酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体ppt课件.ppt

酶联免疫吸附试验检测酶联免疫吸附试验检测伤寒伤寒O O抗体方法的建立抗体方法的建立小组成员：王哲鉴、钟小组成员：王哲鉴、钟 鑫鑫 陈陈 阳、刘一宁阳、刘一宁指导教师：綦指导教师：綦 霞霞所在院系：检验医学院所在院系：检验医学院 Company Logo目目录摘 要1实验方法2结果讨论3 4致 谢Company Logo摘要摘要目的：目的：检测伤寒寒O抗体一般采用肥达抗体一般采用肥达实验（直接凝集（直接凝集实验），在），在临床床诊断中有重要的意断中有重要的意义。能否建立一个用。能否建立一个用酶联免疫吸附法免疫吸附法检测血清中抗血清中抗伤寒寒“O”抗体的抗体的实验体系，提高体系，提高临床床诊断效果是本断效果是本实验要解决的关要解决的关键问题。原理：以原理：以伤寒寒O抗原免疫抗原免疫动物，制物，制备出抗出抗伤寒寒O抗体，将后者抗体，将后者纯化，化，与与酶连接制接制备成成酶标抗体，以抗体，以伤寒寒O抗原包被抗原包被酶标板，以制板，以制备的的伤寒寒酶标抗体抗体为竞争抗体，可以构成争抗体，可以构成竞争法争法检测伤寒抗体的寒抗体的酶联免疫免疫实验。摘要摘要 摘要摘要结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒测伤寒O抗体的实验体系抗体的实验体系结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒寒“O”抗体抗体实验方法方法实验材料：实验材料：实验动物物：家兔（家兔（1.性格温性格温顺，一般不咬人，但其爪，一般不咬人，但其爪锐利，利，挣扎扎时易抓易抓伤操作人操作人员 2.与与伤寒沙寒沙门菌种属差异大，可保菌种属差异大，可保证产生抗体生抗体 3.体重大，体重大，血量多，得到的血清可保血量多，得到的血清可保证实验顺利利进行）行）实验试剂：饱和硫酸和硫酸铵溶液溶液 PBS透析液透析液 辣根辣根过氧化物氧化物酶(HRP)NaIO4溶液溶液 2.5%乙二醇溶液乙二醇溶液 硼硼氢化化钠溶液溶液 包被稀包被稀释液液 酶标抗体抗体 待待测抗抗体体 稀稀释液液 洗洗涤液液 底物液底物液实验器材：兔器材：兔笼 透析膜透析膜 离心机离心机 加加样器器 酶标板板Company LogoCompany Logo实验步骤1234制备伤寒制备伤寒O抗体抗体 纯化纯化 抗体抗体 酶与抗酶与抗体的连接体的连接 ELISA竞争检测竞争检测伤寒伤寒O抗抗体（预实验体（预实验和正式实验）和正式实验）制备伤寒O抗体颗粒性抗原伤寒杆菌颗粒性抗原伤寒杆菌备注备注第一周第一周第一天第一天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.1ml0.1ml之前取血之前取血0.7-0.7-1ml1ml，分离血清，分离血清，待用待用第二天第二天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第三天第三天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第四天第四天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.5ml0.5ml第二周第二周加强免疫：皮下注射加强免疫：皮下注射1.0ml1.0ml（两（两侧各侧各0.5ml0.5ml）第三周第三周耳中央动脉采血，分离血清耳中央动脉采血，分离血清纯化抗体化抗体 1份血清（份血清（5ml）+1份生理盐水份生理盐水+2份饱和硫酸铵份饱和硫酸铵 置试管中置试管中 2000转离心转离心20min 弃上清弃上清 1.52ml NS 溶解沉淀溶解沉淀 透析透析24h 收集、标记、冰冻收集、标记、冰冻 5管管缓缓摇动缓缓摇动 ,室温室温2h（1.5h）盐析法盐析法酶与抗体的与抗体的连接接实验原理：实验原理：NaIO4NaIO4是强氧化剂，能将是强氧化剂，能将HRPHRP的甘露糖部分（与酶的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：合，形成酶标抗体，反应式如下：实验方法：实验方法：标记过程：标记过程：1.将将HRP 5mgHRP 5mg溶于溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师做）缓冲液中（老师做）。2.2.滴入滴入NaIO4 0.25ml,NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。此时酶的颜色由黄变绿。4 4作用作用30min30min。酶与抗体的与抗体的连接接3.3.加入加入2.5%2.5%乙二醇溶液乙二醇溶液0.5ml0.5ml（稳定剂）终止反应，室温（稳定剂）终止反应，室温30min 30min。4.4.加入待标加入待标Ab1.52.0ml,Ab1.52.0ml,用用pH9.5pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液碳酸盐缓冲液调整反应液的的pHpH至至 9.09.0左右，左右，4 4过夜。过夜。5.5.加入加入0.1ml0.1ml硼氢化钠，硼氢化钠，4242小时。小时。6.pH7.4 PBS6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存酶联免疫免疫竞争法争法检测伤寒寒O抗体抗体（一）（一）.酶联免疫免疫竞争法争法检测伤寒寒O抗体抗体预实验1.包被包被Ag：抗原（：抗原（伤寒）用包被液稀寒）用包被液稀释，每孔加入，每孔加入100l，置置37作用作用4h或或4作用作用24h。2.洗洗涤：弃去孔中液体，洗：弃去孔中液体，洗涤液洗液洗涤3次，每次次，每次1min，于吸，于吸水水纸上充分拍干。上充分拍干。3.加入加入样品：每孔加入品：每孔加入酶标Ab及及Ab各各100l，放入，放入37恒温恒温箱中孵育箱中孵育30min。（如。（如图1）4.洗洗涤：同上：同上5.加入底物液：每孔加入底物液加入底物液：每孔加入底物液A1滴、滴、B1滴，避光放置滴，避光放置约5-15min，密切，密切观察。察。6.终止反止反应酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体 待测待测酶标酶标原液原液1：51：251：125阴性阴性对照对照1：251：501：1001：200（图1）选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度酶联免疫免疫竞争法争法检测伤寒寒O抗体抗体稀稀释方法：方法：1.酶标抗体抗体1:251200ul(牛奶）牛奶）+50ul（酶标）=1250ul1:50600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul1:100 600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul1:200600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul酶联免疫免疫竞争法争法检测伤寒寒O抗体抗体2.待待测抗体抗体1:5600ul(牛奶牛奶)+150ul(待待测)=750ul125600ul(牛奶牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶牛奶)+150ul=750ul 酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体（二）酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体正式实验 选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：1.1.包被包被 2.2.洗涤洗涤 3.3.加样加样(如图如图2)2)4.4.洗涤洗涤 5.5.显色显色 6.6.判断检出率判断检出率酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体自己的待测自己的待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul别组的待测别组的待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul稀释液稀释液100ul+酶酶标标Ab100ul 阳性阳性 对照对照 待测待测1 待测待测2 待测待测3 待测待测4 阴性阴性 对照对照图(2)经洗涤显色后经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色若待测组颜色更接近于阳性对照更接近于阳性对照,则记为则记为“+”，反之则记为，反之则记为“-”。结果果讨论（一）（一）实验结果果 阴阴 阳阳结果果讨论 以酶标抗体以酶标抗体1 1：100100稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测得到以下结果，待测1 1“待测待测2 2“+”,待测待测3 3“+”,待测待测4 4“+”;4;4组待测抗体均被成功检出，检出率组待测抗体均被成功检出，检出率100%100%。结果果讨论（二）（二）实验讨论伤寒，由寒，由伤寒杆菌引起，寒杆菌引起，检测伤寒寒O抗体在抗体在伤寒杆菌感染的寒杆菌感染的诊断中具断中具有重要意有重要意义，采用肥达，采用肥达实验可可对抗体抗体进行半定量行半定量检测。但近年来。但近年来发现，随着随着轻型和型和亚型病人的增多，型病人的增多，伤寒杆菌寒杆菌变异株增多，或异株增多，或发病早期大量病早期大量使用抗生素，抑制使用抗生素，抑制伤寒沙寒沙门菌或菌或应用用肾上腺皮上腺皮质激素等免疫抑制激素等免疫抑制剂抑抑制抗体的形成，肥达制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的阳性率有下降的趋势，难以以满足足临床要求。床要求。ELISA法法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达、二者均达到到70%结果果讨论 以上，反以上，反应时间短，操作短，操作简便，便，结果易于判断。果易于判断。对伤寒早起寒早起诊断，有断，有较高的高的临床价床价值，因此，早起，因此，早起诊断以断以ELISA法法检测血液中血液中伤寒特异性寒特异性或抗体或抗体为依据。依据。