微生物的实验室培养ppt.ppt

一、基础知识：一、基础知识：（一）培养基（一）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供供 生长繁殖生长繁殖使用的混合营养液。使用的混合营养液。培养基可分为培养基可分为固体培养基固体培养基和和液体培养基液体培养基。琼脂作琼脂作 2.2.不管哪种培养基，不管哪种培养基，一般都含有一般都含有 、源源、和、和 源源、等等营养物质，营养物质，另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对 、营养物质营养物质,例例如如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及、以及、等的要求。等的要求。1.1.培养基的类型培养基的类型微生物微生物水水碳碳氮氮无机盐无机盐pHpH特殊特殊氧气氧气凝固剂凝固剂 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基碳源碳源、氮源、磷酸盐和维生素、氮源、磷酸盐和维生素氮源氮源和维生素和维生素无机盐无机盐凝固剂凝固剂阅读“无菌技术”，回答下列问题：n获得纯净培养物的关键是获得纯净培养物的关键是 。n无菌技术包括：无菌技术包括：n（1 1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清清洁和洁和 ；n（2 2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具）将培养器皿、接种用具和培养基等器具n进行进行 ；n（3 3）为避免周围微生物污染，实验操作应在）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精酒精灯灯 旁进行；旁进行；n（4 4）避免已灭菌处理的材料用具与）避免已灭菌处理的材料用具与 相相接触。接触。消毒方法：消毒方法：n（1 1）日常生活经常用到的是）日常生活经常用到的是 消毒法；消毒法；100煮沸煮沸5-6minn（2 2）对一些不耐高温的液体，则使用）对一些不耐高温的液体，则使用 消毒法消毒法70-75下煮下煮30min或或80下煮下煮15minn（3 3）对接种室、接种箱或超净工作台）对接种室、接种箱或超净工作台n首先喷洒首先喷洒 等溶液以增强消毒效果，等溶液以增强消毒效果，然后使用然后使用 进行物理消毒。进行物理消毒。n（4 4）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用 进行消毒；进行消毒；n（5 5）饮水水源用）饮水水源用 进行消毒。进行消毒。消毒方法：消毒方法：n（1 1）日常生活经常用到的是）日常生活经常用到的是 煮沸煮沸 消毒法；消毒法；100煮沸煮沸5-6minn（2 2）对一些不耐高温的液体，则使用）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏巴氏 消毒法消毒法70-75下煮下煮30min或或80下煮下煮15minn（3 3）对接种室、接种箱或超净工作台）对接种室、接种箱或超净工作台n首先喷洒首先喷洒 石炭酸或煤酚皂石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，等溶液以增强消毒效果，然后使用然后使用 紫外线紫外线 进行物理消毒。进行物理消毒。n（4 4）实验操作者的双手使用）实验操作者的双手使用 75%酒精酒精 进行消毒；进行消毒；n（5 5）饮水水源用）饮水水源用 氯气氯气 进行消毒。进行消毒。灭菌方法：n（1 1）接种环、接种针、试管口等使用）接种环、接种针、试管口等使用 灭菌法；灭菌法；n（2 2）玻璃器皿、金属用具等使用）玻璃器皿、金属用具等使用 灭菌法，所用灭菌法，所用器械是器械是 干热灭菌箱干热灭菌箱 ；n（3 3）培养基、无菌水等使用）培养基、无菌水等使用 灭菌法，所用灭菌法，所用器械是器械是 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅 。灭菌方法：n（1 1）接种环、接种针、试管口等使用）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧灼烧 灭菌法；灭菌法；n（2 2）玻璃器皿、金属用具等使用）玻璃器皿、金属用具等使用 干热干热 灭菌法，所用灭菌法，所用器械是器械是 干热灭菌箱干热灭菌箱 ；n（3 3）培养基、无菌水等使用）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽高压蒸汽 灭菌法，所用灭菌法，所用器械是器械是 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅 。1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加下加热热1-2h1-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min.(2)灭菌的方法：灭菌的方法：1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效答：无菌技术还能有效避免操作者自身被避免操作者自身被微生物感染微生物感染。答：（答：（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3 3）需要消毒）需要消毒。P P15-1615-16旁栏思考旁栏思考n先将混合菌液稀释先将混合菌液稀释1010倍倍 100 100倍倍 1000 1000倍倍等等几个梯度几个梯度,然后用接种环蘸这些液体在培养基然后用接种环蘸这些液体在培养基中接种总会有一个梯度接种时可以蘸取单个的中接种总会有一个梯度接种时可以蘸取单个的细菌细菌.大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养n稀释！稀释！n平板划线法是通过划线进行稀释，而稀释平板涂布平板划线法是通过划线进行稀释，而稀释平板涂布法是通过稀释培养液达到稀释的目的。法是通过稀释培养液达到稀释的目的。n大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养1 1、牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制、牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制 2 2 、纯化大肠杆菌、纯化大肠杆菌（1）计算（）计算（2）称量）称量（3）溶化）溶化 （4）灭菌）灭菌（5）倒平板）倒平板（1）平板划线法）平板划线法（2）稀释涂布平板法）稀释涂布平板法 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基碳源、氮源、磷酸盐和维生素碳源、氮源、磷酸盐和维生素氮源和维生素氮源和维生素无机盐无机盐凝固剂凝固剂牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制n1 1 计算：计算：根据根据 比例，计算比例，计算100mL100mL培养基各成分用量。培养基各成分用量。n2 2 称量：称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏蛋白胨目的是防止牛肉膏蛋白胨 。n3 3 溶化：溶化：加水加热溶化加水加热溶化 ；加入加入 和和 继续加继续加热；热；加入加入 ；用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到 。整个过程不断用玻。整个过程不断用玻棒棒 ，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯 。n4 4 调调pHpH：用：用1mol/LNaOH1mol/LNaOH溶液调节溶液调节pHpH至偏碱性。至偏碱性。n5 5 灭菌：灭菌：n将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用 灭菌灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用 灭菌。灭菌。n6 6 倒平板：倒平板：待培养基冷却至待培养基冷却至 左右时在左右时在 附近操作进附近操作进行。行。n其过程是：其过程是：n在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；n右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过 ；n左手将培养皿打开一条左手将培养皿打开一条 ，右手将培养基倒入培养皿，立刻，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上盖上 。n待平板待平板 后，将平板倒过来放置。后，将平板倒过来放置。牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制n1 1 计算：计算：根据根据配方配方比例，计算比例，计算100mL100mL培养基各成分用量。培养基各成分用量。n2 2 称量：称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏蛋白胨目的是防止牛肉膏蛋白胨吸潮吸潮。n3 3 溶化溶化：加水加热溶化加水加热溶化牛肉膏牛肉膏；加入加入蛋白胨蛋白胨和和氯化钠氯化钠继续加继续加热；热；加入加入琼脂琼脂；用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到100mL100mL。整个过程不断用玻。整个过程不断用玻棒棒搅拌搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂破裂。n4 4 调调pHpH：用：用1mol/LNaOH1mol/LNaOH溶液调节溶液调节pHpH至偏碱性。至偏碱性。n5 5 灭菌：灭菌：n将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌干热灭菌箱灭菌。箱灭菌。n6 6 倒平板：倒平板：待培养基冷却至待培养基冷却至5050左右时在左右时在酒精灯火焰酒精灯火焰附近操作进附近操作进行。行。n其过程是：其过程是：n在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；n右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰火焰；n左手将培养皿打开一条左手将培养皿打开一条缝隙缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。盖上皿盖。n待平板待平板冷却凝固冷却凝固后，将平板倒过来放置。后，将平板倒过来放置。配制培养基配制培养基市场常见琼脂条市场常见琼脂条包器材包器材包器材包器材条件：条件：121121、100kPa100kPa20-30min20-30min灭菌灭菌倒平板倒平板1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？温度？答：可以用答：可以用手触摸手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，答：通过灼烧灭菌，防止防止瓶口的瓶口的微生物微生物污染污染培养基。培养基。P17问题讨论问题讨论3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使既可以使培养基表面的水分更好地挥发培养基表面的水分更好地挥发，又可以，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好间的培养基上滋生，因此最好不要用不要用这个平板这个平板培养微生物。培养微生物。2 2、纯化大肠杆菌、纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法微生物的接种技术微生物的接种技术平板划线法：平板划线法：n通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步聚集的菌种逐步 到培养基表面。到培养基表面。n其操作步骤是：其操作步骤是：n将将 在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。n在酒精灯火焰旁在酒精灯火焰旁 接种环，并打开大肠杆菌的菌种接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。试管的棉塞。n将菌种试管口通过火焰达到将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口消灭试管口 的目的。的目的。n将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环 。n将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。n将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划n3 35 5条条 线，盖上皿盖，不要划破培养基。线，盖上皿盖，不要划破培养基。n灼烧接种环，冷却后从第一区划线灼烧接种环，冷却后从第一区划线 开始向第二区开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第注意不要将第五区的划线与第 区划线相连。区划线相连。n将平板将平板 放在培养箱中培养。放在培养箱中培养。平板划线法：平板划线法：n通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步聚集的菌种逐步稀释分散稀释分散到培养基表面。到培养基表面。n其操作步骤是：其操作步骤是：n将将接种环接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。n在酒精灯火焰旁在酒精灯火焰旁冷却冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。试管的棉塞。n将菌种试管口通过火焰达到将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌消灭试管口杂菌的目的。的目的。n将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种菌种。n将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。n将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划n3 35 5条条平行平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。线，盖上皿盖，不要划破培养基。n灼烧接种环，冷却后从第一区划线灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端末端开始向第二区开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第注意不要将第五区的划线与第一一区划线相连。区划线相连。n将平板将平板倒置倒置放在培养箱中培养。放在培养箱中培养。接种、划线接种、划线n灼烧接种环灼烧接种环n取菌液取菌液n划线分离划线分离烧至暗红烧至暗红接种、划线接种、划线n灼烧接种环灼烧接种环n取菌液取菌液n划线分离划线分离菌液膜菌液膜接种、划线接种、划线倒置后做好标记，写在培养皿侧面倒置后做好标记，写在培养皿侧面划线分离划线分离 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接避免接种环上可能存在的微生物污染培养物种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。P P1818问题问题讨论讨论 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？后再进行划线？答：避免接种环答：避免接种环温度太高杀死菌种温度太高杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌得到由单个细菌繁殖而来的菌落。落。6、培养、培养恒温恒温37培养培养稀释涂布平板法n将菌液进行将菌液进行一系列梯度稀释一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的数足够高时，即可获得单个细菌形成的菌落菌落。n系列稀释操作：系列稀释操作：n取盛有取盛有9mL9mL水的无菌试管水的无菌试管6 6支，编号支，编号10101 1、10102 2、10103 3、10104 4、10105 5、10106 6。n用灼烧冷却的移液管吸取用灼烧冷却的移液管吸取1mL1mL菌液注入编号为菌液注入编号为10101 1试试管中，并吹吸管中，并吹吸3 3次，使之混匀。次，使之混匀。n从从10101 1倍液中吸取倍液中吸取1mL1mL菌液注入到编号为菌液注入到编号为10102 2试管内试管内吹打均匀，获得吹打均匀，获得10102 2倍液。依此类推。倍液。依此类推。n注意：操作中试管口和移液管应在离注意：操作中试管口和移液管应在离火焰火焰1 12cm2cm处。处。整个操作过程中使用了整个操作过程中使用了1 1支移液管支移液管。P20结果分析与评价n1 1、培养未接种培养基的作用是、培养未接种培养基的作用是对照对照，若有菌，若有菌落形成，说明落形成，说明培养基灭菌不彻底培养基灭菌不彻底。n2 2、大肠杆菌菌落呈、大肠杆菌菌落呈白白色，为色，为圆圆形，光滑有光形，光滑有光泽，边缘整齐。泽，边缘整齐。n3 3、培养、培养12h12h和和24h24h后的菌落后的菌落大小大小不同不同（相同、（相同、不同）；菌落分布不同）；菌落分布位置位置相同相同（相同、不同）。（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。n4 4、在某培养基上出现了、在某培养基上出现了3 3种特征不同的菌落，种特征不同的菌落，原因有原因有培养基灭菌不彻底培养基灭菌不彻底或或杂菌感染杂菌感染等。等。n频繁使用的菌种利用频繁使用的菌种利用临时保藏法临时保藏法保存，保存，n利用固体斜面培养基培养后，保存在利用固体斜面培养基培养后，保存在44冰箱冰箱中，每中，每3 36 6个月转种培养一次，缺点是保存时个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；间较短，容易发生污染和变异；n长期保存菌种的方法是长期保存菌种的方法是甘油管藏法甘油管藏法。后者将菌。后者将菌种与无菌体积等量种与无菌体积等量甘油甘油混合后保存在混合后保存在2020冷冷冻箱中。冻箱中。