微生物遗传.ppt

基因重组基因重组（gene recombination）：将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(gene recombination)或遗传重组。重组重组：遗传物质在分子水平分子水平上发生的交换；杂交杂交：在细胞水平细胞水平上遗传物质的交换.杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。原核生物的基因重组类型原核生物的基因重组类型 4种形式：种形式：1）转化）转化 2）转导）转导 3）接合）接合 4）原生质体融合）原生质体融合一、一、转化（转化（transformation）定义定义：受体细胞直接吸收供体细胞的受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段片段,并与其染色体并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。状的现象。转化子（转化子（transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细经转化后出现了供体性状的受体细胞称为胞称为转化子转化子，即转化成功的菌落。即转化成功的菌落。目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。感受态的机理研究：感受态的机理研究：局部原生质体化假说：局部原生质体化假说：处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜能顺利经膜进入菌体。进入菌体。酶受体假说：酶受体假说：受体细胞表面出现了一种能结合受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。并使之进入细胞的酶。2.转化模型转化模型 （1）转化因子）转化因子 本本质质是是离离体体的的DNA片片断断或或质质粒粒DNA DNA。转转化化因因子子进进入入细细胞胞前前还还会会被被酶酶解解成成更更小小的的片片段段，约约8kb。在在不不同同的的微微生生物物中中，转转化化因因子的形式不同，子的形式不同，dsDNA,ssDNA.dsDNA,ssDNA.革革兰兰氏氏阴阴性性的的嗜嗜血血杆杆菌菌中中，细细胞胞只只吸吸收收dsDNAdsDNA形形式式的的转转化化因因子子，但但进进入入细细胞胞后后需需经经酶酶解解为为ssDNAssDNA，才才能能与与受受体体菌菌的的基基因因组组整整合；合；革革兰兰氏氏阳阳性性的的链链球球菌菌和和芽芽孢孢杆杆菌菌中中，dsDNAdsDNA的的一一条条链链必必须须在在胞外降解，只有胞外降解，只有ssDNAssDNA形式的转化因子才能进入细胞。形式的转化因子才能进入细胞。但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNAdsDNA。由由于于每每个个细细胞胞表表面面能能与与转转化化因因子子相相结结合合的的位位点点有有限限（如如肺肺炎炎链链球球菌菌约约1010个个），因因此此，从从外外界界加加入入无无关关的的dsDNAdsDNA就就可可竞竞争争并并干扰转化作用。干扰转化作用。质质粒粒DNA也也是是良良好好的的转转化化因因子子，但但它它们们通通常常并并不不能能与与核核染染色体组发生重组。色体组发生重组。转化的频率通常为转化的频率通常为0.11，最高为，最高为20。(2)转化过程 供体供体(strR)ds DNA感受态受体感受态受体(strS)酶解与吸收单链酶解与吸收单链同源区段配对同源区段配对单链整合单链整合复制与分离复制与分离转化子转化子(strR)非转化子非转化子(strS)肺炎链球菌转化的主要过程肺炎链球菌转化的主要过程 转化因转化因子进入子进入细胞细胞 转化因转化因子单链子单链配对与配对与整合整合 复制复制 分离分离 自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化形成转化子效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救b）不需要活的DNA给体细胞；定义：定义：噬菌体噬菌体DNA被感受态细胞摄取并被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。产生有活性的病毒颗粒。4.转染转染(transfection)：现在把现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入微生以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：特点：5、人工转化、人工转化用CaCl2处理细胞，处理细胞，PEG介导、电穿孔、基因枪法介导、电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过DNA）。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高（不像线型DNA 那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的DNA 将其连接到质粒上都能进入受体细胞）.二、转导（二、转导（transduction）转导：转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子转导子（transductant）携带供体部分遗传物质携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为片段）的噬菌体称为转导噬菌体。转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导1、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。转导。(1)意外的发现 1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌LT22A(trp-)（P22）和LT2(his-)进行实验：用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌LT22A(trp-)是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2(his-)是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型)（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）(2)转导模型转导噬菌体为什么转导噬菌体为什么“错错”将宿主的将宿主的DNADNA包裹进去包裹进去?噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8 形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染色体通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其携不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导这种转导被称为流产转导.2.局限转导（局限转导（restricted transduction）定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因 组整合、重组，形成转导子的现象。媒介：部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被 同等长度的宿主基因所取代）只能转导个别特定基因 大肠杆菌中大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程乳糖基因转导噬菌体的形成过程低频转导（低频转导（LFT）的定义的定义:诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（10-6）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过频率不过10-6 ，称为低频转导称为低频转导。高频转导高频转导(HFT):如果细菌染色体中整合有一个正常的噬菌体时，缺陷噬菌体也能整合到同一细菌染色体上（因为正常噬菌体整合后，产生两个细菌/噬菌体杂合att位点，缺陷噬菌体可以在该位点插入），这种细菌称为双重溶源菌.双重溶源菌中，正常噬菌体称为辅助噬菌体，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。双重溶原菌在紫外辐射等因子的诱导下,原噬菌体容易被切割下来，产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。大肠杆菌的低频转导和高频转导比较：大肠杆菌的低频转导和高频转导比较：uv E.coli K12()LFT 裂解物 dgdg(10(10-5-5 1010-6-6)转导噬菌体 uv E.coli K12(/dgdg)HFT裂解物 50%(双重溶源菌双重溶源菌)50%50%dgdg转导噬菌体 低频率转导低频率转导（LFT）：LFT裂解物裂解物 E.coli gal E.coli gal-E.coli gal E.coli gal-/dgal+（极少量转导子菌落极少量转导子菌落)E.coli gal E.coli gal-高频率转导高频率转导(HFT)：HFT裂解物裂解物 E.coli gal E.coli gal-E.coli gal E.coli gal-/dgal+（50%50%转导子菌落转导子菌落)E.coli gal E.coli gal-（50%50%）普遍转导与局限转导的特性比较普遍转导普遍转导局限转导局限转导转导的发生转导的发生自然发生人工诱导（uv）噬菌体形成噬菌体形成误包前噬菌体的“误切”内含内含DNADNA只含宿主DNA含噬菌体和宿主DNA转导性状转导性状供体的任何性状前噬菌体两端邻近基因转导过程转导过程双交换（转导DNADNA 替换受体DNADNA 同源区）转导DNA插入，使受体菌为部分二倍体 溶源转变（lysogenic conversion）：一个与转导相似又不同的现象定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶源转变与转导的不同？溶源转变与转导的不同？a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；三、三、接合接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程1.接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）2.能进行接合的微生物种类能进行接合的微生物种类主要在细菌和放线菌中存在。在细菌中，G 细菌尤为普遍，如E.coli、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、固氮菌属和假单胞菌属等；放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（Streptomyces coeilcolor）。在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。在所有对象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli。E.coli 是有性别分化的，决定性别的是其中的F质粒，F质粒还是合成性菌毛基因的载体。3.大肠杆菌的接合型与接合大肠杆菌的接合型与接合 细菌遗传重组单向过程和F因子的提出 F菌株F菌株 Hfr菌株菌株F因子结构图:相对分子质量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。图中黄色区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上形成各种Hfr菌株。Hfr菌株:细胞中的F质粒整合到核染色体组上,与F 菌株相接合后，发生基因重组的频率比任何已知的F 与F 接合后的频率高出几百倍，这种“雄性”菌株称为Hfr。在Hfr菌株与F-细胞进行接合时,OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞大多数仍然是F-（即不能使受体菌变成供体）。接合中DNA转移过程有着稳定的速度和严格的顺序性。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中断杂交（interrupted mating）技术和基因定位利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。左图:不同Hfr菌株的形成方式，以不同的起点不同的顺序转移基因。（a）细菌染色体为环状，可以不同的IS位点打开，F质粒插入进去。（b）Hfr菌株的部分基因顺序。大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成基因定位：通过遗传重组等手段确定不同的基因在染色体上的位置及相对距离，从而获得遗传图谱。连锁的二基因间的距离与其共转化，或共转导的频率成反比，连锁的二基因间的距离与其共转化，或共转导的频率成反比，因此，可根据二个基因被因此，可根据二个基因被共转化或共转导共转化或共转导的频率判断它们在染色的频率判断它们在染色体上的相对距离。体上的相对距离。接合作用（中断杂交）作图只能判断相距较远的基因间的相对位置；转导、转化则可用于对相隔很近的基因进行定位；大肠杆菌遗传图谱目前对大肠杆菌的染色体已定位了1000多个基因F菌株菌株F菌株:Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。FF-与F+F-的不同：给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞细胞基因通过细胞基因通过F和和F-的接合而实现转移的过程常称为的接合而实现转移的过程常称为性导性导（sexduction）、F因子转导因子转导，或或F因子介导的转导（因子介导的转导（F-mediated transduction）。）。F所带的基因可以所带的基因可以与染色体发生重组；也可以继续存在于与染色体发生重组；也可以继续存在于F因子上。F质粒的四种存在方式及相互关系 接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(natural genetic transformation)：游离DNA分子+感受态细胞“接合接合”“转导转导”及“自然转化自然转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：a）外源DNA的来源及进入途径有差异；b）决定因素也各有不同；如何设计实验对三种途径进行区分？四、原生质体融合四、原生质体融合（protoplast fusion）1.定义：定义：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生 质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组 子的过程。子的过程。融合子（融合子（fusant）意义：意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。的优良性状，组合到一个单株中。两亲本菌株的选择和遗传标记的制作两亲本菌株的选择和遗传标记的制作（选择不同的营养缺陷型，（选择不同的营养缺陷型，（A:a+b-,B:a-b+）对药物抗性差异）对药物抗性差异）原生质体的制备原生质体的制备（高渗条件）（高渗条件）原生质体再生（测定再生率）原生质体再生（测定再生率）融合融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等）离心沉淀、电脉冲等）融合子的检出融合子的检出（直接检出法和间接检出法直接检出法和间接检出法）实用性菌株的筛选实用性菌株的筛选2.操作过程：操作过程：五、五、微生物的基因组结构微生物的基因组结构1.1.基因组（基因组（genomegenome）：）：指存在于细胞或病毒中的一整套遗传信息。指存在于细胞或病毒中的一整套遗传信息。（一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称）（一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称）原核生物，多为单倍体（在一般情况下只有一条染色体）真核微生物，通常为双倍体（多条染色体，啤酒酵母有16条染色体。）2.微生物与人类基因组计划微生物与人类基因组计划人类基因组计划（Human Genome Project）1985年提出；1990年正式开始实施；2001年2月，测序工作完成后基因组时代（Postgenome Era）微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。被选择进行全基因组测序的微生物：（1）人类基因组计划中的模式生物重要性）人类基因组计划中的模式生物重要性a）技术上从低等入手，建立技术、积累经验。技术上从低等入手，建立技术、积累经验。通过对基因组结构相对简单生物，特别是微生物基因组的测序，对大规模测序的策略及技术进行检验，积累经验；b）理论上利用基因组在进化上的连续性进行比较研究理论上利用基因组在进化上的连续性进行比较研究 通过对不同进化程度的基因组的分析、比较揭示更多的基本生物学信息。通过研究较为简单的基因组而解答复杂的人类基因组问题，被选择进行全基因组测序的微生物：（2）与人类生活关系密切的微生物）与人类生活关系密切的微生物（1）人类基因组计划中的模式生物重要性）人类基因组计划中的模式生物重要性医疗健康:重要的致病菌工业生产:工业生产菌农业种植:植物病原菌（3）对阐明生物学基本问题有价值的微生物）对阐明生物学基本问题有价值的微生物 一些古生菌：如Methanococcus jannaschii(詹氏甲烷球菌)等，它们是微生物世界多样性的代表，它们的序列比较有助于找出其进化关系。3.微生物基因组结构的特点微生物基因组结构的特点3.1 原核生物（细菌、古生菌）基因组原核生物（细菌、古生菌）基因组（1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。例外：布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的3.1 原核生物（细菌、古生菌）基因组原核生物（细菌、古生菌）基因组（1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；（2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。真核生物基因组的一个重要特点就是含有内含子个别细菌个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的和古生菌的rRNA和和tRNA的基因中也发现有内含子或间插序列的基因中也发现有内含子或间插序列3.1 原核生物（细菌、古生菌）的基因组原核生物（细菌、古生菌）的基因组（1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；（2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因组上遗传信息具有连续性；（3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构；（4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝；（5）基因组的重复序列少而短；）基因组的重复序列少而短；古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。操纵子（操纵子（operonoperon）：）：p195p195 功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因调节基因和一和一组共同的控制位点（组共同的控制位点（启动子、操纵基因启动子、操纵基因等）在基因转录时协同动作。等）在基因转录时协同动作。3.2 真核微生物（啤酒酵母）的基因组真核微生物（啤酒酵母）的基因组（1）典型的真核染色体结构；）典型的真核染色体结构；（2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。（3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；（4）重复序列多；）重复序列多；内含子（内含子（intron）:真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序 列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。外显子（外显子（exon）:真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序 列可被转录为RNA并进而翻译为蛋白质。4.基因组测序方法基因组测序方法全基因组鸟枪测序步骤：用超声波将基因组随机打断成相当小的片段，这些片段与质粒载体结合，产生质粒克隆文库。制备克隆和提纯DNA，然后进行测序。用专门的计算机程序将已测序的DNA片段通过片段之间核苷酸序列重叠的比较，可装配成比较长的DNA序列。重叠的大片段按合适的顺序排队，得到完整的DNA序列。DNA的自动测序结果的自动测序结果注：DNA自动测序是对Sanger方法的改进：(1)用不同颜色的荧光标记ddNTP；(2)4种反应混合进行，并一块进行电泳；(3)对凝胶上具有不同颜色的荧光带(a)进行扫描，可迅速确定待测DNA序列(b)。5.基因组序列的注释和意义基因组序列的注释和意义基因组序列注释的目标是确定特定基因在基因组图谱中位置。此外，还能提供一些关于转座因子、操纵子、重复序列及其他基因组特征的某些信息。流感嗜血菌的基因组测序结果和注释见下图。外同心圈用不同的颜色代表不同功能的编码区(例如，氨基酸的生物合成、能量代谢、复制、转录、翻译及调节功能等)；外圈周边显示的Nat I、Rsr II、Sam I等限制性酶切位点；从外数的第二圈显示高G+C含量和高A+T含量的区域；第三圈显示由噬菌体克隆所包含的片段；第四圈显示rRNA操纵子、tRNA和类似Mu原噬菌体；第五圈显示简单的串联重复序列和可能的复制起点和潜在的终止序列。第七节第七节 真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组真核生物的基因重组方式主要有以下四种：（1）有性杂交）有性杂交 （2）准性杂交）准性杂交 （3）原生质体融合 （4）转化 一一、有性杂交（、有性杂交（sexual hybridization）1.定义：不同遗传型两性细胞间发生的接合和 随之进行的染色体重组，进而产生新 遗传型后代的一种育种技术。凡能产有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈（Xun）菌，原则上都能应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。2.酵母菌的接合型遗传酵母菌的接合型遗传 单倍体可以是或a两种接合型的其中之一，一个单倍体酵母细胞是型还是a型是由其本身的遗传特性所决定的，是一种稳定的遗传特征。一种接合型的单倍体细胞有时会发生转变，即由型变成a型或再回到型。3.酿酒酵母的有性杂交育种程序：酿酒酵母的有性杂交育种程序：两亲本菌株的选择单倍体细胞的分离与验证单倍体细胞遗传标记的制作杂交杂合子的检出优良性状个体的筛选与性能测试 二、准性杂交二、准性杂交/生殖（生殖（parasexual hybridization /reproduction）1.定义定义：同种生物两个不同菌株的同种生物两个不同菌株的体细胞体细胞（即带有不同遗传（即带有不同遗传 性状的两个单倍体细胞或菌丝）性状的两个单倍体细胞或菌丝）经融合后，经融合后，不经减数不经减数 分裂分裂而导致低频率基因重组并产生重组子的生殖而导致低频率基因重组并产生重组子的生殖 方式。方式。准性生殖是丝状真菌，特别是不产生有性孢子的丝状真菌（半知菌亚门的真菌）特有的遗传现象。2.过程过程：1）菌丝联结；）菌丝联结；2）异核体的形成；）异核体的形成；（同时具有一个以上不同遗传型细胞核的细胞）3）核融合和杂合二倍体的形成；）核融合和杂合二倍体的形成；（细胞核中含有2个不同来源染色体组的菌体细胞。发生机会为百万分之一。）4）单倍体化）单倍体化 （杂合二倍体极不稳定，在其有丝分裂过程中，有极少数细胞，其同源染色体的两条染色单体之间发生交换，在体细胞分裂时，产生1个或1个以上标记的纯合现象从而形成新性状的单倍体杂合子。其单元化不是一次有丝分裂的结果，而要经过若干次有丝分裂过程，每次分裂都有可能从二倍体核中失去部分染色体，最后才回复成单倍体核。）3.有性生殖与准性生殖的比较比较项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理上有分化的性细胞独立生活的异核体阶段有无接合后双倍体的细胞形态与单倍体基本相同与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径通过有丝分裂通过减数分裂接合发生的几率偶然发生，几率低正常出现，几率低三、酵母菌的线粒体遗传三、酵母菌的线粒体遗传线粒体内含线粒体内含1个个DNA片段片段（核外遗传系统，为线粒体行使功能所核外遗传系统，为线粒体行使功能所需的需的rRNA、tRNA及某些酶如细胞色素、及某些酶如细胞色素、ATP合成酶编码），是合成酶编码），是一种细胞质遗传，也称非孟德尔遗传。一种细胞质遗传，也称非孟德尔遗传。酵母菌中酵母菌中典型的细胞质遗传典型的细胞质遗传现象是现象是小菌落突变型的遗传小菌落突变型的遗传：在培养的酵母群体中，常有在培养的酵母群体中，常有1%2%的细胞自发出现小菌落表型的细胞自发出现小菌落表型“小菌落小菌落”（呼吸缺陷型菌落）：（呼吸缺陷型菌落）：酵母菌由于线粒体DNA严重缺损或大部分丢失，缺失细胞色素a、b及细胞色素c氧化酶，即使在通气条件下，细胞生长也很缓慢，在葡萄糖培养基上只能形成小菌落。功能：功能：细胞呼吸作用的场所，为生命活动提供细胞呼吸作用的场所，为生命活动提供ATP。真核生物的真核生物的“动力车间动力车间”。中性小菌落(0 0)：+0 0：野生型:小菌落=4:0 抑制性小菌落(-)：+-：野生型:小菌落=0:4 分离型小菌落：野生型:小菌落=2:2 小菌落突变株小菌落突变株的三种类型：的三种类型：野生型mtDNA：(+)；中性小菌落(neutral petite)(0 0)：mtDNA全部丧失 抑制性小菌落(suppressive petite)(-)：mtDNA部分缺失突变分离型小菌落(segregational petite)：染色体基因突变鉴别方法：鉴别方法：基因工程定义：利用利用PCR扩增技术或在体外从某扩增技术或在体外从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组成重组DNA分子，再将其转入适当的受分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程主要由以下步骤组基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：成：载体和目的基因的分离；载体和目的基因的分离；载体载体和目的基因的切断；和目的基因的切断；载体和目的基因载体和目的基因的重组；的重组；重组重组DNA的转化和扩增；的转化和扩增；重组重组DNA的筛选和鉴定。的筛选和鉴定。基因工程三大理论DNA结构和中心法则的发现质粒的发现限制性内切酶的发现基因工程三大技术转化技术DNA体外重组技术琼脂糖凝胶电泳技术1.PCR技术现代基因操作技术现代基因操作技术2.DNA Shuffling技术基本原理：先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。一般通过23个循环，得到产物大幅度提高的重组突变体。全基因组改组：将DNA shuffling的多亲本体外重组的优点和传统的育种(细胞融合)相结合的全基因组体内改组技术。本章重点本章重点一、了解证明核酸是遗传变异物质基础的3个经典实验 比较：基因型与表型，变异与饰变 质粒的概念，特点及主要类型。二、基因突变和诱变育种二、基因突变和诱变育种 1.基因突变的类型 2.基因突变的规律 3.了解常用诱变剂及其诱变机制 4.艾姆氏法检测致癌剂的理论依据、方法和优点 5.了解诱变育种的主要环节及常用的初筛方法；掌握UV诱变育种的操作程序及注意事项。6.筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法，淘汰野生型的方法 7.抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。8.名词：营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基，完全培养基，补充培养基，点突变，转换，颠换，移码突变，染色体畸变，光复活作用 三、基因重组与杂交育种三、基因重组与杂交育种 1.了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。名词概念：转化，转染，转导，普遍转导，局限转导，低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导，Hfr菌株，溶源转变。比较：转化与转染，转导与性导，转导与溶源转变，普遍转导与局限转导，LFT与HFT 有性生殖与准性生殖，转化、转导、接合和原生质体融合 2.E.coli F+、F-、Hfr和F菌株的异同及相互间关系。3.原生质体融合的基本操作及优点。4.酿酒酵母有性杂交的育种程序。