微生物之克雷伯菌课件.ppt

肺炎克雷伯菌分子检测肺炎克雷伯菌分子检测肺炎克雷伯菌分子检测肺炎克雷伯菌分子检测陈颖曦陈颖曦江苏嘉语生物医药科技股份有限公司江苏嘉语生物医药科技股份有限公司目录目录肺炎克雷伯靶点的确定与序列比对肺炎克雷伯靶点的确定与序列比对肺炎克雷伯种属鉴定常用靶点肺炎克雷伯种属鉴定常用靶点肺炎克雷伯和鲍曼不动杆菌简介肺炎克雷伯和鲍曼不动杆菌简介鲍曼不动杆菌靶点的确定与序列比对鲍曼不动杆菌靶点的确定与序列比对参考文献参考文献肺炎克雷伯氏菌简介肺炎克雷伯氏菌简介 本菌革兰氏阴性，革兰阴性杆菌，大小为(0.3 1.5)m X(0.6 6.0)m。单个、成双或短链排列。痰标本直接涂片染色，菌体呈卵圆形或球杆状，单个或成双排列。英膜染色外周可见透明、环状荚膜。氧化酶试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖等多种糖类，TSI 为A/A，IMViC-+，硝酸盐还原、脲酶和赖氨酸脱竣酶试验阳性，动力、H2 S、鸟氨酸脱竣酶和精氨酸双水解酶试验均为阴性。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界水和土壤中，是人类呼吸道的常居菌，在人和动物肠道内也常见，是-种条件致病菌。在临床分离到的克雷伯菌属中，肺炎克雷伯菌占80%以上，是本属中最为常见的病原菌，可引起肺炎、脑膜可引起肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。11。肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌革兰氏染色（阴性）革兰氏染色（阴性）克雷伯杆菌肺炎克雷伯杆菌肺炎肠杆菌科肠杆菌科其他属（肠杆菌属，其他属（肠杆菌属，埃希氏属等）埃希氏属等）克雷伯氏菌属克雷伯氏菌属K.pneumoniae K.GranulomatisK.oxytocaK.terrigenaK.planticola分子检测常用靶点分子检测常用靶点靶微生物基因名生理功能基因大小（bp）特异性敏感性KP16S2核糖体RNA126100%1 ng/L2K.sspgapA3甘油醛-3-磷酸脱氢酶450UnknowunknowKPHemolysin4,12溶血素Unknow假阳性12unknowKPITS5,6,716S-23S间隔序列130100%unknowKPphoE8,910外膜磷酸盐孔蛋白209100%0.1 ng/PCRKlebsiella oxytocapehX11聚半乳糖醛酸酶344100%unknowKP肺炎克雷伯菌，K.ssp 克雷伯属靶微生物基因名生理功能基因大小（bp）特异性敏感性KPrpoB13RNA聚合酶亚基108100%unknowKPWaaQ14LPS heptosyl III 转移酶217100%unknowAB 鲍曼不动杆菌，A.ssp 不动杆菌属，A.genogroup 不动杆菌基因型分组肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ITSITS序列比对序列比对选取选取254株株肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ITS序列进行比对，生成比对文件肺炎克雷伯菌序列进行比对，生成比对文件肺炎克雷伯菌ITS.apr肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ITSITS进化树进化树文献中肺炎克雷伯菌文献中肺炎克雷伯菌ITSITS引物引物Primer nameSequence（53）Targeting microbeLocationProduct size(bp)PF1Pr1ATTTGAAGAGGTTGCAAACGATTTCACTCTGAAGTTTTCTTGTGTTCKP262-286275-401130肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌phoEphoE序列比对序列比对选取选取26株株肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌phoE序列进行比对，生成比对文件序列进行比对，生成比对文件phoE.apr肺炎克雷伯肺炎克雷伯phoEphoE进化树进化树文献中肺炎克雷伯菌文献中肺炎克雷伯菌phoEphoE引物引物Primer nameSequence（53）Targeting microbeLocationProduct size(bp)phoE-rhiF1phoE-rhiRGCGGCAGCGACTTCGCCGTAGTTCTGCGCTTTGTTGGCAAACKP subsp.rhinoscleromatis不匹配不匹配209F2RTGCCCAGACCGATAACTTTACTGTTTCTTCGCTTCACGGKP593-612716-734142肺炎克雷伯菌耐药基因比对肺炎克雷伯菌耐药基因肺炎克雷伯菌耐药基因抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注-内酰胺类产水解酶ATEM-1(1a,1b),3,5?,10,11,12,24,26,27?,47,48,52,54,86,130,13215,17,20,24,25,29,30,32,33,34,35,36,40,45,46,47,53,55,56,77,79,81,8694%质粒介导SHV-1,2(2a),5,11,12,15?,25，26,27,28,32?,36,40,55,60,62,71?,73?,74?,75?,76?,77?,78?,79?,80?,81?,82?,83?,103 15,17,18,20,25,26,27,29,32,33,34,35,38,40,42,45.46,47,48,50,53,55,68,77,79,81,82,8652.8%质粒介导“?”表明该基因未找到对应序列进行比对，已比对的基因没进行任何标记。抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注-内酰胺类产水解酶ACTX-M-2,3,9?,12,14,15,22,24,28,32,61?15,18,22,26,30,31,33,34,35,38,43,45,46,47,53,55,56,59,61,64,67,75,77,79,8594%质粒介导KPC-1,2,3,716,18,19,21,27,28,58,61,69,71,72,76,77,7940.2%质粒介导,水解碳青霉烯类GES-1,3,4,718,40,55unknownunknownVEB-118unknownunknownPSE?836/74unknown抗生素类别耐药机制相关基因备注-内酰胺类产水解酶BVIM-1,19,27 18,44,60,61,67unknownNDM-143质粒介导IMP-1,4,878,83非转移质粒CCMY-1,2,4,6,8,10,12,13?,19,31,56,87DHA-1EBC?CIT?FOX18,23,33,37,38,39,40,42,48,49,60,73,74,85质粒介导DOXA-1,2,10,17,30,48,48-like?,73 33,36,40,51,52,53,62unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注-内酰胺类产水解酶未知类Toho-1?3224/34日本OKP-A-11,13,14,15,16(比对文件名中没有具体细类名，以OKP-A为名)34,3817.85%染色体介导，肺炎克雷伯特有,chinaOKP-B-13,1438unknown染色体介导LEN-1738unknownunknownIBC?45unknownunknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注-内酰胺类外膜蛋白缺失或突变OmpK3540,49，842/230(缺失率)染色体OmpK3640,49，841/230(缺失率)染色体抗生素类别耐药机制相关基因备注氨基糖苷类钝化酶AAC(6)-Ib-cr(aacA)29,41,42,43,59,62,66,67,70,79,51,74,85质粒介导26/53AAC(3)-II 29,8548/53APH(3)?29unknownAnt(3”)-I(aadA)41,51,53,74,83,84,85非转移质粒13/53ant(2)-Ia(aadB)51unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注氨基糖苷类16S甲基化酶armA39,63,659/14(分母为耐药株数)质粒介导rmtB39,63,651/14(分母为耐药株数)unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注喹诺酮类保护蛋白qnrB1,4,6,2042,54,57,66,79qnrA(4/21)qnrB(5.2%)qnrS(6/14耐药株比例)质粒介导qnrS1,244,54,62,66,70质粒介导qnrA151,54,57,60,66,67质粒介导靶点突变gyrA80,82主要机制染色体parC80主要机制染色体比对文件注意事项比对文件注意事项耐药基因多聚集成“簇”，有的单个比对文件中包含多个基因，在设计引物时，找准目标基因序列是关键。如果比对文件中包含多种目的基因，如-内酰胺酶“IMP”基因，有“IMP-1，IMP-2等等”，在FASTA文件中改成了相应的名字，以示区别，如果比对文件中只包含一种目的基因，FASTA文件中仍保留其原始名称和名称格式，未作修改。虽然在FASTA文件中，绝大部分成簇基因名称都改成“X（靶基因名）and other genes”,以表示该条序列是靶基因和其他非靶标基因成的“簇”。但成簇基因名称在NTI序列比对软件中显示不完整，只显示把基因名，未显示“and other genes”字样，在查看比对结果时，可打开FASTA原始文件一一对应查看，不过也可以根据基因序列长度来判断，一般的说，碱基数3000bp的序列是成簇基因序列，请注意鉴别。有些铜绿耐药基因序列在NCBI和欧洲数据库中找不到，就用了其他种的对应耐药基因替代，FASTA文件中基因名包含了种名，但在NTI序列比对软件中未显示，只显示了基因名。有些耐药基因未找到文献引物，或是有限的文献中的引物不便于复制操作而未归纳总结，还需另行设计。一些基因在文献中未提及但在NCBI上有记载，也选下来进行比对。TEMTEM序列比对序列比对以下是肺炎克雷伯TEM序列比对文件，其中有TEM-1（75株），TEM-1b(3株)，TEM-1a(1株)，TEM-10（2株），TEM-11（1株），TEM-12（1株），TEM-24（2株），TEM-26B（1株），TEM-47（1株），TEM-48（1株），TEM-52（1株），TEM-54(1株)，TEM-86（1株），TEM-130(1株)，TEM-132（1株）共93株TEM序列。-内酰胺类耐药基因比对内酰胺类耐药基因比对文献中的文献中的TEMTEM引物（通用引物）引物（通用引物）NameSequence(53)LocationProduct sizeTEMF1TEMRTCCGCTCATGAGACAATAACCTTGGTCTGACAGTTACCAATGC3977-39974886-4907930FIN2DEBATTCTTGAAGACGAAAGGGCATGAGTAAACTTGGTCTGAC3825-38444898-49171092A3BATAAAATTCTTGAAGACGAAAGACAGTTACCAATGCTTAATCA3820-38404879-49001080F4RATGAGTATTCAACATTTTTACCAATGCTTAATCA4035-40514879-4895860A5BGAGTATTCAACATTTCCGTGTCTAATCAGTGAGGCACCTATCTC4037-40584863-4884847T16T2CCGTGTCGCCCTTATTCCAGGCACCTATCTCAGCGA4052-40694858-4875823KPCKPC序列比对序列比对选取肺炎克雷伯KPC-1(1株)，KPC-2（12株），KPC-3（2株），KPC-7（1株）进行比对。文献中文献中KPCKPC引物（通用引物）引物（通用引物）NameSequence(53)LocationProduct sizeF1RGCTACACCTAGCTCCACCTTCACAGTGGTTGGTAATCCATGC不匹配8134-81541000KPC-1F2KPC-1RGCTACACCTAGCTCCACCTTCACAGTGGTTGGTAATCCATGC7166-7186不匹配989GESGES序列比对序列比对选取肺炎克雷伯菌GES-1（1株），GES-3（1株），GES-4（2株），GES-7（2株）序列进行比对。文献中文献中GESGES引物（通用引物引物（通用引物）NameSequence(53)LocationProduct sizeGES-1F1GES-1RATGCGCTTCATTCACGCACCTATTTGTCCGTGCTCAGG1333-13512179-2197864GESF2GESRTTCCATCTCAAGGGATCACCGCGTCAACTATTTGTCCGTG不匹配2185-2204unknowVEBVEB序列比对序列比对 由于NCBI中缺少肺炎克雷伯VEB序列，仅1株，另加入3株铜绿假单胞菌（PA）VEB-1进行比对。VIMVIM序列比对序列比对选取肺炎克雷伯VIM-1,2,3,5各1株，VIM-4（2株），VIM-12（1株），VIM-12（1株），VIM-27（2株），VIM-34（3株），VIM-like(2株)进行比对。文献中文献中VIMVIM引物引物(通用引物通用引物)NameSequence(53)LocationProduct sizeVIM-F1VIM-RAGTGGTGAGTATCCGACAGATGAAAGTGCGTGGAGAC1862-18802105-2138509NDMNDM（新德里金属蛋白酶）序列比对（新德里金属蛋白酶）序列比对选取选取23株株NDM序列进行比对。序列进行比对。AmpC(CMY)AmpC(CMY)序列比对序列比对选取CMY-2（2株），CMY-4（5株），CMY-6（2株），CMY-12（1株），CMY-31（1株），CMY-56（3株），CMY-87（2株）进行比对。文献中文献中CMYCMY引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeCMY-1P11P2GTGGATTCATCCGAGAAGATGGATGGGCTTGTCCTCTTTCG1057-10771295-1314CMY(2)257CMY-1CMY-1-S2CMY-1-ASGAGCAGACCCTGTTCGAGATGATTGGCCAGCATGACGATG850-8691677-1696CMY-1(2)1119CMY-2CMY-2-S2CMY-2-ASTGGCCAGAACTGACAGGCAAATTTCTCCTGAACGTGGCTGGC2394-24142835-2855CMY-1(1)461CMY-1-likeCMY-1F3CMY-1RTGAGCAAGACCCTGACTGCGCAATGTCTGCTCGGTGAC878-8961513-1531CMY-1(2)654CMY-2-likeCMY-2F3CMY-2RCTATGGCGTGAAATCCAGCTTGTTTGCCAGCATCACGATG2777-27953122-3142CMY-1(1)366DHADHA序列比对序列比对NCBI中选取中选取17株的株的DHA-1和和1株的株的DHA-2序列进行比对。序列进行比对。文献中文献中DHADHA引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeDHA-uniDHA-1-S1DHA-1-ASGTTACTCACACACGGAAGGTTTTTATAGTAGCGGGTCTGG1485-15042334-2353(DHA(1)869DHA-1DHA-1XF2DHA-1XRAACGTCTGACCATAATCCACGCCCATAAAGCAAATTATTG1390-1409不匹配(DHA(1)1081Target 里面的里面的“uni”全称是全称是“universal”，表明该基因对应的通用引，表明该基因对应的通用引物。物。AmpC(FOX)AmpC(FOX)序列比对序列比对选取肺炎克雷伯选取肺炎克雷伯FOX-1,57,9各一条序列进行比对。各一条序列进行比对。OKPOKP序列比对序列比对12株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OKP-A序列。序列。选取肺炎克雷伯选取肺炎克雷伯OKP-B序列序列11条和条和OKP-B-13，14各一条进行比对。各一条进行比对。文献中文献中OKP-AOKP-A和和OKP-BOKP-B引物引物文献中的引物均不能与比对文件匹配！OXAOXA序列比对序列比对选取肺炎克雷伯选取肺炎克雷伯OXA-1（13株），株），OXA-4（1株），绿脓株），绿脓（PA）OXA-30（2株）进行比对。株）进行比对。2株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OXA-21株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OXA-10和和1株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OXA-172株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OXA-483株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯OXA-73文献中文献中OXAOXA引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeOXA-uniOXA-1-S1OXA-1-ASAGCCGTTAAAATTAAGCCCCTTGATTGAAGGGTTGGGCG1927-19452836-2835（OXA-1，4，30）908OXA-10OXA-10F2OXA-10RTCTTTCGAGTACGGCATTAGCCCAATGATGCCCTCACTTTCC2752-27723490-3510(OXA-10,17)760AmpC(LEN)AmpC(LEN)序列比对序列比对选取选取LEN-1-like(2株株)，LEN-2（1株），株），LEN-3（3株），株），LEN-4（2株），株），LEN-5（1株），株），LEN-25（1株），不知类型的株），不知类型的LEN（2株）进行比对。株）进行比对。IMPIMP序列比对序列比对选取肺炎克雷伯菌选取肺炎克雷伯菌IMP-4（3株），株），IMP-8（2株），株），IMP-13（1株），株），IMP-10（1株），株），IMP-38（1株），铜绿的株），铜绿的IMP-1（7株）进行比对。株）进行比对。文献中文献中IMPIMP引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeIMP-uniF1RCATGGTTTGGTGGTTCTTGTATAATTTGGCGGACTTTGGC2274-22932702-2721448IMP-1F2RCTACCGCAGCAGAGTCTTTAACCAGTTTTGCCTTACCA2167-21852735-2753586SHVSHV序列比对序列比对 选取肺炎克雷伯选取肺炎克雷伯SHV-1（28株），株），SHV-2（11株），株），SHV-2a(2株株)，SHV-5（27株），株），SHV-11（64株），株），SHV-12（22株），株），SHV-25（1株），株），SHV-26（2株），株），SHV-27(2株株)，SHV-28（7株），株），SHV-36（1株），株），SHV-40（2株），株），SHV-55（3株），株），SHV-60（2株），株），SHV-62（1株），株），SHV-103(1株株)进行比对。进行比对。文献中文献中SHVSHV引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeSHV-uniF1RTTATCTCCCTGTTAGCCACCGATTTGCTGATTTCGCTCGG1240-12592020-2039799SHV-uniS12S2ATTTGTCGCTTCTTTACTCGCTTTATGGCGTTACCTTTGACC1162-11822196-22161054Shv-5SHV-A3SHV-BACTGAATGAGGCGCTTCCCGCACCCCGCTTGCT1709-17261920-1934220CTX-MCTX-M序列比对序列比对选取肺炎克雷伯CTX-M-2（9株），CTX-M-3（12株），CTX-M-12（2株），CTX-M-15（55株），CTX-M-22（2株），CTX-M-24（1株），CTX-M-28（3株），CTX-M-32（1株）序列进行比对。跟上面大文件未对其，单独拿出比对的9条CTX-M-15。8条CTX-M-14（未能和大文件比对整齐而单独比对）和2条由国内毕业论文发现的两条新CTX-M（new）。文献中的文献中的CTX-MCTX-M引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeCTX-M-uniCTX-M-F1CTX-M-RTCTTCCAGAATAAGGAATCCCCCGTTTCCGCTATTACAAAC3353-33734242-4261(CTX-M)908CTX-M-uniCTX-M/F2CTX-M/RTTTGCGATGTGCAGTACCAGTAACGATATCGTTGGTGGTGCCATA3578-36004100-4121(CTX-M)543CTX-M-uniCTX-MB3CTX-MACGCTTTGCGATGTGCAGACCGCGATATCGTTGGT3575-35914109-4125(CTX-M)550CTX-M-1 clusterCTX-M13 Up3CTX-M13 LowGGTTAAAAAATCACTGCGTCTTGGTGACGATTTTAGCCGC3376-33954220-4239(CTX-M)863CTX-M-9 clusterCTX-M9 Up3CTX-M9 LowATGGTGACAAAGAGAGTGCACCCTTCGGCGATGATTCTC3374-33934225-4243(CTX-M)865unknowCTX-M-9-S4CTX-M-9-ASTATTGGGAGTTTGAGATGGTTCCTTCAACTCAGCAAAAGT1655-16742568-2587(CTX-M-14)932unknowCTX-M-3-S4CTX-M-3-ASCGTCACGCTGTTGTTAGGAAACGGCTTTCTGCCTTAGGTT180-199不匹配(CTX-M-15（3）)780氨基糖苷类耐药基因氨基糖苷类耐药基因氨基糖苷修饰酶基因比对氨基糖苷修饰酶基因比对选取肺炎克雷伯选取肺炎克雷伯aac(6)-Ib-cr（1株），阴沟肠杆菌株），阴沟肠杆菌aac(6)-Ib-cr（4株）一起比对。株）一起比对。2株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯AAC(3)-II(aacC2)ANT(3)-I(aadA1,2,8)ANT(3)-I(aadA5)3株株 aac(6)-I(aacA1)13株株 aac(6)-I(aacA4)8株肺炎克雷伯株肺炎克雷伯ant(2)-Ia(aadB)16S甲基化酶基因比对3株株armA5株株rmtB文献中氨基糖苷耐药基因引物文献中氨基糖苷耐药基因引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeaac(6)-IbACC(6)-B-F1ACC(6)-B-RTTGCGATGCTCTATGAGTGGCTACTCGAATGCCTGGCGTGTTT2058-20802520-2539(aacA4)481aac(6)-IbF2RTTGCGATGCTCTATGAGTGGGCGTGTTCGCTCGAATGCC2058-20772530-2548(aacA4)491aac(3)-IIP13P2ACTGTGATGGGATACGCGTCCTCCGTCAGCGTTTCAGCTA160-179377-396237aac(6)-IP13P2TATGAGTGGCTAAATCGACCCGCTTTCTCGTAGCA2089-20862447-2463394ant(3)-P13P2TGATTTGCTGGTTACGGTGACCGCTATGTTCTCTTGCTTTG5174-5194不匹配(aadA1,2,8)284TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeant(2)-P13P2GAGCGAAATCTGCCGCTCTGGCTGTTACAACGGACTGGCCGC408-428707-727320rmtBRMTB-F4RMTB-RCCCAAACAGACCGTAGAGGCCTCAAACTCGGCGGGCAAGC5052-50715617-5636584喹诺酮耐药基因比对喹诺酮耐药基因比对质粒介导喹诺酮耐药基因比对质粒介导喹诺酮耐药基因比对qnrA1,7qnrA-likeqnrB4qnrB1,10,42,53qnrB6文献中文献中qnrqnr引物引物TargetNameSequence(53)LocationProduct sizeQnrSQnrS-A1QnrS-BCAATCATACATATCGGCACCAGTTCTTGCTGCCAGGCTGC5165-51845751-5770(qnrS1)605QnrBQnrB-A1QnrB-BATGACGCCATTACTGTATAAGATCGCAATGTGTGAAGTTT5270-52895812-5831(qnrB1,10,42,53)562QnrAF2RGCAAGAGGATTTCTCACGCCAGGCAGTCGCGGGAGAAGGTGCCG9006-90289462-9482(qnrA1,7)477QnrBF2RATGGCTCTGGCACTCGTTGGTCCATGAGCAACGATGCCTGG5306-53255902-5922(qnrB1,10,42,53)617参考文献参考文献1周庭银.临床微生物诊断与图谱M.上海：上海科学技术出版社，2007.155-158,210-212.2 Prathiba Kurupati,Carol Chow,Gamini Kumarasinghe,et al.Rapid Detection of Klebsiella pneumoniae from Blood Culture Bottles by Real-Time PCRJ.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Mar.2004,p.13371340.3 Gladys Penn Siri,Nomathamsanqa Patricia Sithebe and Collins Njie Ateba.Identification of Klebsiella species isolated from Modimola dam(Mafikeng)North West Province South AfricaJ.African Journal of Microbiology Research Vol.5(23),pp.3958-3963,23 October,20114 A.Neuberger,I.Oren,and H.Sprecher.Clinical Impact of a PCR Assay for Rapid Identification of Klebsiella pneumoniae in Blood 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