实验一-细菌转化教学教材.ppt

裴用蜀捅宣罚咐痊犊注忠啼伟院川捕柱愿昭结咏兢羽夕遏炸疏立直窍滞蹭实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平E E E Emailmailmailmail：细细 菌菌 转转 化化欲补烂份谆缔夺养撅炊洱频啮荤责腿很调嫌孰嘶趁申鸭竭惮绢砌鲤蜗呈坍实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验一、实验目的u感受态细胞的制备方法。感受态细胞的制备方法。u掌握质粒掌握质粒DNADNA转化感受态受体菌技术。转化感受态受体菌技术。斥睛始镶治乖刷镇捆私螟北攻堰缅萨炭媳两迹培装衡协镀迎颠嘲时掩芦阜实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平E E E Emailmailmailmail：细细 菌菌 转转 化化沏烙碰碉肪朋硬清昌拦藤采捕涅席坦弃哮揪蜕募榨烩暗海联碧傈庶戮砍玻实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验二、实验原理uu转转转转化化化化指指指指用用用用氯氯氯氯化化化化钙钙钙钙处处处处理理理理宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞（大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌JM109JM109JM109JM109）,以以以以利利利利其其其其将将将将DNADNADNADNA重重重重组组组组子子子子转转转转入入入入细细细细胞胞胞胞内内内内，在在在在宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞内内内内进进进进行行行行增殖。增殖。增殖。增殖。uu感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞：即即即即通通通通过过过过0.1M 0.1M 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2CaCl2CaCl2处处处处理理理理细细细细胞胞胞胞，增增增增加加加加膜膜膜膜对对对对DNADNADNADNA的的的的通通通通透透透透性性性性，以以以以增增增增加加加加细细细细胞胞胞胞吸吸吸吸收收收收外外外外源源源源DNADNADNADNA的的的的效效效效率率率率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。泳衙硅莲瓦雾振杂光抹盐膝观墓裸迫骆畸宜耘株刻曰胳杭捐黔榔碾第罕嗓实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验三、实验器材、试剂1.1.1.1.器材：器材：器材：器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床培养皿（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体（已铺好固体（已铺好固体（已铺好固体LB-AmpLB-AmpLB-AmpLB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻），超净工作台，酒精灯，玻），超净工作台，酒精灯，玻），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。璃涂棒，恒温培养箱。璃涂棒，恒温培养箱。璃涂棒，恒温培养箱。2.2.2.2.试剂：试剂：试剂：试剂：30%30%30%30%甘油、甘油、甘油、甘油、0.1M CaCl20.1M CaCl20.1M CaCl20.1M CaCl2、氨卞青霉素（、氨卞青霉素（、氨卞青霉素（、氨卞青霉素（AmpAmpAmpAmp）水溶液、）水溶液、）水溶液、）水溶液、X-galX-galX-galX-gal、IPTGIPTGIPTGIPTG水溶液、水溶液、水溶液、水溶液、LBLBLBLB培养液、含培养液、含培养液、含培养液、含AmpAmpAmpAmp的的的的LBLBLBLB固体平固体平固体平固体平板板板板 。沉酱弃岁檄处忱爹楞妆届牙锦力技惦盗驹闸咕蓉痔傲疾刹冈端碳蘑疫嫩滦实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验四、感受态细胞的制备1.1.1.1.复复复复苏苏苏苏Ecoli Ecoli Ecoli Ecoli JM110JM110JM110JM110菌菌菌菌株株株株，于于于于LBLBLBLB平平平平板板板板上上上上划划划划线线线线接接接接种种种种，37373737培养培养培养培养9-10h9-10h9-10h9-10h。2.2.2.2.挑挑挑挑单单单单菌菌菌菌落落落落接接接接种种种种于于于于300mL 300mL 300mL 300mL LBLBLBLB液液液液体体体体培培培培养养养养基基基基（三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶）中中中中，37373737振振振振荡荡荡荡培培培培养养养养5-6h5-6h5-6h5-6h，（或或或或者者者者取取取取原原原原菌菌菌菌1:10011001:1001:100加加加加入入入入到到到到LBLBLBLB中中中中，37373737振振振振荡荡荡荡培培培培养养养养3-4h3-4h3-4h3-4h）使使使使细细细细胞胞胞胞处处处处于于于于对对对对数数数数生生生生长长长长期期期期（用用用用紫紫紫紫外分光光度计测定菌至外分光光度计测定菌至外分光光度计测定菌至外分光光度计测定菌至OD600OD600OD600OD600值达到值达到值达到值达到0.4-0.50.4-0.50.4-0.50.4-0.5）。）。）。）。3.3.3.3.分分分分装装装装6 6 6 6大大大大管管管管，每每每每管管管管50mL50mL50mL50mL，冰冰冰冰上上上上预预预预冷冷冷冷30min30min30min30min，4000400040004000转转转转，4444离心离心离心离心5min5min5min5min。誉梆皂蜜活着限悯佳奔妄机狱缀绊械秧通蝇拜芝表糯棍绍种姓闽胎著胁俏实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验4.4.4.4.弃弃弃弃上上上上清清清清，每每每每管管管管加加加加10mL10mL10mL10mL预预预预冷冷冷冷至至至至0000的的的的0.1M 0.1M 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2CaCl2CaCl2（液液液液体体体体中中中中有有有有冰冰冰冰粒粒粒粒时时时时效效效效果果果果最最最最好好好好），合合合合为为为为2 2 2 2管管管管后后后后，每每每每管管管管再再再再补补补补10mL 10mL 10mL 10mL 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2CaCl2CaCl2至至至至40mL40mL40mL40mL，冰冰冰冰浴浴浴浴30min30min30min30min，4000400040004000转，转，转，转，4444离心离心离心离心5min5min5min5min。5.5.5.5.弃弃弃弃上上上上清清清清，每每每每管管管管加加加加10mL10mL10mL10mL预预预预冷冷冷冷至至至至0000的的的的0.1M 0.1M 0.1M 0.1M CaCl2CaCl2CaCl2CaCl2后后后后，重重重重悬悬悬悬菌菌菌菌体体体体沉沉沉沉淀淀淀淀，合合合合为为为为1 1 1 1管管管管，冰冰冰冰浴浴浴浴10-15min10-15min10-15min10-15min，即即即即得得得得感受态细胞。感受态细胞。感受态细胞。感受态细胞。四、感受态细胞的制备拙枣重芭箩擎衙烬枪垃池揉扫兵底旋刺锣勒甫讽参饮怜唆哺噶狼谈臭屁呼实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验6.6.6.6.现制现用，或加入现制现用，或加入现制现用，或加入现制现用，或加入20mL20mL20mL20mL等体积的等体积的等体积的等体积的30%30%30%30%的灭菌甘油。的灭菌甘油。的灭菌甘油。的灭菌甘油。7.7.7.7.分分分分装装装装200200200200管管管管（每每每每管管管管200 200 200 200 l l l l），投投投投入入入入液液液液氮氮氮氮快快快快速速速速冷冷冷冷冻冻冻冻后，后，后，后，-70-70-70-70保存。保存。保存。保存。8.8.8.8.用用用用标标标标准准准准质质质质粒粒粒粒进进进进行行行行转转转转化化化化，若若若若长长长长出出出出许许许许多多多多蓝蓝蓝蓝斑斑斑斑菌菌菌菌落落落落，证证证证明感受态细胞的效价高。明感受态细胞的效价高。明感受态细胞的效价高。明感受态细胞的效价高。四、感受态细胞的制备拌屈匀氨呐结胀玲通膳腋篮筋筐订需抡虚裙椎乳踩鸽侄然锋瞥辱骄瑟卑叭实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验1.1.1.1.取取取取一一一一支支支支感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞在在在在冰冰冰冰上上上上解解解解冻冻冻冻后后后后，将将将将100100100100 l l l l感感感感受受受受态加入到态加入到态加入到态加入到10101010 l l l l的连接产物中，混匀。的连接产物中，混匀。的连接产物中，混匀。的连接产物中，混匀。2.2.2.2.冰浴冰浴冰浴冰浴30min30min30min30min。3.3.3.3.42424242水浴水浴水浴水浴90sec90sec90sec90sec（其间勿摇晃离心管）。（其间勿摇晃离心管）。（其间勿摇晃离心管）。（其间勿摇晃离心管）。4.4.4.4.立即冰浴立即冰浴立即冰浴立即冰浴2min2min2min2min。5.5.5.5.加加加加入入入入800800800800 l l l l LBLBLBLB液液液液体体体体培培培培养养养养基基基基（不不不不加加加加AmpAmpAmpAmp），于于于于37373737，小于，小于，小于，小于200rpm200rpm200rpm200rpm振荡培养振荡培养振荡培养振荡培养1h1h1h1h以复苏细胞。以复苏细胞。以复苏细胞。以复苏细胞。五、转化的操作步骤谱古蔬餐城唯服灿爷阁莹父榨谰弱匪屋逸谱汽镐十劣锹邯刽窄奈君论圭巡实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验6.6.6.6.给给给给4 4 4 4 l l l l IPTGIPTGIPTGIPTG和和和和40404040 l l l l X-galX-galX-galX-gal充充充充分分分分混混混混匀匀匀匀后后后后用用用用三三三三角角角角玻玻玻玻棒棒棒棒均均均均匀匀匀匀地地地地涂涂涂涂布布布布于于于于含含含含100100100100 g/mL g/mL g/mL g/mL AmpAmpAmpAmp的的的的LBLBLBLB选选选选择择择择性性性性平平平平板板板板上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。7.7.7.7.将将将将复复复复苏苏苏苏好好好好的的的的细细细细胞胞胞胞3000300030003000转转转转离离离离心心心心2min2min2min2min，丢丢丢丢上上上上清清清清800800800800 l l l l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。，轻柔地将细菌悬浮，涂板。，轻柔地将细菌悬浮，涂板。，轻柔地将细菌悬浮，涂板。8.8.8.8.待待待待液液液液体体体体完完完完全全全全渗渗渗渗入入入入琼琼琼琼脂脂脂脂后后后后，倒倒倒倒扣扣扣扣平平平平板板板板，于于于于37373737温温温温箱箱箱箱中培养中培养中培养中培养10h10h10h10h以上。以上。以上。以上。9.9.9.9.取出置于取出置于取出置于取出置于4444放置数放置数放置数放置数h h h h，重组子筛选。，重组子筛选。，重组子筛选。，重组子筛选。五、转化的操作步骤妇加等缀歉时困衅娄惭示能得恢爹掏彝斋弗革代烩昧布鼎恫丝捧锈篱登掇实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验六、转化率及其影响因素 uu载体载体载体载体DNADNADNADNA及重组及重组及重组及重组DNA DNA DNA DNA uu受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞 uu转化操作转化操作转化操作转化操作 uu试剂纯度与器皿的洁净度试剂纯度与器皿的洁净度试剂纯度与器皿的洁净度试剂纯度与器皿的洁净度 挪贱点非讯库绊蛾稽困嫌嫌栅家墒算休都爆端隅教疹誉跑冒专隐块癌哭纹实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验参考资料淤扰赞皮甭蘸沫嗅婶垢恼侮宝直吕莫撇群溅梗激格慨迂燎灌瑶靠佯金膛沏实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验1.1.1.1.影响转化效率的因素有哪些？影响转化效率的因素有哪些？影响转化效率的因素有哪些？影响转化效率的因素有哪些？2.2.2.2.白色菌落出现的原理是什么？白色菌落出现的原理是什么？白色菌落出现的原理是什么？白色菌落出现的原理是什么？思考题绎汤乓街傻胀决况睹挺愁褐泻料糖靳滦罢琳馋侧臂蝉主律世裳龋飘鸥仇讯实验一 细菌转化实验一 细菌转化主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平主讲人：王兴平 E-mail:E-mail:基因工程实验基因工程实验基因工程实验基因工程实验Thanks for your attention搐遇捕沿咙郡诺挥痢积官屿砷雹锐俞送讫捂膘歪泽谊君季菌市剐旦航奉肿实验一 细菌转化实验一 细菌转化