生物大分子分离纯化1.4 样品保留样品保留2/2031.1 概述概述在生命科学高度发展今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功效研在生命科学高度发展今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功效研究是探求生命奥秘中心课题，而生物大分子结构与功效研究，必须首先处理生究是探求生命奥秘中心课题，而生物大分子结构与功效研究，必须首先处理生物大分子制备问题，物大分子制备问题，假如没有能够到达足够假如没有能够到达足够纯度生物大分子制备工作纯度生物大分子制备工作为前为前提提，结结构与功效研究就无从谈起构与功效研究就无从谈起。然而生物大分。然而生物大分子分离纯化与制备是一件十分细致而困难工作。子分离纯化与制备是一件十分细致而困难工作。3/203 生物材料生物材料组成组成极其极其复杂复杂，经常包含有数百种乃至几千种化合物。，经常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中许多生物大分子在生物材料中含量极微含量极微，分离纯化，分离纯化步骤繁步骤繁多多、流程长流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内环境时就极易失活，所以分离过程中许多生物大分子一旦离开了生物体内环境时就极易失活，所以分离过程中怎样怎样预防预防其其失活失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子制备几乎都是在溶液中进行，温度、生物大分子制备几乎都是在溶液中进行，温度、pH值、离子强度等值、离子强度等各各种参数种参数对溶液中各种组成对溶液中各种组成综合影响综合影响，极难准确预计和判断。，极难准确预计和判断。生物大分子中各种详细物质组成生物大分子中各种详细物质组成百分比不一样百分比不一样。与化学产品分离制备相比较，生物大分子制与化学产品分离制备相比较，生物大分子制备有以下主要特点：备有以下主要特点：4/203生物大分子制备通常可按以下步骤进行：生物大分子制备通常可按以下步骤进行：确定要制备生物大分子确定要制备生物大分子目标目标和和要求要求，是进行科研、开发还是要发觉新物质。，是进行科研、开发还是要发觉新物质。建立对应可靠分析建立对应可靠分析测定方法测定方法，这是制备生物大分子关键。，这是制备生物大分子关键。经过经过文件调研文件调研和和预备性试验预备性试验，掌握生物大分子目标产物物理化，掌握生物大分子目标产物物理化学性质。学性质。生物材料生物材料破碎破碎和和预处理预处理。分离纯化分离纯化方案方案选择和探索，这是最困难过程。选择和探索，这是最困难过程。生物大分子制备物均一性生物大分子制备物均一性（即纯度即纯度）判定判定，要求到达一维电泳一条带，二维电，要求到达一维电泳一条带，二维电泳一个点，或泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。和毛细管电泳都是一个峰。产物产物浓缩浓缩、干燥干燥和和保留保留。5/203要了解生物大分子物理、化学性质主要有：要了解生物大分子物理、化学性质主要有：在水和各种有机溶剂中溶解性。在水和各种有机溶剂中溶解性。在不一样温度、在不一样温度、pH值和各种缓冲液中生物值和各种缓冲液中生物大分子稳定性。大分子稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时稳定性。各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中行为、电情况、在电场中行为、离心沉降时表现、离心沉降时表现、在各种凝胶、树脂等填料中分配系数。在各种凝胶、树脂等填料中分配系数。其它化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶稳其它化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶稳定性和对各种化学试剂稳定性。定性和对各种化学试剂稳定性。对其它生物分子特殊亲和力。对其它生物分子特殊亲和力。7/203生物大分子分离纯化方法各种多样，主要是生物大分子分离纯化方法各种多样，主要是利用它们之间特异性差异，如分子大小、形状、利用它们之间特异性差异，如分子大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它分子亲和性等。分子亲和性等。各种方法基本原理能够归纳为两个方面：各种方法基本原理能够归纳为两个方面：利用混合物中几个组分分配系数差异，把它们利用混合物中几个组分分配系数差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉有机溶剂沉淀、层析和结晶等；淀、层析和结晶等；将混合物置于某一物相将混合物置于某一物相（大多数是液相大多数是液相）中中，经过物理力场作用经过物理力场作用，使各组分分配于不一样区使各组分分配于不一样区域，从而到达分离目标域，从而到达分离目标，如电泳如电泳、离心离心、超滤超滤等。等。当前纯化蛋白质等生物大分子关键技术是当前纯化蛋白质等生物大分子关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。电泳、层析和高速与超速离心。8/2031.2 生物大分子制备前处理生物大分子制备前处理1.2.1 生物材料选择生物材料选择制备生物大分子，首先要选择适当生物材料。材料起源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。选择材料应含量高、起源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当溶剂中提取，假如所要求成份在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保留。动物材料则需深度冷冻保留。9/2031.2.2 细胞破碎细胞破碎不不一一样样生生物物体体或或同同一一生生物物体体不不一一样样部部位位组组织织，其其细细胞胞破破碎碎难难易易不不一一，使使用用方方法法也也不不相相同同，如如动动物物脏脏器器细细胞胞膜膜较较脆脆弱弱，轻轻易易破破碎碎，植植物物和和微微生生物物因因为为含含有有较较坚坚固固纤纤维维素素、半半纤纤维维素素组组成成细细胞胞壁壁，要要采采取取专门细胞破碎方法。专门细胞破碎方法。(1)机械法：机械法：研磨：研磨：将剪碎动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少许石英砂研磨成匀浆。组织捣碎器：组织捣碎器：这是一个较猛烈细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打坏，然后再用100000r/min内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织细胞打坏。10/203(2)物理法：物理法：重复冻融法：重复冻融法：将待破碎细胞冷至-15到-20，然后放于室温（或40）快速融化，如此重复冻融屡次，因为细胞内形成冰粒使剩下胞液盐浓度增高而引发细胞溶胀破碎。超声波处理法：超声波处理法：此法是借助超声波振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。压榨法：压榨法：这是一个温和、彻底破碎细胞方法。在1000105 Pa105 Pa 高压下使细胞悬液经过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。冷热交替法：冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，马上放入冰浴中使之冷却，如此重复屡次，绝大部分细胞能够被破碎。11/203(3)化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：自溶法：自溶法：将新鲜生物材料存放于一定 pH 和适当温度下，细胞结构在本身所含有各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。溶胀法：溶胀法：细胞膜为天然半透膜，在低渗溶液和低浓度稀盐溶液中，因为存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。酶解法：酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，能够专一性地将细胞壁分解。有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也能够与研磨法联合使用。12/2031.2.3 生物大分子提取生物大分子提取“提提取取”是是在在分分离离纯纯化化之之前前将将经经过过预预处处理理或或破破碎碎细细胞胞置置于于溶溶剂剂中中，使使被被分分离离生生物物大大分分子子充充分分地地释释放放到到溶溶剂剂中中，并并尽尽可可能能保持原来天然状态不丢失生物活性过程。保持原来天然状态不丢失生物活性过程。通常：通常：极性物质易溶于极性溶剂极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大；远离等电点远离等电点pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。影响提取原因主要有：影响提取原因主要有：目标产物在提取溶剂中溶解度大小；目标产物在提取溶剂中溶解度大小；由固相扩散到液相难易；由固相扩散到液相难易；溶剂溶剂pH值和提取时间等。值和提取时间等。注意：提取时所选择条件应有利于目标产物溶解度增加和注意：提取时所选择条件应有利于目标产物溶解度增加和保持其生物活性。保持其生物活性。13/203因因为为生生物物体体组组成成成成份份是是如如此此复复杂杂，数数千千种种乃乃至至上上万万种种生生物物分分子子又又处处于于同同一一体体系系中中，所所以以不不可可能能有有一一个个适适合合于于各各类类分分子子固固定定分分离离程程序序，但但多多数数分分离离工工作作关关键键部分基本伎俩是相同。部分基本伎俩是相同。为为了了防防止止盲盲目目性性，节节约约试试验验探探索索时时间间，要要认认真真参参考和借鉴前人经验，少走弯路。考和借鉴前人经验，少走弯路。惯惯用用分分离离纯纯化化方方法法和和技技术术有有：沉沉淀淀法法（包包含含：盐盐析析、有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀、选选择择性性沉沉淀淀等等）、离离心心、吸吸附附层层析析、凝凝胶胶过过滤滤层层析析、离离子子交交换换层层析析、亲亲和和层层析析、快快速速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。1.3 生物大分子分离纯化生物大分子分离纯化17/203沉沉淀淀是是溶溶液液中中溶溶质质由由液液相相变变成成固固相相而而析析出出过过程程。沉沉淀淀法法（即即溶溶解解度度法法）操操作作简简便便，成成本本低低廉廉，不不但但适适合合用用于于试试验验室室中中，也也可可用用于于一一些些生生产产目目标标制制备备过过程程，是是分分离离纯纯化化生生物物大大分分子子，尤尤其其是是制制备备蛋蛋白白质质和和酶酶时时最最惯惯用用方方法法。经经过过沉沉淀淀，将将目目标标生生物物大大分分子子转转入入固固相相沉沉淀或留在液相，而与杂质得到初步分离。淀或留在液相，而与杂质得到初步分离。沉淀法沉淀法 基本原理是依据不一样物质在溶剂中溶基本原理是依据不一样物质在溶剂中溶解度不一样而到达分离目标，不一样溶解度产生是因解度不一样而到达分离目标，不一样溶解度产生是因为溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力差异而为溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力差异而引发，溶解度大小与溶质和溶剂化学性质及结构相关，引发，溶解度大小与溶质和溶剂化学性质及结构相关，溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶液溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶液pH值值、离子强度和极性都会使溶质溶解度产生显著改变。离子强度和极性都会使溶质溶解度产生显著改变。1.3.1 沉淀法沉淀法18/203在生物大分子制备过程中，除盐、除少许有在生物大分子制备过程中，除盐、除少许有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术用到透析技术。透析只需要使用专用半透膜即可完成。保留透析只需要使用专用半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出样品液称为在透析袋内未透析出样品液称为“保留液保留液”，袋，袋（膜膜）外溶液称为外溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”。截留分。截留分子量子量(MwCO)通常为通常为10KD左右。左右。用用 1 BaCl2 检验检验(NH4)2SO4，用，用1AgNO3 检验检验NaCl、KCl等。等。1.3.2 透析透析34/203超超出出滤滤即即超超滤滤，是是一一个个加加压压膜膜分分离离技技术术，即即在在一一定定压压力力下下，使使小小分分子子溶溶质质和和溶溶剂剂穿穿过过一一定定孔孔径径特特制制薄薄膜膜，而而使使大大分分子子溶溶质质不不能能透透过过，留留在在膜膜一一边边，从从而而使使大大分分子子物物质质得得到到了了部部分分纯纯化。化。超超滤滤可可广广泛泛用用于于含含有有各各种种小小分分子子溶溶质质各各种种生生物物大大分分子子（如如蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸酸等等）浓浓缩缩、分离和纯化。分离和纯化。1.3.3 超滤超滤35/203超滤工作原理示意图超滤工作原理示意图受压生物大分子和小分子溶液浓缩生物大分子小分子溶液36/203冰冻干燥机是生化与分子生物学试验室必备仪器之一，因冰冻干燥机是生化与分子生物学试验室必备仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后最终产品多数是水溶液，要从水为大多数生物大分子分离纯化后最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好方法就是冰冻干燥，因为生物大分子溶液中得到固体产品，最好方法就是冰冻干燥，因为生物大分子轻易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩方法。轻易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩方法。冰冻干燥是先将生物大分子水冰冻干燥是先将生物大分子水溶液冰冻，然后在低温和高真空下溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥原理。冰冻干燥原理可用溶剂三相点相图来说明，见下列图：可用溶剂三相点相图来说明，见下列图：1.3.4 冰冻干燥冰冻干燥40/203三相点相图三相点相图41/2031.3.5 分离纯化方法选择分离纯化方法选择制备生物大分子方法能够粗略地分类以下：制备生物大分子方法能够粗略地分类以下：以以分子大小和形态差异分子大小和形态差异为依据方法：差速为依据方法：差速离心离心、区带离心区带离心、超滤超滤、透析和凝胶过滤等透析和凝胶过滤等。以以溶解度差异溶解度差异为依据方法：盐析、萃取、为依据方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。分配层析、选择性沉淀和结晶等。以以电荷差异电荷差异为依据方法：电泳、电渗析、为依据方法：电泳、电渗析、等电点沉淀等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等吸附层析和离子交换层析等。以以生物学功效专一性生物学功效专一性为依据方法：亲和层为依据方法：亲和层析等。析等。46/2031.4 样品保留样品保留生物大分子制成品正确保留极为主要，一生物大分子制成品正确保留极为主要，一旦保留不妥，辛辛劳苦制成样品失活、变性、旦保留不妥，辛辛劳苦制成样品失活、变性、变质，使前面全部制备工作化为乌有，损失惨变质，使前面全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。重，全功尽弃。空气空气：空气空气影响主要是潮解、微生物：空气空气影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。污染和自动氧化。温度温度：每种生物大分子都有其稳定温度范：每种生物大分子都有其稳定温度范围，温度升高围，温度升高10，氧化反应约加紧数倍，氧化反应约加紧数倍，酶促反应增加酶促反应增加13倍。倍。影响生物大分子样品保留主要原因有：影响生物大分子样品保留主要原因有：51/203 水份水份：样品本身所带水份和由空气中吸收水份。：样品本身所带水份和由空气中吸收水份。水能够参加水解、酶解、水合和加合。加速氧水能够参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。化、聚合、离解和霉变。光线光线：一些生物大分子能够吸收一定波长光，：一些生物大分子能够吸收一定波长光，使分子活化不利于样品保留，尤其日光中紫外使分子活化不利于样品保留，尤其日光中紫外线能量大，影响最大，样品受光催化反应有变线能量大，影响最大，样品受光催化反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。所以样品色、氧化和分解等，通称光化作用。所以样品通常都要避光保留。通常都要避光保留。样品样品pH：保留液态样品时注意其稳定：保留液态样品时注意其稳定pH范围，范围，正确选择保留液态样品缓冲剂种类和浓度十分正确选择保留液态样品缓冲剂种类和浓度十分主要。主要。时间时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不一样样品有其不一样使用期，所以，保留样不一样样品有其不一样使用期，所以，保留样品必须写明日期，定时检验和处理。品必须写明日期，定时检验和处理。52/2032 蛋白质（酶）蛋白质（酶）分离纯化分离纯化2.1 酶活性测定酶活性测定2.2 酶溶液制备酶溶液制备2.3 酶分离纯化基本过程酶分离纯化基本过程2.4 依据分子大小轻重建立分离纯化方法依据分子大小轻重建立分离纯化方法2.5 调整溶解度分离方法调整溶解度分离方法2.6 按电荷正负性设计分离方法按电荷正负性设计分离方法2.7 依据亲和作用建立纯化方法依据亲和作用建立纯化方法2.8 依据稳定性差异建立分离纯化方法依据稳定性差异建立分离纯化方法2.9 蛋白质（酶）高效液相色谱分离分析法蛋白质（酶）高效液相色谱分离分析法55/203酶分离提纯包含三个基本步骤：酶分离提纯包含三个基本步骤：抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。制剂：即将酶制成各种剂型。(1)要注意预防酶变性失活要注意预防酶变性失活.(2)酶分离纯化目标是将酶以外全部杂质尽可能除去，所以酶分离纯化目标是将酶以外全部杂质尽可能除去，所以，在在不破坏所需酶条件下不破坏所需酶条件下，可使用各种可使用各种“激烈激烈”伎俩伎俩。另外，因为酶另外，因为酶和它底物、抑制剂等含有亲和性，当这些物质存在时酶理和它底物、抑制剂等含有亲和性，当这些物质存在时酶理化性质和稳定性发生了一定改变，从而提供了更多条件和方化性质和稳定性发生了一定改变，从而提供了更多条件和方法可供采取。法可供采取。(3)酶含有催化活性。检测酶活性，跟踪酶来龙去脉，为选择适酶含有催化活性。检测酶活性，跟踪酶来龙去脉，为选择适当方法和条件提供当方法和条件提供 直接依据直接依据。在工作过程中在工作过程中，从原料开始每从原料开始每步都必须检测酶活性一个好方法和办法会使酶纯度提升倍步都必须检测酶活性一个好方法和办法会使酶纯度提升倍数大，活力回收高，同时重复性好。数大，活力回收高，同时重复性好。依据酶本身特征，在分离纯化工作中必须注意以下问题依据酶本身特征，在分离纯化工作中必须注意以下问题:56/2032.1 酶活性测定酶活性测定酶活力酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，指也称酶活性，指酶催化一定化学反应能力。酶活性是研究酶特酶催化一定化学反应能力。酶活性是研究酶特征、分离纯化以及酶制剂生产和应用时一项不征、分离纯化以及酶制剂生产和应用时一项不可缺乏指标。酶活力是用在一定条件下，它所可缺乏指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应反应初速度来表示。酶反应速度催化某一反应反应初速度来表示。酶反应速度（指初速度指初速度）可用单位时间内单位体积中底物可用单位时间内单位体积中底物降低许或产物增加量来表示，其单位为降低许或产物增加量来表示，其单位为mol/s。2.1.1 酶活力单位酶活力单位2.1.2 摩尔催化活性摩尔催化活性/分子活性和转化率分子活性和转化率（催化催化中心活力中心活力）57/203摩尔催化活性摩尔催化活性(Molar Catalytic Activity)表示在单位时间内，酶表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换分子数目。分子中每个活性中心转换分子数目。依据米氏方程：依据米氏方程：Vmax=K0E K0=Vmax/EK0即为转换率即为转换率(也用也用Kcat表示表示)，假如每一个酶分子只有一个催假如每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，假如一个酶分化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，假如一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。每种酶转换率不一样，下表列出了几个酶转换率：每种酶转换率不一样，下表列出了几个酶转换率：酶酶转换率转换率(1/s)酶酶转换率转换率(1/s)碳酸酐酶碳酸酐酶 600,000凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶 100乙酰胆碱脂酶乙酰胆碱脂酶 25,000DNA聚合酶聚合酶 5青霉素酶青霉素酶 2,000Trp合成酶合成酶 2乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 1,000溶菌酶溶菌酶 0.558/2032.1.3 比活力比活力 比活力比活力(性性)(Specific Activity)是酶纯度量度，指单位重量蛋是酶纯度量度，指单位重量蛋白质中所含有酶活力单位数，普通用白质中所含有酶活力单位数，普通用 IU/mg 蛋白质来表示。一蛋白质来表示。一 般来说，酶比活力越高，酶越纯。般来说，酶比活力越高，酶越纯。2.1.4 酶活力测定方法酶活力测定方法酶活力与底物浓度、酶浓度、酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂、温度、激活剂、抑制剂浓度以及缓冲液种类和浓度都亲密相关。酶活性测定可用终止浓度以及缓冲液种类和浓度都亲密相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。反应法或连续反应法。2.1.4.1 终止反应法终止反应法(Stopped Method)终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停顿，取出反应终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停顿，取出反应物或产物，给予分离，再确定反应物消耗量，或产物形成量，物或产物，给予分离，再确定反应物消耗量，或产物形成量，算出酶活性。算出酶活性。使酶停顿作用惯用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也使酶停顿作用惯用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用可用 SDS 使酶失活或加热使酶变性等。使酶失活或加热使酶变性等。产物测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。产物测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。59/203 酶法酶法 酶法是用其它纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分酶法是用其它纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定化合物。通常采取偶联法，比如光光谱仪或荧光光谱仪测定化合物。通常采取偶联法，比如葡萄糖氧化酶催化以下反应：葡萄糖氧化酶催化以下反应：葡萄糖葡萄糖+O2 葡萄糖内脂葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生以下反应化物酶和木酚，使发生以下反应:60/203因为因为4-甲氧联酚在甲氧联酚在 435nm 波优点有光吸收峰，所以、波优点有光吸收峰，所以、只要测定只要测定 A435，就可知，就可知 4-甲氧联酚量，可得甲氧联酚量，可得H2O2量，从而量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶过氧化物酶)必须必须过量，不然，将出现下列图情况。普通偶联酶量最少也应过量，不然，将出现下列图情况。普通偶联酶量最少也应在在 5 倍以上。倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度影响偶联法中偶联酶对反应速度影响61/203再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖葡萄糖 ATP 葡萄糖葡萄糖-6-P其偶联其偶联-指示剂为葡萄糖指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖-6-P+NADP+6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定这时即可测定 340nm 处光吸收增加得到己糖激酶（或葡萄糖处光吸收增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）活性。激酶）活性。酶偶联测定法可用分开也可用连续反应系统进行。酶偶联测定法可用分开也可用连续反应系统进行。62/203(2)化学法化学法化学法化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出法测出NH3和和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。方法测出酶活性。化学分析法化学分析法优点优点是是：不需要特殊仪器不需要特殊仪器，普通有恒温水浴普通有恒温水浴、滴滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数酶，都可依据底物及产物化学性质，设计详细测定方法，多数酶，都可依据底物及产物化学性质，设计详细测定方法，应用范围较广。应用范围较广。缺点缺点是：因为测定结果是依据间隔一定时间取样所得，取是：因为测定结果是依据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程样过多，则总工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程全貌，而且在实际操作过程中，取样及停顿时间不轻易准确控全貌，而且在实际操作过程中，取样及停顿时间不轻易准确控制，所以对于反应较快酶反应，结果不够准确。制，所以对于反应较快酶反应，结果不够准确。当前，市场上已经有酶反应仪商品，可将不一样时间取样、当前，市场上已经有酶反应仪商品，可将不一样时间取样、停顿反应、加入反应试剂、保温、比色或其它测定方法编排成停顿反应、加入反应试剂、保温、比色或其它测定方法编排成程序，自动依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学程序，自动依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新评价。分析法必须作出新评价。63/203 放射性化学法放射性化学法是由含有放射性产物上测出全放射量，再算出产物量，是由含有放射性产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶活性。从而计算出酶活性。优点优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，尤其适合用于低浓度酶和底物测定。内酶活性测定，尤其适合用于低浓度酶和底物测定。缺点缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，而且同位素对人体有损伤作用。另外，辐射淬灭会引跟踪，而且同位素对人体有损伤作用。另外，辐射淬灭会引发测定误差，如发测定误差，如 3H 发射射线很弱，甚至会被纸吸收。发射射线很弱，甚至会被纸吸收。64/203 2.1.4.2 连续反应法连续反应法(Continuous Method)连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中光谱吸连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等改变用仪器跟踪检测收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等改变用仪器跟踪检测反应进行过程，统计结果，算出酶活性。连续法使用方便，反应进行过程，统计结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可屡次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不一个样品可屡次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。能用该法测定。普通连续法：包含光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光普通连续法：包含光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适合用于一些反应速度较快酶，自动统度和荧光法。该法适合用于一些反应速度较快酶，自动统计仪普遍使用使该法更轻易被人们所接收。计仪普遍使用使该法更轻易被人们所接收。65/203几个连续法例子几个连续法例子 酶酶 反应反应 观察方法乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸乳酸+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸乳酸+NAD+340nm波优点有NADH形成340nm波优点有NADH降低糖苷酶糖苷酶(Glycosidase)Methylumbelvifery+glucoside 糖糖+Methylumbeviferone甲基伞型酮甲基伞型酮(Methylumbelviferone)发出发出荧光荧光内纤维素酶内纤维素酶纤维素纤维素 低聚葡萄糖低聚葡萄糖黏度下降黏度下降己糖激酶己糖激酶葡萄糖葡萄糖+mgATP 6-P-葡萄糖葡萄糖+ADP+H+pH降低，用降低，用pH计计非专一性磷脂酶非专一性磷脂酶405nm波长有硝基苯酚生成波长有硝基苯酚生成66/203 偶联连续法偶联连续法是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测化合物。连续偶联反应必或间接转变成可用光谱吸收仪检测化合物。连续偶联反应必须在酶反应相同条件须在酶反应相同条件(pH、温度等、温度等)下进行，且加入指示酶下进行，且加入指示酶以及其它各种物质不能干扰原来酶活力。以及其它各种物质不能干扰原来酶活力。如醛缩酶如醛缩酶(Aldolase)催化催化1,6-二磷酸果糖生成二磷酸果糖生成3-P-甘油醛甘油醛和磷酸二羟丙酮反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙和磷酸二羟丙酮反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙糖异构酶糖异构酶(Triose Phosphate Isomerase)作偶联酶作偶联酶(Coupling Enzyme)、甘油、甘油-1-P-脱氢酶脱氢酶(Glycerol-1-Phosphate Dehydrogenase)作指示酶，依据作指示酶，依据 NADH 变成变成 NAD+光谱改光谱改变来算出醛缩酶活性。变来算出醛缩酶活性。以下列图：以下列图：67/203醛缩酶以醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶偶联测定酶活性法甘油脱氢酶为指示酶偶联测定酶活性法68/2032.1.4.3 酶活力测定中应注意几个问题酶活力测定中应注意几个问题酶反应和普通化学反应一样，都是在一定条件下进行，但酶酶反应和普通化学反应一样，都是在一定条件下进行，但酶反应要比普通化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这么反应要比普通化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这么一个决定性原因。所以，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学一个决定性原因。所以，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法操作要求外，又有它方法操作要求外，又有它些特点。些特点。首先，测定酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物首先，测定酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度确实定普通指：底物消耗量在浓度成正比。初速度确实定普通指：底物消耗量在 5以内，或以内，或产物形成量占总产物量产物形成量占总产物量15以下时速度。以下时速度。其次其次，底物浓度底物浓度、辅因子浓度必须大于酶浓度辅因子浓度必须大于酶浓度(即过饱和即过饱和)，不不然，底物浓度本身是一个限制因子，此时反应速度是两个原因复然，底物浓度本身是一个限制因子，此时反应速度是两个原因复变函数。变函数。第三，反应必须在酶最适条件（如最适温度、第三，反应必须在酶最适条件（如最适温度、pH 和离子强度和离子强度等）下进行等）下进行。另外另外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶激活剂测定酶活性所用试剂中不应含有酶激活剂、抑抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度对酶浓度(E)作作图，应得一条经过原点直线，即图，应得一条经过原点直线，即 v 为为(E)线性函数。线性函数。69/203初速度确实定是在底物浓度初速度确实定是在底物浓度S足够条件下，经过足够条件下，经过E改变来确定，以下列图。由图可见，当分别采取不改变来确定，以下列图。由图可见，当分别采取不一样酶浓度时，测得反应量对时间改变。一样酶浓度时，测得反应量对时间改变。求得几个适当初间反应速度（反应量求得几个适当初间反应速度（反应量/反应时间）。反应时间）。再用反应速度对酶量作图再用反应速度对酶量作图。由图可见，其中，。由图可见，其中，5min时时测得数据可用于求出初速度，若以测得数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，以上数据时，测得酶活性偏低。测得酶活性偏低。70/20371/2032.1.4.4 酶活性测定实例酶活性测定实例这是一类专门去除体内超氧阴离子酶，催化反应为这是一类专门去除体内超氧阴离子酶，催化反应为:O2+O2+2H+H2O2+O2因为因为 O2 在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。当前已经有依据当前已经有依据 O2物理性质测定物理性质测定 O2歧化量，从而直接测定歧化量，从而直接测定 SOD 活力方法活力方法。如电子顺磁共振波谱法如电子顺磁共振波谱法(ESR)、核磁共振法核磁共振法(NMR)、紫外分光光度法等紫外分光光度法等。这里只介绍以邻苯三酚法测定这里只介绍以邻苯三酚法测定酶活力为例化学法。酶活力为例化学法。邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生超氧阴离邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生超氧阴离子自由基可经过自氧化速率来表示。加入子自由基可经过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定试验条单位定义为：一定试验条件下（见操作），抑制率到达件下（见操作），抑制率到达50%时时SOD浓度为浓度为 1 个酶单位。个酶单位。(1)超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活力测定活力测定72/203单位体积活力单位体积活力(u/ml)=(0.07-样品速率样品速率)/0.07100%)/50%反应液总体积反应液总体积(反应液稀释倍数反应液稀释倍数/样液体积样液体积)总活力总活力=单位体积活力单位体积活力(u/ml)原液总体积原液总体积操作：在试管中加入操作：在试管中加入pH8.250mmol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液4.5ml，于，于25保温保温20min，然后加入预热，然后加入预热45mmol/L连苯三酚溶液连苯三酚溶液（对照管用（对照管用10mol/L HCl代替）代替）10l，快速摇匀倒入，快速摇匀倒入1cm比色杯，每隔比色杯，每隔 30s 在在 325nm 处测一次光吸收值，即可测处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚自氧化速率，普通要求自氧化速率控制在定出连苯三酚自氧化速率，普通要求自氧化速率控制在 0.070 OD/min。测酶或粗酶液活力时测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不一方法同测自氧化速率相同，所不一样仅是在加入缓冲液后再加入样仅是在加入缓冲液后再加入 10l 待测样品即可。酶活力计算待测样品即可。酶活力计算方法：方法：用这种方法测酶活力时，应注意因为连苯三酚和被测样用这种方法测酶活力时，应注意因为连苯三酚和被测样液加入量只有液加入量只有10l，在整个反应系统中可忽略不计，故在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按反应液总体积按4.5计算。计算。73/203(2)糖苷酶活力测定糖苷酶活力测定糖苷酶活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖糖苷酶活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶作用下，糖苷键断裂，产生等当量糖和对硝基苯酚，苷水解酶作用下，糖苷键断裂，产生等当量糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，从对硝基处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收标准曲线即可计算出糖苷水解酶活性。苯酚对光吸收标准曲线即可计算出糖苷水解酶活性。操作：试管中加入操作：试管中加入 5mmol/L 对硝基苯基糖苷对硝基苯基糖苷200ul，pH4.60.2mol/L 磷酸氢二钠和磷酸氢二钠和 0.1mol/L 柠檬酸配制缓柠檬酸配制缓冲液冲液200ul，37预保温预保温10min，再加入，再加入l待测样品并待测样品并用水补足到用水补足到100ul，37 反应反应15min，用用0.5mol/L Na2CO3 1ml终止反应终止反应(注意空白管用水代替对硝基苯注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品基糖苷和待测样品)，在，在 400nm 处测定处测定 A 值，酶单位值，酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放定义为在上述测定条件下每分钟释放1mol对硝基苯酚对硝基苯酚量为量为1 个单位酶，对照标准曲线，即可计算出酶活力。个单位酶，对照标准曲线，即可计算出酶活力。74/2032.2 酶溶液制备酶溶液制备酶溶液制备包含三个过程工作，材料预处理和破碎细胞、酶溶液制备包含三