蛋白质糖基化的研究和进展教育课件.ppt

蛋白质糖基化的研究和蛋白质糖基化的研究和进展进展PPTPPT讲座讲座1 概 述1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上发表题为“糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学”（glycomics)的研究美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究“功能糖组学”研究目标 基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化是最主要的翻译后修饰之一。阐阐明由蛋白明由蛋白质质-糖糖链链所所介介导导的的细细胞通胞通讯讯机制机制糖组学研究的重心便是蛋白糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。质糖基化的研究。蛋白质糖基化研究的基本目标是：蛋白质糖基化研究的基本目标是：寻寻找找编码编码糖蛋白的基因糖蛋白的基因寻寻找糖基化位点找糖基化位点解析糖解析糖链链及糖基化及糖基化肽肽段的段的结结构构研究糖基化的功能研究糖基化的功能基因组信息糖基化位点信息结构信息功能信息现代分子生物学的中心法则：蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化糖链的多样性和复杂性糖链的多样性和复杂性“连接方式异构体”“分枝形成”2 蛋白质糖基化的分类1O-糖基化糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 等侧链的羟基处2N-糖基化糖基化:糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处3GPI-Anchor糖基化糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。3 蛋白质糖基化常用研究方法蛋白质糖基化常用研究方法 因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需要多种方法组合完成。糖基化位点分析糖基化蛋白分析糖链分析糖蛋白糖链释放单糖分析蛋白酶水解去糖基蛋白氨基酸分析糖链糖基肽肽链糖链释放氨基酸序列分析去糖基肽链糖链分馏/纯化 结构分析酶解糖基肽/寡糖多糖图谱质谱核磁共振蛋白质糖基化的研究策略1.凝胶技凝胶技术术与与质谱联质谱联用用2.非凝胶技非凝胶技术术与与质谱联质谱联用用3.O-GlcNAc 糖基化研究糖基化研究细胞组织双向电泳切割切割酶切酶切质谱分析质谱分析 糖链鉴定糖链鉴定 数据库搜索数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能分析靶蛋白鉴定及功能分析与磷酸化之间存在“阴阳”关系 可以被筛选和鉴定O-GlcNA pr亲和层析亲和层析母离子扫描母离子扫描 366数数据据库库搜搜索索 鉴鉴定定4 糖基化蛋白质的分离技术蛋白质混合物 分离纯化糖蛋白 糖肽 凝集素 ConA 是一种典型的对于一系列高甘露糖型的是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链具连接糖链具有高亲和性的植物凝集素，有高亲和性的植物凝集素，同时也能结合复杂型的同时也能结合复杂型的N-连接糖链及双分枝的复杂型的连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链连接糖链Mana1-6(Mana1-3)Man较强Mana1-2Mana1-6(Mana1-3)Man最强缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH，6-OH取代基团的Mana（1-6）较弱 Galectin LEC-6 PNA 半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且具有分枝结构的N-连接糖链花生凝集素是花生凝集素是组织组织化学中用于化学中用于检测检测T抗原的。抗原的。T抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白A）可广泛可广泛结结合于存在合于存在O-连连接糖接糖链链的的T抗原上抗原上5 糖基化蛋白的检测技术1 荧光染色检测法 丹磺酰肼 检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白 绿色荧光蛋白 即 Pro-Q Emerald 300 染色剂 SYPRO Rubby Pro-Q Emerald 4882 与凝集素联用的检测方法 蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育，再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入显色试剂进行检测。6 质谱在蛋白质糖基化研究中的应用1 位点分析 a 特征离子检测 寻找糖基特征离子，进而确定糖肽 如 NacGlc 特征离子为 m/z 204 b 酶处理前后酶解肽谱比对 在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽，根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点2 糖链组成，连接顺序及连接方式的分析 ESI 串联质谱可以MS 和MS/MS谱图进行解析 离子肼和FTICR在分析糖链结构方面有其独特优势 Cancilla 利用碱性降解和MALIDY-FT-MS 成功分析了寡糖连接方式质量数推断质量数推断对对于同于同质质量异构的糖基无法分辨（量异构的糖基无法分辨（Man/Glu)利用利用 外切糖苷外切糖苷酶酶处处理后，再分析理后，再分析具体的糖具体的糖链结链结构构还还需需进进行衍生化。（甲基化，行衍生化。（甲基化，还还原胺化原胺化）增增强强疏水性和离子化能力疏水性和离子化能力Q-TOF-MS 高分辨高分辨 高高灵敏度灵敏度 高精确度高精确度 母离子母离子扫扫描描 HexNAc+(m/z 204)HexHexNAc+(m/z366)MALDI-TOF-MS 能方便的能方便的检测检测出衍生或未衍生的寡糖出衍生或未衍生的寡糖 可以直接分析分子可以直接分析分子质质量量较较大大的糖蛋白，并分辨不均一性的糖蛋白，并分辨不均一性展 望 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不断的被采用。断的被采用。随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热点点主要参考文献1 夏其昌 曾嵘等 蛋白质化学与蛋白质组学 科学出版社 20042 Hirabayashi J,etc JCB 2002,771(1-2):67-873 Hirabayashi J,etc Trends Glycosci Glyco,2000,20(6):286-2874 Courtenay Hart etc Electrophoresis 2003,24,5885985 Cristian I.Ruse etc Anal.Chem.2002,74,1658-16646 STEVEN A etc Protein Science(1993),2,183-196.7 Benjamin L.etc Anal.Chem.2002,74,6088-60978 Wei Li,etc Anal.Chem.2002,74,5701-57109 Rong Zeng,etc Eur.J.Biochem.266,352-358(1999)10 Pauline M.etc Proteomics 2001,1,28529411Schulz BL etc Anal Chem,2002,74:6088-609712Robbe C,etc Biochem J 2004 Dec1;384：307-16 13Suzuki,etc,Anal Chem,2006 Apr 1;78(7):2239-2243 14Sparbier K，etc J Biomol Tech.2005 Dec;16(4):407-13 15Fukui etc,Nat Biotechol,2002,20:1011-1077谢谢 谢谢