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基因工程操作流程为什么为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢聚合酶能够仅在启动子处结合呢?启动子处的核苷酸顺序具有特异的形启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启个以上启动子的顺序进行了比较，发现在动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开合成开始位点的上游大约始位点的上游大约10bp和和35bp处有两个共同处有两个共同的顺序，称为的顺序，称为-10和和-35序列。这两个序列的序列。这两个序列的共同顺序如下，共同顺序如下，-35区区“AATGTGTGGAAT”，-10区区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有。大多数启动子均有共同顺序（共同顺序（consensus sequence)，只有少，只有少数几个核苷酸的差别。数几个核苷酸的差别。终止子终止子能转录相应的信使能转录相应的信使能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNARNARNA，能编，能编，能编，能编码蛋白质码蛋白质码蛋白质码蛋白质 编码区编码区编码区编码区:非编码区非编码区非编码区非编码区:原核细胞的原核细胞的原核细胞的原核细胞的基因结构基因结构基因结构基因结构有调控作用，含启动子、终止有调控作用，含启动子、终止有调控作用，含启动子、终止有调控作用，含启动子、终止子等。子等。子等。子等。非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游 启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子检测目的基因是否转录出了mRNA将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。3）将目的基因导入微生物细胞目的基因的获取：三种方法原核细胞与真核细胞的基因结构比较检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上(1)从基因文库中获取多聚酶链式反应获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因常用方法：-农杆菌转化法基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）检测方法：分子杂交技术基因工程的基本操作程序是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。基因组文库：含有一种生物所有的基因能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质上述三个步骤为一个循环，经2530次循（二）真核细胞的基因结构（二）真核细胞的基因结构(补补)编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与与与RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶结合位点结合位点结合位点结合位点内含子内含子内含子内含子 外显子外显子外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游 内含子：内含子：内含子：内含子：外显子：外显子：外显子：外显子：原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有调控和具有调控作用的作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续连续连续不连续不连续不连续不连续编码区编码区编码区编码区非编码非编码非编码非编码1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNA DNA DNA DNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取v基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定v目的基因目的基因主要指编码蛋白质的结构基因主要指编码蛋白质的结构基因,也可也可以是一些具有调控作用的因子。以是一些具有调控作用的因子。取取取取 出出出出DNADNADNADNA用限制酶用限制酶用限制酶用限制酶切断切断切断切断DNADNADNADNA 目前被较广泛目前被较广泛目前被较广泛目前被较广泛提取使用的目的基提取使用的目的基提取使用的目的基提取使用的目的基因有：苏云金杆菌因有：苏云金杆菌因有：苏云金杆菌因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛抗虫基因、人胰岛抗虫基因、人胰岛抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素素基因、人干扰素素基因、人干扰素素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋基因、种子贮藏蛋基因、种子贮藏蛋基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病白基因、植物抗病白基因、植物抗病白基因、植物抗病基因等。基因等。基因等。基因等。1.目的基因的获取目的基因的获取基因文库的种类：基因文库的种类：基因组文库基因组文库：含有一种生物所有的基因：含有一种生物所有的基因部分基因文库部分基因文库：含有一种生物的一部分基因：含有一种生物的一部分基因（如：如：cDNA文库）文库）获取目的基因的方法一：获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因基因文库基因文库（gene library）的概念：的概念：将含有某种生物的不同基因的许多将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因，称为基因文库。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA片段片段重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌载体载体载体载体受体菌受体菌受体菌受体菌基因组文库基因组文库存存在在于于转转化化细细菌菌内内，由由载载体体所所携携带带的的所所有有基基因因组组DNADNA的集合。的集合。mRNA逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶c DNA双链双链cDNA重组重组DNA分子分子载体载体载体载体含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌受体菌受体菌受体菌受体菌用用某某种种生生物物发发育育的的某某个个时时期期的的mRNAmRNA制制备备双双链链的的cDNAcDNA后后，建立的基因文库。建立的基因文库。cDNAcDNA文库文库文库类型文库类型 cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中启动子基因中启动子（具有启动作用（具有启动作用的的DNA片段）片段）无无有有基因中内含子基因中内含子（位于编码蛋白（位于编码蛋白质序列内的非编质序列内的非编码码DNA片段）片段）无无有有基因多少基因多少某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的全部基某种生物的全部基因因物种间的基因交物种间的基因交流流可以可以部分基因可以部分基因可以PCR(polymerase chain reaction)PCR(polymerase chain reaction)多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一一项项在在生生物物体体外外复复制制特特定定DNADNA片片段段的的核核酸酸合合成成技技术术。通通过过此此技技术术，可可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。获取目的基因方法二：获取目的基因方法二：利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪原理：原理：DNADNA双链复制双链复制反应过程：反应过程：1.1.变性：变性：变性：变性：将反应系统加热至将反应系统加热至将反应系统加热至将反应系统加热至90 -95 90 -95，使模板，使模板，使模板，使模板DNADNA完全变性成为单链；完全变性成为单链；完全变性成为单链；完全变性成为单链；2.2.退火：退火：退火：退火：将温度下降至将温度下降至将温度下降至将温度下降至55-6055-60左右，使引物与左右，使引物与左右，使引物与左右，使引物与模板模板模板模板DNADNA退火结合；退火结合；退火结合；退火结合；3.3.延伸：延伸：延伸：延伸：将温度升至将温度升至将温度升至将温度升至70-75 70-75，DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 以以以以dNTPdNTP为底物催化为底物催化为底物催化为底物催化DNADNA的合成反应。的合成反应。的合成反应。的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经25253030次循次循次循次循 环后，可将模板环后，可将模板环后，可将模板环后，可将模板DNADNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。扩增达百万倍。扩增达百万倍。反应体系：反应体系：模板模板模板模板DNADNA、特异性引物、特异性引物、特异性引物、特异性引物、耐热耐热耐热耐热DNADNA聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP及缓冲液及缓冲液及缓冲液及缓冲液 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因检测方法：分子杂交技术变性：将反应系统加热至90 -95，使模板DNA完全变性成为单链；用Ca+（常用CaCl2）处理细菌细胞，以增大细胞壁的通透性，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态感受态细胞。3）将目的基因导入微生物细胞适用于目的基因不是很大且其序列是已知的不能够编码蛋白质的序列叫做内含子1）将目的基因导入植物细胞存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。用重组质粒转化大肠杆菌分离大肠杆菌中的质粒3）将目的基因导入微生物细胞是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。DNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪过程：过程：适用范围：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。酸数量较少。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成获取目的基因方法三：化学合成法获取目的基因方法三：化学合成法小结:目的基因的获取：三种方法目的基因的获取：三种方法目的基因的获取：三种方法目的基因的获取：三种方法(1)(1)(1)(1)从基因文库中获取从基因文库中获取从基因文库中获取从基因文库中获取适用于目的基因序适用于目的基因序适用于目的基因序适用于目的基因序列为未知的情况列为未知的情况列为未知的情况列为未知的情况(2)(2)(2)(2)利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR技术扩增技术扩增技术扩增技术扩增适用于目的基因的序列适用于目的基因的序列适用于目的基因的序列适用于目的基因的序列为已知的情况为已知的情况为已知的情况为已知的情况(3)(3)(3)(3)人工合成人工合成人工合成人工合成适用于目的基因不是很大且其适用于目的基因不是很大且其适用于目的基因不是很大且其适用于目的基因不是很大且其序列是已知的序列是已知的序列是已知的序列是已知的基因表达载体的组成基因表达载体的组成基因表达载体的组成基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因等标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是标记基因：鉴别受体细胞中是标记基因：鉴别受体细胞中是标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有否含有目的基因，从而将含有否含有目的基因，从而将含有否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。目的基因的细胞筛选出来。目的基因的细胞筛选出来。目的基因的细胞筛选出来。2、基因表达载体的构建常用的受体细胞常用的受体细胞 动物、植物、微生物动物、植物、微生物转化：转化：目的基因目的基因进入进入受体细胞内，并且在受体细受体细胞内，并且在受体细胞内维持胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程。的过程。3 3、目的基因导入受体细胞、目的基因导入受体细胞1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法转化方法转化方法2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞 常用常用CaCl21 1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞常用方法：常用方法：常用方法：常用方法：-农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法 适用范围：适用范围：适用范围：适用范围：双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物转化过程：转化过程：转化过程：转化过程：1 1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞基因枪法基因枪法基因枪法基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是籍基因枪法又称微弹轰击法，是籍基因枪法又称微弹轰击法，是籍基因枪法又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于高速度运动的金属微粒将附着于高速度运动的金属微粒将附着于高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细其表面的核酸分子引入到受体细其表面的核酸分子引入到受体细其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术。胞中的一种遗传物质转化技术。胞中的一种遗传物质转化技术。胞中的一种遗传物质转化技术。这是单子叶植物中常用的一种基这是单子叶植物中常用的一种基这是单子叶植物中常用的一种基这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高因转化方法，但是成本较高因转化方法，但是成本较高因转化方法，但是成本较高此技术最早由我国学者周光宇提出的，此技术最早由我国学者周光宇提出的，此技术最早由我国学者周光宇提出的，此技术最早由我国学者周光宇提出的，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管是在植物受粉后，花粉形成的花粉管是在植物受粉后，花粉形成的花粉管是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的基因借（含目的基因），使目的基因借（含目的基因），使目的基因借（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。助花粉管通道进入受体细胞。助花粉管通道进入受体细胞。助花粉管通道进入受体细胞。1 1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞花粉管通道法花粉管通道法花粉管通道法花粉管通道法2 2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌细胞的转化方法大肠杆菌细胞的转化方法：用用Ca+（常用（常用CaCl2）处理细菌细胞，以增大细胞）处理细菌细胞，以增大细胞壁的通透性，使细胞处于能吸收周围环境中壁的通透性，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态感受态细胞。感受态细胞。将重组表达载体将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收吸收DNA分子，完成转化。分子，完成转化。1)分子水平的检测分子水平的检测检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNADNA上上上上检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法：检测方法：DNA分子杂交技术分子杂交技术检测方法：检测方法：分子杂交技术分子杂交技术检测方法：检测方法：抗原抗原-抗体杂交抗体杂交4 4、目的基因的检测和鉴定、目的基因的检测和鉴定DNADNA分子杂交技术分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNADNA解开，把单股的解开，把单股的解开，把单股的解开，把单股的DNADNA小片段用同位素、荧光分子或化小片段用同位素、荧光分子或化小片段用同位素、荧光分子或化小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNADNA中的中的中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNADNA或基因。或基因。或基因。或基因。感谢观看感谢观看