基因工程的基本操作步骤-完整PPT.ppt

基因工程的基本操作步骤 思考思考:利用大肠杆菌产生人胰岛素的利用大肠杆菌产生人胰岛素的大致培育过程大致培育过程?基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取 主要是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。现代获取方法：现代获取方法：1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成初始目的基因的来源初始目的基因的来源从生物中直接获取人工合成1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库。提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库例：基因文库的构建方法之一例：基因文库的构建方法之一某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解例：基因文库的构建方法之一例：基因文库的构建方法之一基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别 文库类型文库类型文库类型文库类型 cDNA cDNA文库文库文库文库 基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的动作用的动作用的DNADNA片段）片段）片段）片段）基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子(位于编位于编位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNADNA片段）片段）片段）片段）基因多少基因多少基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以怎样从基因文库中得到我们所需要怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因呢？的目的基因呢？2、利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 多聚酶链式反应，在生物体外复制特定多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以在短时间内获得大片段的核酸合成技术。可以在短时间内获得大量目的基因。量目的基因。可以在短时间内获得大量目的基因。复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因将目的基因导入动物细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。三、将目的基因导入受体细胞终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录目的基因与载体的结合和导入上是否插入了目的基因三、将目的基因导入受体细胞借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。基因工程的基本操作步骤反转录法：cDNA的合成流程图解循环循环变性变性退火退火延伸延伸(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构三、将目的基因导入受体细胞复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于 ()终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录四、目的基因的检测与鉴定cDNA文库将目的基因导入植物细胞3、检测目的基因是否翻译成蛋白质2、利用PCR技术扩增目的基因三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定提取某种生物的全部DNA基因表达载体的构建-核心基因工程的基本操作步骤用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建-核心核心复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标志基因标志基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法农杆菌转化法农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体表达载体与感受态细胞混合与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 (关键步骤关键步骤).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分子杂交技术分子杂交技术方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗原抗体杂交抗体杂交基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点复制原点 +目的基因目的基因 +启动子启动子 +终止子终止子 +标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、感受态细农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、感受态细胞法胞法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定巩固练习巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗该抗性基因的主要作用是性基因的主要作用是 ()A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于限制性内切酶主要用于 ()A.目的基因的提取和导入目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合目的基因的提取与载体结合BD感谢观看感谢观看