第二章 药物分析方法—分析化学部分.ppt

第二章第二章 药物分析方法药物分析方法 分析化学部分分析化学部分长春中医药大学一、柱色谱的实验操作一、柱色谱的实验操作5.3 5.3 经典液相色谱法经典液相色谱法(二二)、加样、加样(三三)、洗脱与馏分的收集、洗脱与馏分的收集(一一)、装柱、装柱内径内径:柱长柱长=1:1020湿装法和干装法湿装法和干装法体积小体积小等份收集等份收集(四四)、化合物的检出、化合物的检出二、薄层色谱法二、薄层色谱法(thin layer chromatography；TLC)v固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）比较进行定性定量。照物质）比较进行定性定量。（一）定性参数（一）定性参数v比移值比移值(Rf值值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比？）（速度之比？）Rf=L/L0 （定时展开）定时展开）L为原点（为原点（origin）至斑点中心的距离，至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（为原点至溶剂前沿（solvent front）的距离的距离 v与组分及色谱条件有关与组分及色谱条件有关 相对比移值相对比移值(relative Rf；Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)v与组分、色谱条件、参考物质有关。与组分、色谱条件、参考物质有关。vRr值可以大于值可以大于1，也可以小于，也可以小于1。v重现性和可比性均比重现性和可比性均比Rf值好，能消除系值好，能消除系统误差（统误差（参考物质与组分在完全相同的参考物质与组分在完全相同的条件下展开）条件下展开）（二）吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂（二）吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂v吸附剂吸附剂v1.硅胶硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理：硅醇基原理：硅醇基(吸附中心吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等v活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。v活化：加热至活化：加热至100左右，除去吸附水提高活度左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）注意温度不可过高）v分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。v2.氧化铝氧化铝 碱性氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合物，分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳定的化合物；分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。活度也与含水量有关。v展开剂展开剂(流动相流动相)极性强的溶剂洗脱能力强极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：常用溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳甲苯苯三氯乙烷四氯化碳 环己烷环己烷 石石油醚。油醚。v展开剂展开剂选择原则：选择原则：根据被分根据被分离物质的极性离物质的极性StahlStahl简图：极性物简图：极性物质质活度低（活性活度低（活性级大）的吸附剂级大）的吸附剂-极性展开剂极性展开剂 混合溶剂混合溶剂先用单一溶剂展开，先用单一溶剂展开，若若R Rf f值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，乙醇、丙酮等，如果如果R Rf f值太大，则加入适量极性弱的溶剂值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如如环己烷、石油醚等环己烷、石油醚等)，以降低极性。，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。使斑点集中。（三）薄层色谱操作方法（三）薄层色谱操作方法v制板均匀制板均匀v点样集中点样集中v展开展开(多种方式多种方式)预饱和预饱和v显色显色（四）定性和定量分析（四）定性和定量分析v定性分析定性分析 v比较比较Rf值或值或Rr值值、斑点颜色或荧光斑点颜色或荧光v常采用已知标准物质对照（同一板上展开）常采用已知标准物质对照（同一板上展开）v多种展开系统的多种展开系统的Rf值与对照品一致值与对照品一致。v定量分析定量分析v洗脱法洗脱法v直接定量法直接定量法1.1.目视比较法（目视比较法（如杂质限度检查方法如杂质限度检查方法）2.2.薄层扫描法薄层扫描法5.4 5.4 高效液相色谱法高效液相色谱法high performance liquid chromatograpphy,HPLC 高效液相色谱法是采用高压输液泵将具高效液相色谱法是采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。经由进样阀注入的供试品，有流动相经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。理系统记录色谱信号。一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、流程及主要部件二、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程2.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：(3)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(4)液相色谱检测器液相色谱检测器 a.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线形范围高；线形范围高；流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm，容积容积 8L）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。三、化学键合色谱法（三、化学键合色谱法（BPC）1.反相键合色谱法（反相键合色谱法（RBPC）固定相固定相：十八烷基（：十八烷基（ODS或或C18）键合相键合相 流动相流动相：甲醇：甲醇-水；乙腈水；乙腈-水水 分离原理分离原理：疏溶剂理论、双保留机制、顶：疏溶剂理论、双保留机制、顶替吸附替吸附液液相相互作用模型等。相相互作用模型等。化学键合固定相化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN流动相极性与容量因子的关系：流动相极性与容量因子的关系：底剂：水底剂：水 极性增大，洗脱能力降低，极性增大，洗脱能力降低，k?应用应用：用于分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。：用于分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。2.正相键合色谱法正相键合色谱法固定相固定相：氰基与氨基键合相：氰基与氨基键合相流动相流动相：正己烷：正己烷+极性溶剂极性溶剂分离原理分离原理：固定相与溶质分子间的取向力、诱导力、氢键：固定相与溶质分子间的取向力、诱导力、氢键力。力。流动相极性与容量因子的关系：流动相极性与容量因子的关系：极性增大，洗脱能力增加，极性增大，洗脱能力增加，k?氨基键合相色谱柱主要要用于糖类的分离。氨基键合相色谱柱主要要用于糖类的分离。3.离子抑制色谱法离子抑制色谱法1.适用范围适用范围：3.0 PH 7.0的弱酸及的弱酸及7.0 PH 8.0的弱碱。的弱碱。2.抑制剂抑制剂：向流动相中加少量弱酸、弱碱或缓冲：向流动相中加少量弱酸、弱碱或缓冲盐为抑制剂，调节盐为抑制剂，调节pH，抑制样品的解离。抑制样品的解离。3.容量因子及影响因素容量因子及影响因素：弱酸：弱酸：PH小于小于pka时，组分以分子形式存在为时，组分以分子形式存在为主，主，k大。大。弱碱：情况相反。弱碱：情况相反。4.4.离子对色谱离子对色谱ion pair chromatography 原原理理：将将一一种种（或或多多种种）与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（对对离离子子或或反反离离子子）加加到到流流动动相相中中使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成疏疏水水性性离离子子对对化化合合物物，使使其其能能够够在在两两相相之之间间进进行行分配；分配；阴阴离离子子分分离离：常常采采用用烷烷基基铵铵类类，如如氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳离离子子分分离离：常常采采用用烷烷基基磺磺酸酸类类，如如己己烷烷磺磺酸酸钠钠作作为对离子；为对离子；四、色谱法的应用四、色谱法的应用采用峰面积法或峰高法采用峰面积法或峰高法(1)内标法内标法(2)外标法外标法v1 1 定性分析定性分析v2 2 定量分析定量分析外标法外标法标准曲线法标准曲线法用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变 长春中医药大学外标法外标法外标一点法外标一点法 当外标试样中各组分浓度变化范围不大时，可不必绘制标准曲线，而用单点校正法，即配制一个和被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，由被测组分和外标组分的峰面积或峰高比来定量WiWiWsWs=AiAiAsAs长春中医药大学内标法内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应的峰面积比，求出含量m mi i=f=fi iA Ai im ms s=f=fs sA As sm mi im ms s=f fi iA Ai if fs sA As s长春中医药大学内标校正曲线法和内标对比法内标校正曲线法和内标对比法配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，进样分析，测得Ai和As，以 A i/A s对 对 照 溶 液 浓 度 作 图。（Ai/AsAi/As）样样=C Ci i 样样（Ai/AsAi/As）标标C Ci i 标标v气相色谱法与高效液相色谱法的定性参数是（），气相色谱法与高效液相色谱法的定性参数是（），定量参数是（）薄层色谱法的定性参数是（）。定量参数是（）薄层色谱法的定性参数是（）。气相色谱仪和高效液相色谱仪的组成气相色谱仪和高效液相色谱仪的组成简述气相色谱法和高效液相色谱法的主要异同点简述气相色谱法和高效液相色谱法的主要异同点薄层色谱法中，比移值的最佳范围是（）薄层色谱法中，比移值的最佳范围是（）v化合物化合物A 在薄层板上从原点迁移在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿，溶剂前沿距原点距原点16.2cm，计算化合物，计算化合物A的的Rf值。若在相同溶值。若在相同溶剂系统中，溶剂前沿距原点剂系统中，溶剂前沿距原点14.3cm，化合物，化合物A的斑的斑点应在薄层板上何处？点应在薄层板上何处？v精密称取黄芩颗粒精密称取黄芩颗粒0.1255g置置50ml容量瓶中，外标容量瓶中，外标法测定黄芩颗粒中黄芩素的含量，测得对照品溶液法测定黄芩颗粒中黄芩素的含量，测得对照品溶液（5.98ug/ml）和供试品溶液的峰面积分别为：）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。