牛奶中金黄色葡萄球菌的鉴定.ppt

检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定实 验实验目的实验目的实验原理实验原理实验仪器、试剂与材料实验仪器、试剂与材料实验步骤实验步骤实验结果实验结果参考文献参考文献实验原理1 1、认识金黄色葡萄球菌；、认识金黄色葡萄球菌；2 2、学习运用、学习运用PCRPCR方法检测金黄色葡萄球菌。方法检测金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)(Staphyloccocus aureus)属于葡萄球菌属（属于葡萄球菌属（StaphylococcusStaphylococcus），），无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。在普通培养基上生长良好，需氧无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度或兼性厌氧，最适生长温度3737C C，最适生长，最适生长pH7.4,pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm12mm。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径直径12mm12mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在可在1015%NaCl1015%NaCl肉汤中生长肉汤中生长显微图像显微图像 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片照片实验原理微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的“金标准金标准”，传统方法是进行细菌分类培养，传统方法是进行细菌分类培养，通过生化试验、血清型、各种酶试验分析细菌的表型特点。对牛奶中病原微生物培通过生化试验、血清型、各种酶试验分析细菌的表型特点。对牛奶中病原微生物培养需要很长时间养需要很长时间 用生化试验的方法进行种属特异性的鉴定至少需要用生化试验的方法进行种属特异性的鉴定至少需要48h48h以上传统的以上传统的鉴定技术时间较长，从国外进口诊断试剂费用相对较高。因此，本文建立了直接从鉴定技术时间较长，从国外进口诊断试剂费用相对较高。因此，本文建立了直接从牛奶中鉴别病原菌的牛奶中鉴别病原菌的PCRPCR检测技术，这种快速、准确、有效、直接从牛奶中检测致检测技术，这种快速、准确、有效、直接从牛奶中检测致病菌的方法将为检验检疫、食品安全质检系统以及兽医检疫提供技术支撑，从而为病菌的方法将为检验检疫、食品安全质检系统以及兽医检疫提供技术支撑，从而为乳制品病原菌的检测提供一定的帮助。乳制品病原菌的检测提供一定的帮助。方法是根据已发表的金黄色葡萄球菌方法是根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物，特异性序列设计并合成一对引物，通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCRPCR方法。方法。结果是与细菌的常规分离方法相比，结果是与细菌的常规分离方法相比，PCR PCR 法敏感性高与其它型葡萄球菌无交叉反应，法敏感性高与其它型葡萄球菌无交叉反应，特异性达特异性达100%100%，检测细菌基因组，检测细菌基因组DNADNA最低浓度为最低浓度为35ng/L35ng/L（纳克每升）（纳克每升），能在，能在5h5h内对内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定，可用于乳制品中金黄色葡萄球菌送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定，可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测。的检测。所以，建立了一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的所以，建立了一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCRPCR快速诊断方法。快速诊断方法。实验仪器、试剂与材料仪器：冰箱、摇床、显微镜、仪器：冰箱、摇床、显微镜、PCRPCR反应管、反应管、PCRPCR仪、微量加样器、高速离心官、水平仪、微量加样器、高速离心官、水平电泳槽、恒压电泳仪和凝胶自动成像系统、紫外检测仪、电热恒温水浴槽。电泳槽、恒压电泳仪和凝胶自动成像系统、紫外检测仪、电热恒温水浴槽。材料：某牛奶样品、金黄色葡萄球菌标准株。材料：某牛奶样品、金黄色葡萄球菌标准株。试剂：试剂：主要培养基：贝尔德主要培养基：贝尔德.帕克氏帕克氏(BP)(BP)培养基、血平板培养基、普通营养琼脂培养基、培养基、血平板培养基、普通营养琼脂培养基、7.5%NaCl7.5%NaCl营养肉汤、营养肉汤、LBLB液体培养基（又称液体培养基（又称Luria-BertaniLuria-Bertani培养基、普通培养基）。培养基、普通培养基）。溶菌酶（溶菌酶（20mg/ml20mg/ml）、蛋白酶）、蛋白酶K K（20mg/ml20mg/ml）、）、10%SDS10%SDS、5mol/L NaCl5mol/L NaCl、酚：氯仿：异、酚：氯仿：异戊醇（戊醇（2525：2424：1 1）、氯仿）、氯仿:异戊醇异戊醇(24(24：1)1)、乙醇、草酸铵结晶紫染液、乙醇、草酸铵结晶紫染液 、卵黄亚碲、卵黄亚碲酸钾、酸钾、TETE缓冲液（缓冲液（Tris-HClTris-HCl缓冲液（缓冲液（0.05mol/L0.05mol/L，2525）。）。1010倍倍PCRPCR反应液：反应液：400 mmol/L HCL400 mmol/L HCL、100 mmol/L Tris-HC100 mmol/L Tris-HC（pH 8.4pH 8.4）、）、20 mmol/L 20 mmol/L MgCl2MgCl2、0.1 g/L 0.1 g/L 明胶或牛血清白蛋白。明胶或牛血清白蛋白。10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（2.5U/L2.5U/L）、上下游引物（）、上下游引物（25 pmol/L25 pmol/L）、）、电泳缓冲液（电泳缓冲液（1 1倍倍TAETAE）、标准）、标准DNADNA（DNA Mark-erDNA Mark-er）、）、1%1%琼脂糖、琼脂糖、0.5g/mL0.5g/mL溴化乙溴化乙锭。锭。实验步骤1 1、细菌的增菌培养及初步鉴定、细菌的增菌培养及初步鉴定2 2、细菌、细菌DNADNA提取提取3 3、PCRPCR扩增鉴定扩增鉴定1、细菌的增菌培养及初步鉴定1.1 1.1 增殖培养：增殖培养：在无菌操作下各取在无菌操作下各取10mL10mL牛奶样品加入牛奶样品加入90mL7.5%NaCl90mL7.5%NaCl营养肉汤中营养肉汤中,37,37、180r/min180r/min条条件下培养件下培养24h24h。1.2 1.2 分离培养及初步鉴定：分离培养及初步鉴定：将上述培养液按十倍稀释将上述培养液按十倍稀释,取稀释液涂布于取稀释液涂布于BPBP培养基上培养基上,每个稀释度每个稀释度3 3次重复。次重复。3737倒置培养倒置培养24h24h，观察。，观察。看是否有菌落呈圆形、表面光滑、凸起、湿润，直径看是否有菌落呈圆形、表面光滑、凸起、湿润，直径2-3mm,2-3mm,灰黑色至黑色，有光泽，灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带（卵常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带（卵磷脂环）。磷脂环）。u若没有，则可断定牛奶样品没有感染金黄色葡萄球菌，此时已经可以结束实验。若没有，则可断定牛奶样品没有感染金黄色葡萄球菌，此时已经可以结束实验。u若有，则挑取表面光滑、边缘完整、黑色突起的菌落于普通琼脂培养基上若有，则挑取表面光滑、边缘完整、黑色突起的菌落于普通琼脂培养基上,分离纯分离纯化化3 3次后次后,用草酸铵结晶紫染液进行革兰氏染色观察细胞的个体形态特征。选择呈革用草酸铵结晶紫染液进行革兰氏染色观察细胞的个体形态特征。选择呈革兰氏阳性、球状、葡萄串状排列无芽胞、荚膜的菌株兰氏阳性、球状、葡萄串状排列无芽胞、荚膜的菌株,斜面培养后保存于斜面培养后保存于44冰箱中冰箱中备用。备用。2、细菌DNA提取以常规方法进行以常规方法进行S.aureusS.aureus标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中基因组标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中基因组DNADNA的提取。的提取。取经过上述初步鉴定为金黄色葡萄球菌的菌种接种于取经过上述初步鉴定为金黄色葡萄球菌的菌种接种于LBLB液体培养基中液体培养基中,37,37、180r/min180r/min条件下培养条件下培养12h,12h,取取3-6ml3-6ml培养液培养液10000r/min10000r/min离心离心10min,10min,弃上清；弃上清；加加0.5mlTE0.5mlTE悬浮沉淀悬浮沉淀,并加并加75l75l溶菌酶（溶菌酶（20mg/ml20mg/ml）溶液，）溶液，4040保温保温3030分钟；分钟；加加50l,10%SDS,5l50l,10%SDS,5l蛋白酶蛋白酶K K（20mg/ml20mg/ml）,混匀混匀,37,37保温保温3030分钟；分钟；加加0.75ml,5mol/LNaCl,0.75ml,5mol/LNaCl,混匀；混匀；用等体积酚用等体积酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)抽提抽提,5000rpm,5000rpm离心离心1010分钟分钟,将上清液移至将上清液移至干净离心管；干净离心管；用等体积氯仿用等体积氯仿:异戊醇异戊醇(24:1)(24:1)抽提抽提,静置静置1010分钟，分钟，50005000转离心转离心1010分钟，转移上清分钟，转移上清到干净管中；到干净管中；加加2 2倍体积乙醇沉淀倍体积乙醇沉淀DNA,DNA,颠倒混合颠倒混合,室温下静止室温下静止1010分钟，离心沉淀分钟，离心沉淀DNADNA；70%70%乙醇漂洗乙醇漂洗DNADNA后后,吸干吸干,用用30-5030-50l l TE TE溶解溶解DNA,-20DNA,-20保存。保存。3、PCR扩增鉴定根据有关文献选取特异性核苷酸序列设计根据有关文献选取特异性核苷酸序列设计1 1对引物，由对引物，由xxxx公司合成如下：公司合成如下：S.aureusS.aureus上游引物上游引物P1P1：5 5-TCTTCAGAAGACGCGGAATA-3-TCTTCAGAAGACGCGGAATA-3，下游引物，下游引物P2P2：5 5-TAAGTCAAACGATACCATACG-3TAAGTCAAACGATACCATACG-3。分别从分别从S.aureusS.aureus标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中提取的基因组标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中提取的基因组DNADNA为模板进行为模板进行PCRPCR扩增。扩增。样本样本DNADNA扩增的扩增的PCRPCR反应体系（反应体系（25L25L）：）：1010buffer2.5Lbuffer2.5L，上下游引物，上下游引物（25pmol/L25pmol/L）各）各1L1L，2.5L dNTP(10mmol/L2.5L dNTP(10mmol/L，dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP和和dTTP)dTTP)，rTaqrTaq聚合酶聚合酶0.25L0.25L，DNADNA模板模板1L1L，ddH2OddH2O补至补至25L25L。PCRPCR循环条件为：循环条件为：9595预变性预变性5min5min，9595变性变性1min1min，5757退火退火50s50s，7272延伸延伸 50s50s，扩增扩增3636个循环，最后个循环，最后7272延伸延伸10min10min。取取PCRPCR扩增产物扩增产物5L5L进行进行1.5%1.5%琼脂糖凝胶电泳（含琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5%g/mLEB0.5%g/mL），电泳结束后，），电泳结束后，在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果 PCR PCR产物测序结果表明若如上两图类似情况，该基因片段长度为产物测序结果表明若如上两图类似情况，该基因片段长度为420bp420bp左左右，则说明此牛奶以感染金黄色葡萄球菌；若不是，则感染的不是金黄色葡萄球菌，右，则说明此牛奶以感染金黄色葡萄球菌；若不是，则感染的不是金黄色葡萄球菌，需进一步鉴定。需进一步鉴定。参考文献 1 1 陆承平陆承平.兽医微生物学兽医微生物学.4.4版版.北京：中国农业出版社，北京：中国农业出版社，2007.8.2007.8.2 2 张云贵，刘祥云，李天俊主编张云贵，刘祥云，李天俊主编.生物化学实验指导生物化学实验指导.4.4版版.北京：中国农业出版北京：中国农业出版社，社，2007.12.2007.12.3 3 覃艳华覃艳华,谢和谢和,胡萍胡萍,李荔枝李荔枝.原料奶中金黄色葡萄球菌分离鉴定及产毒菌株的快原料奶中金黄色葡萄球菌分离鉴定及产毒菌株的快速检测速检测.贵州农业科学，贵州农业科学，2011.39(5:140143.2011.39(5:140143.4 4 吕艳，王华，王君玮，徐天刚，王淑娟，赵永刚，王志亮吕艳，王华，王君玮，徐天刚，王淑娟，赵永刚，王志亮.牛奶中金黄色葡萄牛奶中金黄色葡萄球菌球菌PCRPCR检测方法的建立与应用检测方法的建立与应用.现代生物医学进展现代生物医学进展.2009.9(3:931933.2009.9(3:931933.5 5 王娉，劳华均，胡玥，袁飞，杨海荣，陈颖王娉，劳华均，胡玥，袁飞，杨海荣，陈颖.鉴定金黄色葡萄球菌的多重鉴定金黄色葡萄球菌的多重PCRPCR方方法法.食品与发酵工业，食品与发酵工业，2011.37(9:195198.2011.37(9:195198.6 6 何娟梅，朱军，巢国祥，朱晓芳，朱小平，董兰梅，杨伟霞，朱国强何娟梅，朱军，巢国祥，朱晓芳，朱小平，董兰梅，杨伟霞，朱国强.一株金一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定.微生物学报，微生物学报，2009.49(10:13971402.2009.49(10:后面内容直接删除就行后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPTPPT设计、计划书、设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求式需求The user can 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