病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探.pdf

第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3病程相关蛋白基因 GmPR1-6 的克隆及其在大豆 抵抗 SMV 侵染过程中的功能初探苏伟华，赵志华，齐梦楠，孙天杰，王冬梅，张 洁（华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室/河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000）摘要：为了探究大豆抵抗大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）侵染的分子调控机制，挖掘抗病相关基因，培育抗病新品种，本研究从清除 H2O2前后大豆响应 SMV 的转录组数据库中筛选得到 1 个差异表达的大豆病程相关蛋白基因 GmPR1-6（Glyma.15G062400.1），利用生物信息学分析并结合实时荧光定量（Real time quantitative,RT-qPCR）技术以及病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）等技术验证其在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能。结果表明，GmPR1-6 在非亲组合中转录水平的表达量显著高于亲和组合；GmPR1-6 基因沉默植株叶片接种 SMV 的部位胼胝质积累面积增大、胼胝质荧光强度减弱，病毒在胞间扩散的能力增强，说明 GmPR1-6 基因在大豆抵抗 SMV 侵染过程中发挥正调控作用。研究结果为进一步探究病程相关蛋白在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能提供试验依据。关 键 词：大豆花叶病毒；病程相关蛋白；病毒介导的基因沉默技术（VIGS）；功能分析中图分类号：S643.7 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ACloning and functional analysis of pathogenesis-related protein gene GmPR1-6 in soybean resistance to SMV SUWeihua,ZHAOZhihua,QIMengnan,SUNTianjie,WANGDongmei,ZHANGJie(State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/College of Life Sciences,Hebei Agriculture University,Baoding 071001,China)Abstract:It is crucial to investigate the molecular regulatory mechanisms of disease resistance to soybean mosaic virus SMV.It is of great importance for cultivation of disease-resistant soybean varieties to identify genes associated with disease resistance.In this study,a differentially expressed pathogenesis-related proteins gene,GmPR1-6(Glyma.15G062400.1),was screened out from the transcriptome database of soybean treated with H2O2 elimination 收稿日期：2023-03-20基金项目：河北省自然科学基金（C2020204132;C2020301020）；河北省现代农业产业技术体系创新团队建设大豆产业创新团队（326-0702-JSNTKSF）；河北省科技厅现代种业科技创新专项子课题（21326313D-1）.第一作者：苏伟华（1997），女，河北承德人，硕士研究生，主要从事植物逆境分子生物学研究.E-mail:通信作者：张 洁（1974），女，河北冀州人，博士，副教授，主要从事植物逆境分子生物学研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)04-0008-08DOI：10.13320/ki.jauh.2023.00539第 4 期in response to SMV infection.Analysis and verify the function of The function of GmPR1-6 in soybean resistance to SMV was analyzed using bioinformatics methods,real time quantitative PCR(RT-qPCR)and virus-mediated gene silencing(Virus induced gene silencing,VIGS).The results showed that GmPR1-6 expression was significantly higher in the incompatible combination compared to that in the compatible combination.The area of callose deposition around the SMV inoculation sites was significantly increased and the intensity of callose fluorescence was attenuated in the GmPR1-6 silenced plants after SMV inoculation.Moreover,the intercellular transport of SMV was also enhanced after silencing of the gene,indicating a potential role of GmPR1-6 in plant immunity.The results is a foundation for further exploring the function of pathogenesis related proteins in soybean in resistance to SMV.Keywords:Soybean mosaic virus;pathogenesis related protein;virus induced gene silencing;functional analysisPR10 具有较弱的核糖核苷酸酶活性，能够介导高粱对炭疽菌的抵抗能力10。此外，PR 蛋白在植物抗病毒过程中具有重要作用，如 PR2 的诱导表达能够增强辣椒对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的抗性11。PR1 蛋白作为植物系统获得性抗性（SAR）防御信号增强的标志，在植物防御反应中起关键作 用12。小麦中病程相关蛋白 TaPR1 与 TaTLP1 能够发生相互作用提高小麦对叶锈菌的抗性13；分泌型 StPR1 能够抑制病原菌的 Ser/Thr 蛋白激酶AMPK 复合体的磷酸化活性，从而抑制病原菌生长，提高马铃薯对致病疫霉菌的抗性14；棉花中GhMYB36 能够与 GhPR1 的启动结合，激活其表达，提高棉花对黄萎病的抗性15；在大豆中过表达 GmPR1L 能够增强大豆对灰斑病菌的抗性16，GmMAPK4-1 能够诱导 GmPR1-6 上调表达，参与大豆抵抗大豆胞囊线虫的防御反应17，而有关 PR1蛋白在植物与病毒互作中的功能研究鲜有报道。课题组长期致力于大豆与 SMV 互作机制的研究，已证明 H2O2信号分子通过参与调控胼胝质（Callose,-l,3-葡聚糖）在胞间连丝颈区的沉积从而参与非亲和互作过程，并构建了清除 H2O2前后大豆响应 SMV 的高通量转录组数据库18。本研究从转录组数据库中筛选得到 1 个差异表达的基因Glyma.15G062400.1，通过 NCBI 数据库进行序列比对，结果表明该基因为 GmPR1-6。利用病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默 GmPR1-6 基因，通过分析基因沉默植株叶片接种 SMV 后胼胝质的积累水平及病毒的扩散情况，解析该基因在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能，为深入研究病程相关蛋白在大豆抵御 SMV 侵染的分子机制奠定基础。大豆Glycine max（L.）Merr.是我国重要的粮油经济作物，但因其产能不足，导致供需严重不平衡1。由大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病毒病是我国大豆主产区普遍发生且破坏性强的重要病害，往往造成大豆叶片卷曲、皱缩、花叶、坏死，致使大豆品质、产量急剧下降，甚至绝收2，且采用物理或化学方法对大豆花叶病毒病进行防治十分困难。因此，深入探讨大豆抵抗SMV侵染的分子机制、挖掘主效抗病基因、培育抗病大豆新品种，对提高大豆的产量和品质，促进农业发展具有重要意义。受病原物侵害后，植物体能够诱导产生并积累一类病程相关蛋白（Pathogenesis related proteins,PRP/PRs），从而增强植物抗病能力3。早在 1970年，PR 蛋白首次在感染烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的烟草叶片中被检测到，并发现其与过敏性反应（Hypersensitive response,HR）相关4，随后在单子叶和双子叶植物中均被挖掘。根据其生物学功能、蛋白质序列相似性、亲缘关系、酶活性等将其分为 17 个家族，不同家族的 PR 蛋白在植物生长发育过程中发挥不同作用3。大量研究表明 PR 蛋白具有广泛的抗细菌和真菌活性，如番茄中 PR1 能对疫霉菌、白粉病菌和蚕豆单胞锈菌等致病真菌产生抑制作用5；PR2 蛋白属于-1,3-葡聚糖酶，能够催化葡聚糖降解，分解真菌细胞壁，在猕猴桃中过表达 PR2 蛋白增强其对猕猴桃溃疡病菌的抗性6；百合中的 LhSorPR4-2 受水杨酸等植物激素的诱导从而提高百合对灰霉病的抗性7；PR6 作为 1 种蛋白酶抑制剂，在植物抵抗细菌、真菌、线虫或食草性昆虫的过程中发挥作用8。PR9蛋白作为过氧化物酶，能够催化木质素、木栓质的生物合成以加固植物细胞壁进而抵御病原菌9；苏伟华，等：病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探10第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报1 材料与方法1.1 试验材料SMV 毒株 N3、SC8 与大豆品种冀豆号分别组成非亲和组合以及亲和组合。其中，SMV 毒株 N3、SC8 以及大豆品种南农 1138-2由南京农业大学智海剑教授惠赠，冀豆号由河北农林科学院粮油作物研究所张孟臣研究员提供。1.2GmPR1-6的克隆与生物信息学分析使 用 UNlQ-10 柱 式 Trizol 总 RNA 抽 提 试 剂盒（货号：B511321,Sangon）提取冀豆号叶片中的总 RNA，经反转录试剂（货号：RR047,TaKaRa）反转为 cDNA 待用。从在线基因组数据库网站 Phytozome（http:/Phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中提取 GmPR1-6（Glyma.15G062400.1）基因的编码区序列，利用 SnapGene 软件设计特异 引 物（表 1），通 过 PCR（Polymerase chain reaction）扩增其编码区（长度为 495 bp），连接至克隆载体 pEASY-Blunt Zero，并转化至大肠杆菌感受态，筛选阳性单克隆送至北京华大基因科技有限公司（以下简称华大）测序。使用 Protparam（https:/web.expasy.org/protparam/）、NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）、ProtScale（https:/web.expasy.org/protscale/）、TMHMM Server v.2.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）、ProtComp（http:/ ams&subgroup=proloc）、SignalP-5.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0）网 站 分 别 对GmPR1-6 氨基酸的理化性质、保守结构域、疏水性、跨膜结构域、亚细胞定位和分泌信号肽进行分析预测。1.3 实时荧光定量检测大豆抵抗 SMV 侵染过程中GmPR1-6 基因的表达参考邓恩新研究19中的简易注射装置，将 50 mol/L 咪唑溶液（质膜 NADPH 氧化酶的专一性抑制剂，Imidazole）注射到大豆第一轮真叶中作为试验组，以注水处理的叶片材料作为对照组（Water）。在注射 24 h 后，将 SMV 毒株 N3 接种于叶片表面，并分别在接种病毒后 0、4、12、24 和 48 h 对大豆叶片中 GmPR1-6 表达水平进行检测，RT-qPCR 检测引物见表1。以GmEF1b作为内参基因，采用2-Ct法计算基因的相对表达量20。1.4 GmPR1-6 基因 VIGS 载体的构建以含有 GmPR1-6 全长序列的大肠杆菌菌液提取的质粒为模板，使用特异性引物（表 1）扩增 GmPR1-6 的特异性沉默区段，将其连接至使用 BamH I 和 Xho I 酶 切 的 pTRV2 载 体 中，构 建pTRV2-GmPR1-6 重组质粒，将其转化到大肠杆菌，送至华大测序。将测序正确的重组载体质粒转化到农杆菌 GV3101 中，并使用 BamH I 和 Xho I 对重组质粒进行双酶切验证。表 1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study引物名称Primer name引物序列Primer sequence用途PurposeGmPR1-6-RTQ-FTGGTGACCTAAGTGGCACAGRT-qPCR 检测GmPR1-6 表达GmPR1-6-RTQ-RAGACGCACAGAGTCTCTCCAGmEF1b-RTQ-FCCACTGCTGAAGAAGATG-ATGATG RT-qPCR 检测GmEF1b 表达GmEF1b-RTQ-RAAGGACAGAAGACTTGCCA-CTCVIGS-GmPR1-6-FggatccAATTAACACCTCCCTTTCAGTATTATTAATTTCTATAGmPR1-6 VIGS载体构建VIGS-GmPR1-6-RctcgagCACCTCTGATCTTGCA-GCGTM13-FGTAAAACGACGGCCAGTT 载体通用测序引物M13-RCAGGAAACAGCTATGACRT-CP-FATGCTCAGACAAGTGAGCT RT-PCR 检测SMV CP 表达RT-CP-FCTCCCTGCCATTCATAAACRT-GmEF1b-FTTTTCACTCACTCACTCTGC-ACT RT-PCR 检测GmEF1b 表达RT-GmEF1b-RCATGTCGGTCTCATCATCCCAGmPR1-6-FATGGGGTTGTGCAAGGTTTCAGmPR1-6基因克隆GmPR1-6-RCTAGTAGGGTCTTTGGC-CAACATAG注：小写字母序列为限制性内切酶识别序列。1.5 病毒转染及基因沉默效率检测将 含 有 pTRV1 质 粒 和 pTRV2-GmPR1-6 重 组质粒的农杆菌菌株等体积混合作为试验组（TRV:GmPR1-6），将含有 pTRV1 质粒和 pTRV2 质粒的农杆菌菌株等体积混合作为对照组（TRV:00），浇灌到去除顶芽后的大豆根部进行病毒转染，并对病毒转染后的植株进行沉默效率检测，具体方法参考孙天杰等人的研究21。采用摩擦接种方法将 SMV接种于大豆叶片表面，对接种病毒叶片进行苯胺蓝染色，对胼胝质荧光强度进行观察，并利用 ImageJ软件对 30 个接种点处胼胝质的面积进行量化分析。采用点接种方法将 SMV 接种于大豆叶片表面，利用 RT-PCR 技术检测 SMV 外壳蛋白转录产物，具体操作参考本实验室 Sun 等的研究18。11第 4 期2 结果与分析2.1 GmPR1-6 基因克隆与生物信息学分析本研究在转录组数据库中筛选到的差异表达基因 GmPR1-6，以冀豆 7 号叶片 cDNA 为模板进行扩增，获得预期大小的扩增片段（图 1A），测序确认获得正确的 CDS 序列，该基因全长为 495 bp，编码 164 个氨基酸。该基因编码的蛋白产物相对分子质量为 17.55 kD，等电点为 5.14，预测含有1 个 CAP 结构域和 1 个 SCP 结构域（图 1B），属于典型的病程相关蛋白。在三维结构上，发现该蛋白具有 3 个 折叠、3 个 螺旋（图 1C）。利用 TMHMM、SignalP 和 ProtComp 在线分析软件对 GmPR1-6 的跨膜结构域、分泌信号肽和亚细胞定位进行分析，结果表明 GmPR1-6 没有跨膜结构域，但具有信号肽（图 1D），且该蛋白可能定位于细胞外。ABM 1bp2 0001 000750500250100CD128160 16430152SCPCAP495 bp注：A.GmPR1-6 的克隆，M：DL2000 Marker；B.GmPR1-6 结构域示意图；C.GmPR1-6 三级结构预测；D：GmPR1-6 分泌信号肽预测。图 1 GmPR1-6 的克隆及生物信息学分析Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis of GmPR1-62.2 GmPR1-6 在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的表达模式为了探讨 GmPR1-6 在大豆抵抗 SMV 侵染过程中的功能，本研究检测其在亲和组合与非亲和组合中受 SMV 侵染后不同时间点的表达量。结果显示，GmPR1-6 在非亲和组合中的表达量显著高于亲和组合；与病毒接种后的 0 h 相比，GmPR1-6 的表达量在12 h开始逐渐升高，48 h达到高峰（图2A）。此外，在非亲和组合的叶片上预注射咪唑（Imidazole）清除 H2O2信号后，发现 GmPR1-6 的表达量在 12 h 和48 h 显著上升（图 2B）。综上说明，GmPR1-6 在转录水平响应 SMV 的侵染，并且在非亲和组合中的表达明显高于亲和组合。ABGmPR1-6GmPR1-6相对表达水平Relative expression level相对表达水平Relative expression level接种时间/hHours post inoculation接种时间/hHours post inoculation302520154206050403020102.01.51.00.50.00 4 12 24 480 4 12 24 48N3SC8WaterImidazoie注：A.GmPR1-6 在亲和与非亲和组合中的表达量；B.GmPR1-6 在清除 H2O2后的表达量；星号表示根据 t 检验统计分析的显著差异（*：P0.05，*：P0.01，ns：无显著差异）；小写字母表示根据单因素方差分析和邓肯氏多重比较鉴定的显著差异（P0.05）。图 2 GmPR1-6 在大豆接种 SMV 后的表达模式Fig.2 Expression pattern of GmPR1-6 after SMV inoculation 苏伟华，等：病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探12第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报2.3GmPR1-6基因沉默后降低了大豆对SMV侵染的抗性2.3.1 GmPR1-6 基因 VIGS 载体的构建及沉默效率检测 课题组前期建立了烟草脆裂病毒介导（TRV-VIGS）大豆基因沉默技术体系21，本研究进一步利用该体系验证 GmPR1-6 基因在大豆抵御 SMV 侵染过程中的功能。首先，借助 NCBI BLAST 工具选取 GmPR1-6 基因的特异性片段作为沉默区段（图3A），利用特异性引物（表 1）进行扩增，得到与预期分子大小（216 bp）一致的条带，经华大测序正确后连接至 pTRV2 载体，使用 BamH I 和 Xho I对重组载体 GmPR1-6-VIGS 质粒进行酶切验证（图3B），利用验证正确的质粒载体系统沉默 GmPR1-6基因。取接种 SMV 毒株 N3 的大豆第一轮叶片，利用RT-qPCR技术对GmPR1-6的沉默效率进行检测，结果显示，与对照植株（TRV:00）相比，沉默植株（TRV:GmPR1-6）中 GmPR1-6 的表达量均下降了50%以上（图 3C），表明 GmPR1-6 沉默效率良好，可用于功能研究。CGmPR1-6AGmPR1-6267 bp402 bp132 bp-78 bpBMMTRV:GmPR1-6酶切前酶切后bpbp2 0002 0001 0001 000750500250100750500250100216 bp216 bp相对表达水平Relative expression level接种时间/hHours post inoculation 2.01.51.00.50.024 48 72 96 120 TRV:00TRV:GmPR1-6注：A.TRV-VIGS 靶向片段在 GmPR1-6 mRNA 上的位置示意图，红色箭头所指括号区域表示 VIGS 试验中靶向片段，黑色箭头表示用于 RT-qPCR 检测基因表达水平的引物位置；B.TRV:GmPR1-6 载体构建，左图为 GmPR1-6 沉默片段的扩增，右图为重组载体使用 BamH I和 Xho I 进行酶切验证，M：DL2000 Marker；C.GmPR1-6 沉默效率检测，星号表示根据 t 检验统计分析的显著差异（*：P0.05，*：P0.01），下同。图 3 GmPR1-6 沉默载体构建及沉默效率检测Fig.3 The construction of TRV:GmPR1-6 vectors and detection of the silencing efficiency2.3.2 GmPR1-6 沉默植株的胼胝质积累情况检测 实验室前期研究表明，胼胝质在胞间连丝颈部沉积是大豆抵抗 SMV 侵染的关键22，本试验采用摩擦接种的方法将 SMV 毒株 N3 接种于 GmPR1-6 沉默植株的大豆叶片上，利用苯胺蓝对接种病毒叶片进行染色，观察叶片中胼胝质变化情况。结果显示，在同一时间点，与对照组（TRV:00）相比，沉默植株（TRV:GmPR1-6）胼胝质荧光强度相对减弱（图 4A），胼胝质面积有所增加（图 4B）。接种时间/hHours post inoculation24 48 72 96 120 TRV:00TRV:GmPR1-6A24 h 48 h 72 h 96 h 120 hTRV:00TRV:GmPR1-6Fluorescence Fluorescence Bright fieldBright fieldB荧光面积/m2Area of callose flouresecence per inoculation site25 00020 00015 00010 0005 0000注：A.胼胝质荧光观察，Fluorescence 表示苯胺蓝染色，Bright field 表示明场，标尺=50 m；B.胼胝质面积统计。图 4 GmPR1-6 沉默植株的胼胝质荧光观察与面积统计Fig.4 Observation and area statistics of callose fluorescence in GmPR1-6 silenced plants13第 4 期实验室前期工作证明，预注射咪唑抑制 H2O2的产生，能够导致由 SMV 侵染诱导的胼胝质荧光水平降低，同时病毒在胞间的扩散增强18。由此推测，沉默 GmPR1-6 基因增加了大豆对 SMV 的敏感性。2.3.3 GmPR1-6 在大豆抵抗 SMV 胞间运输中的作用为进一步分析 GmPR1-6 的沉默是否影响 SMV的胞间运输，本研究采用点接种法将 SMV 毒株 N3接种于 GmPR1-6 沉默植株叶片表面，以接种点为中心，分别取向外延展 1、2、3 以及 4 mm 叶片，对叶片中 SMV 外壳蛋白（CP）在转录水平的表达情况进行检测，以此来判断基因沉默后病毒的扩散情况。结果发现，对照组（TRV:00）叶片在接种点外始终未检测到 SMV CP 基因的表达，而 GmPR1-6沉默植株叶片在接种 SMV 后 48 h 病毒开始向外扩散至 1 mm，120 h 时病毒已扩散至 4 mm（图 5），说明沉默GmPR1-6基因更有利于病毒在胞间的扩散。TRV:00TRV:GmPR1-6positivepositivenegativenegativeExtended distance/mmExtended distance/mmIS 1 2 3 4IS 1 2 3 40 h24 h48 h72 h96 h120 hCPGmEF1bCPGmEF1bCPGmEF1bCPGmEF1bCPGmEF1bCPGmEF1b注：IS 表示接种的部位即接种点，1、2、3、4 表示以接种点为中心向外扩展 1、2、3、4 mm 的环状区；GmEF1b 作为内参基因。图 5 GmPR1-6 沉默植株叶片上 SMV 的胞间运输检测Fig.5 Detection of intercellular transport of SMV in GmPR1-6 silent leaves2.3.4 GmPR1-6 在大豆抵抗 SMV 长距离运输中的作用 实验室前期研究表明 SMV 可在韧皮部装载，通过筛管进行长距离运输，最终实现系统性侵染23。本研究采用摩擦接种法将 SMV 毒株 N3 接种到GmPR1-6 沉默植株叶片上，对接种病毒叶片的上位叶片进行观察和 SMV CP 基因表达情况的检测，发现在接种后 14 d，GmPR1-6 沉默植株接种病毒叶片的上位叶出现不同程度的花叶、失绿、卷曲等感病症状，且上位叶中检测到 SMV CP 基因的表达，而对照中未观察到明显症状，同时未检测到 SMV CP 基因的表达（见图 6）。说明在 SMV 毒株 N3 与冀豆 7 号组成的非亲和组合中，沉默 GmPR1-6 后病毒可以通过长距离运输实现系统侵染，进一步说明 GmPR1-6 在大豆抵御 SMV 侵染过程中发挥重要作用。ABTRV:00TRV:00TRV:GmPR1-6TRV:GmPR1-6postiveCPGmEF1b注：A.上位叶表型；B.上位叶中 SMV CP 基因检测，Postive 表示阳性对照，TRV:00 表示阴性对照，TRV:GmPR1-6 为 GmPR1-6沉默植株，GmEF1b 为内参基因。图 6 GmPR1-6 沉默植株接种 SMV 叶片上位叶表型观察及病毒检测Fig.6 Phenotype and virus detection in the upper leaves of GmPR1-6 silenced plants inoculated with SMV3 结论与讨论病程相关蛋白家族种类繁多，其中 PR1 家族基因最丰富，其结构也十分保守12。在拟南芥中有22 个24、水稻中有 12 个25、葡萄中 10 个26，本研究根据 PR1 的结构域文件，通过 HMMER 查找大豆基因组中的 PR1 蛋白，结果发现大豆中有19 个 PR1 家族基因。大量研究表明，病程相关蛋白PR1 基因广泛参与植物防御反应，如棉花 GhPR1 受GhMYB36 的激活参与棉花对黄萎病抗性15；大豆中过表达 GmPR1L 增强大豆对大豆灰斑病菌的防御反应16，GmMAPK4-1 能够诱导 GmPR1-6 的表达从而参与大豆抵抗大豆包囊线虫的过程17。本研究从大豆响应 SMV 侵染的转录组数据库中筛选得到1 个差异表达的大豆病程相关蛋白基因 GmPR1-6，沉默该基因增加大豆对 SMV 的敏感性，说明该基因在大豆抵御 SMV 侵染过程中发挥正调控作用。有研究表明，PR1 基因是多种物种中水杨酸（SA）介导免疫的标志27，SA 信号能够诱导 PR1基因的表达从而参与植物的防御反应。而 SA 信号 苏伟华，等：病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探14第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报能够与 H2O2信号相互作用参与植物抵御逆境胁迫，如拟南芥中介体复合体亚基 MED8 作为 H2O2诱导基因表达的负调控因子，能够增强水杨酸信号途径28；S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）作用于 H2O2下游激活 SA 信号转导机制，且编码过氧化氢酶的基因 CAT2 突变能够诱导 SA 的生成，从而显著激活 SA 下游防御基因（如 PR1）表达增强植物抗性29。实验室前期研究表明，早期的 H2O2信号能够提高大豆对 SMV 的防御能力，而本研究发现清除H2O2后GmPR1-6的转录水平表达量却有所升高，并且在大豆抵抗 SMV 的侵染过程发挥正调控功能。分析可能是 H2O2信号途径与 SA 信号途径存在交叉，而 GmPR1-6 是否受 SA 调控从而参与大豆与 SMV的互作过程还有待进一步验证。病毒主要通过胞间连丝（Plasmodesmata,PD）向邻近细胞转运以及通过筛管系统进行长距离运输，实现成功侵染30。而植物可以通过调节胼胝质在胞间连丝颈区沉积，降低胞间连丝的通透性，有效阻断病毒胞间运输31。实验室前期研究发现，胼胝质在胞间连丝颈部的沉积能够限制 SMV 在大豆的胞间转运22；Zhang 等人23利用嫁接技术进一步证明胼胝质在韧皮部的沉积能够有效限制 SMV的长距离运输，充分说明胼胝质的沉积是大豆抵抗SMV 侵染的关键因素。另有研究发现，病程相关蛋白能够在胼胝质的沉积过程中发挥重要作用，拟南芥 PR2 能够编码 1 种-1,3-葡聚糖酶，从而抑制胼胝质的合成，当拟南芥与病原物互作时，ABA 信号途径则通过抑制 PR2 的表达使胼胝质沉积增加，进而提高对病原物的抗性32；在玫瑰中，RcPR4/1和 RcPR5/1 通过影响 PR2 和胼胝质合酶的表达来调控胼胝质的沉积，从而提高玫瑰对盐胁迫的抗性33。本研究利用 VIGS 技术沉默 GmPR1-6 基因，沉默植株病毒侵染处胼胝质荧光面积增大而强度减弱，可能是由于 GmPR1-6 的沉默降低了大豆对 SMV 胞间转运的限制，使得病毒在胞间的转运相较于对照加快，尽管在一定程度上降低了 SMV 感染细胞中胼胝质的积累水平，但是没能够充分限制病毒的胞间运输，因此病毒的移动导致了邻近受侵染细胞中胼胝质的产生。参考文献:1 杨树果,何秀荣.中国大豆产业状况和观点思考J.中国农村经济,2014(4):32-41.2 Daz-Cruz G A,Cassone B J.A tale of survival:Molecular defense mechanisms of soybean to overcome Soybean mosaic virus infectionJ.Physiological and Molecular Plant Pathology,2018,102(4):79-87.3 Van Loon L C,Rep M,Pieterse C M J.Significance of inducible defense-related proteins in infected plantsJ.Annual Review of Phytopathology,2006,44(9):135-162.4 Van Loon L C.Occurrence and properties of plant pathogenesis-related proteinsJ.Pathogenesis-related Proteins in Plants,1999:1-19.5 Niderman T,Genetet I,Bruyere T,et al.Pathogenesis-related PR-1 proteins are 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