免疫检测技术的基本原理.ppt

第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原.将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测.免疫学检测技术的优点高度的灵敏性高度的特异性.免疫分析技术的应用常用的诊断技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术.凝集试验概概念念：颗颗粒粒性性抗抗原原(细细菌菌、红红细细胞胞等等)与与相相应应抗抗体体结结合合，在在一一定定条条件件下下出出现现肉肉眼眼可可见见的的凝凝集集物物，称为凝集反应。称为凝集反应。1.1.直接凝集反应直接凝集反应抗抗原原与与抗抗体体直直接接混混合合作作用用，出出现现凝凝集集为为阳阳性性结果。结果。玻片直接凝集法：定性试验玻片直接凝集法：定性试验试管直接凝集法：半定量试验试管直接凝集法：半定量试验.试管法半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验+玻片直接凝集试验玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512.2.2.间接凝集法间接凝集法先先将将可可溶溶性性抗抗原原或或抗抗体体吸吸附附在在颗颗粒粒载载体体上上(如如RBC,RBC,乳乳胶胶颗颗粒粒)，再再与与相相应应抗抗体体或或抗抗原反应，出现凝集为阳性结果。原反应，出现凝集为阳性结果。临临床床常常用用的的有有间间接接血血凝凝试试验验、乳乳胶胶凝凝集集试试验等。验等。+待检样品待检样品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳胶颗粒或乳胶颗粒反应凝集物反应凝集物.3.3.间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验先先将将待待检检抗抗原原与与已已知知的的抗抗体体反反应应，再再加加入入用用已已知知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测例：乳胶凝集抑制试验检测HCG(HCG(妊娠诊断妊娠诊断)步步骤骤1 1：将将已已知知抗抗体体与待检标本混匀与待检标本混匀 步步骤骤2 2：加加入入抗抗原原吸吸附的乳胶颗粒混匀附的乳胶颗粒混匀 抗抗原原吸吸附附乳胶颗粒乳胶颗粒结果判断：结果判断：不不凝凝集集为为阳性结果阳性结果已知抗体已知抗体待检标本待检标本.凝集反应凝集反应.2.沉淀反应沉淀反应 概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。现沉淀物称沉淀反应。类型：类型：单向免疫扩散单向免疫扩散免疫比浊法免疫比浊法双向免疫扩散双向免疫扩散对流免疫电泳对流免疫电泳.单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验.双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验.对流免疫电泳对流免疫电泳.测吸光度测吸光度计算抗原计算抗原或抗体的或抗体的含量含量抗体抗体抗原抗原免疫复合物的免疫复合物的浓度与透射光浓度与透射光的衰减呈正相的衰减呈正相关关免疫比浊法原理免疫比浊法原理.3.中和反应中和反应 如抗如抗“O”试验试验4.免疫标记技术免疫标记技术 概念：用荧光素、酶、同位素等概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。常用抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。放射免疫检测技术等。特点：敏感、特异、快速，能定特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。性、定量、定位。.免疫标记技术酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术.酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者年瑞典学者Engvail和和Perlmann,荷兰学者荷兰学者Van Weerman和和Schuurs分分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).酶及其底物酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原半抗原在交联剂作用下联结的产物。是在交联剂作用下联结的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应.酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 .2、标记方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法.戊二醛交联法戊二醛交联法(一步法）一步法）抗体-NH2 +COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环.标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度.ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA .（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原.获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定.间接法是检间接法是检测抗体最常用的方测抗体最常用的方法，其原理为利用法，其原理为利用酶标记的抗抗体以酶标记的抗抗体以检测已与固相结合检测已与固相结合的受检的受检抗体抗体，故称，故称为间接法。为间接法。（二）间接法（二）间接法.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法间接法).包被固相载体包被固相载体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定.（三）竞争法（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体量测定，也可用于测定抗体 。.用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量.对照管由于只加酶标抗原，与固对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。底物后显色反应较弱。.饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素简曲霉毒素 ）饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测.河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（FN FN）、）、甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（SOMAN SOMAN）、）、草不绿（草不绿（Alachor Alachor）、）、西维因（西维因（Carbaryl Carbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（Captan Captan）等）等。农药的检测农药的检测：.食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡萄球菌.转基因成份的检测：如转基因玉米中转基因成份的检测：如转基因玉米中中的中的cry9e蛋白蛋白转基因大豆中的转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质蛋白质肉制品的掺假检测：肉制品的掺假检测：以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为掺假率为1%时即可检出时即可检出食品其他检测食品其他检测：.荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法用用荧荧光光素素标标记记抗抗原原或或抗抗体体，再再与与标标本本中中抗抗体体或或抗抗原原反反应应，然然后后在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察，形形成成的的ICIC可可散散发发出出荧荧光光，对对标标本本中中的的抗抗原原或或抗抗体体进进行行测测定定和和定位。定位。常用的荧光素常用的荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)FITC)、藻红蛋白、藻红蛋白(PE)(PE)等。等。常用的方法常用的方法直接荧光法直接荧光法间接荧光法间接荧光法.免疫荧光技术免疫荧光技术.免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术直接法直接法直接法直接法Ag荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体特异性抗体组织切片组织切片.免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术间接法间接法间接法间接法Ag荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体组织切片组织切片待测抗体待测抗体.免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术.荧光显微镜荧光显微镜.荧光显微镜使用原理荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650.免疫金标记技术免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。.一、胶体金制备一、胶体金制备胶体金胶体金（colloidal gold）的制备一般采用的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。.胶体金的制备及特性胶体金的制备及特性胶体金粒径胶体金粒径1%1%柠檬酸钠加入量柠檬酸钠加入量胶体金特性胶体金特性（nm)nm)（ml)*ml)*呈色呈色lmax(nmlmax(nm)16162.00 2.00 橙色橙色51851824.524.51.50 1.50 橙红色橙红色52252241411.00 1.00 红色红色52552571.571.50.70 0.70 紫色紫色535535*还原还原100 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量.胶胶 体体 金金（Colloidal Gold）1560 nm优优 质质劣劣 质质.胶体金结合物胶体金结合物（Conjugate一、免疫渗滤测定一、免疫渗滤测定(IFA).斑点渗漏法其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2薄膜的质控点，是为金标二步法。.IFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原AB.IFA结果判断结果判断.二、免疫层析测定（二、免疫层析测定（ICA）.层析法将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。.兔抗鼠兔抗鼠IgG鼠抗鼠抗HCG单抗单抗金标鼠抗金标鼠抗HCG单抗单抗尿液浸湿标志线尿液浸湿标志线 手持端手持端斑点金免疫层析试验（一）斑点金免疫层析试验（一）.斑点金免疫层析试验（二）斑点金免疫层析试验（二）尿样尿样阳性阳性弱阳性弱阳性阴性阴性无效无效质控线质控线测试线测试线.ICA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原.ICA-竞争法测抗原免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图.ICA 竟争法结果观察竟争法结果观察 阴性阴性阳性阳性无效无效.ICA间接法测抗体间接法测抗体.ICA 结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无效无效.IFA与与ICA的比较的比较IFAIFAICAICA试剂形式试剂形式渗滤装置及附渗滤装置及附加试剂加试剂试剂条试剂条试剂保存试剂保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步骤操作步骤3 35 51 1观察时间观察时间3 min3 min3 320 min20 min阳性反应颜色阳性反应颜色浓度浓度操作结束颜色操作结束颜色不变不变颜色逐渐加深颜色逐渐加深.IFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW）1、罗立新,缪珑,潘力,等.快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究J.中国卫生检验杂志,2006,16(2):154-156.2、赖卫华,熊勇华,陈高明,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究J.食品科学,2005,26(5):204-207.3、谌志强,段惠莉,王新为,等.大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测J.中国公共卫生,2005,21(4):705-706.4、谢昭聪,宋志强,吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究J.中国国境卫生检疫杂志,2005,28(3):163-165.5、王中民,李君文,王新为,等.免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究J.微生物学免疫学进展,2001,29(4):45-47.6、刘永德,汪毅,陈禹雷,免疫金探针快速检测禽流感病毒研究J.上海交通大学学报:农业科学版,2005,23(3):321-324.斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验ADCB阴性（未怀孕）阴性（未怀孕）阳性（怀孕）阳性（怀孕）加尿样加尿样除去滤器除去滤器加胶体金标记抗体加胶体金标记抗体加洗涤液加洗涤液结果判定结果判定.免疫印迹法图解免疫印迹法图解SDS裂解裂解病毒病毒聚丙酰胺凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳-[phone]KD电转印至电转印至NC膜上膜上置待测血清中，漂洗；置待测血清中，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗；加底物加底物 显色显色120 41 24KD.第四节第四节 放射性核素标记技术放射性核素标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化.R：放射性核素示踪高灵敏高灵敏不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号号(标记物的放大效应标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异高特异废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体为结合剂为结合剂.常用标记方法常用标记方法1、常用放射性核素2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法）间接法（连接法）.直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T.间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP.间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白质H O H+NH2-蛋白质125I125I.标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）.结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法放射免疫分析法的原理与方法.液闪仪液闪仪.计数器计数器.化学发光标记免疫技术直接化学发光直接化学发光酶促化学发光特点酶促化学发光特点电化学发光特点电化学发光特点.标记免疫分析三方式与四环节三个方式 A、直接法 B、间接法 C、夹心法四环节为：四环节为：11、抗体生产、抗体生产22、标记试剂制备标记试剂制备33、分析方式设计分析方式设计44、分析信号检测、分析信号检测.免疫测定分类均相免疫测定 HOMOGENOUS IAHOMOGENOUS IA 在测定中结合的反应物(B)与游离的反应物(F)不需要分离 异相免疫测定 HETEROGENOUS IAHETEROGENOUS IA 在测定中需要分离(B)和(F).小结常用免疫测定方法标记免疫法测定的方法及原理标记免疫测定法的特点ELISA的方法及原理.作业1、何谓沉淀反应？何谓凝集反应？其抗原有特点？2、抗原抗体反应有何特性？3、抗原抗体反应的影响因素有哪些？4、常用的免疫标记技术有哪些？5、设计一ELISA试验来检测牛奶中黄曲霉毒素M1。.