流式细胞术基本原理专家讲座.pptx

流式细胞术流式细胞术=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）是一个）是一个能够快速、准确、客观，而且同时检测单个微粒能够快速、准确、客观，而且同时检测单个微粒（通常是细胞）多项特征技术，同时能够对特定群（通常是细胞）多项特征技术，同时能够对特定群体加以分选体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等物、及人工合成微球等=研究微粒特征包含各种物理及生物学特征，并加以研究微粒特征包含各种物理及生物学特征，并加以定量定量流式细胞术基本原理专家讲座第1页 流式细胞仪特点流式细胞仪特点单个细胞单个细胞/生物颗粒分析生物颗粒分析同时多参数、多荧光分析同时多参数、多荧光分析高通量检测高通量检测/高速度高速度 10000个细胞个细胞/秒以上秒以上定性定性/定量分析定量分析分选特定性状或功效细胞分选特定性状或功效细胞可检测样本种类多样可检测样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液血清、血浆、培养上清、细胞裂解液流式细胞术基本原理专家讲座第2页 当前流式细胞仪能够检测类别当前流式细胞仪能够检测类别细菌细菌浮游生物浮游生物DM：0.2m 15m0.2m 15m 单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞红细胞流式细胞术基本原理专家讲座第3页 流式细胞术基本原理专家讲座第4页 流式细胞仪基本结构流式细胞仪基本结构 激光发射器激光发射器发出所需要波长激光发出所需要波长激光前向散射光检测器前向散射光检测器侧向散射光检测器侧向散射光检测器光学滤镜光学滤镜流动室与液流系统流动室与液流系统：将：将细胞单个压入流动室细胞单个压入流动室信号搜集与数据信号搜集与数据处理系统处理系统光源与光学系统光源与光学系统流式细胞术基本原理专家讲座第5页 Injector Tip荧光信号聚焦激光光束鞘液鞘液流动室流动室流式细胞术基本原理专家讲座第6页 当光子碰到滤片时，光子或经过滤片，或被滤片吸收，当光子碰到滤片时，光子或经过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。或被滤片反射。光学滤片光学滤片流式细胞术基本原理专家讲座第7页 光学滤片种类光学滤片种类长通滤片（长通滤片（LP）：）：630LP短通滤片（短通滤片（SP）：）：550SP带通滤片（带通滤片（BP）:488/10流式细胞术基本原理专家讲座第8页 流式细胞术基本原理专家讲座第9页 共有两类：散射信号散射信号与荧光信号荧光信号前向角散射散射信号（FSC）反应细胞大小侧向角散射散射信号（SSC）反应细胞颗粒度荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3）胞内、胞外染色情况流式细胞仪可获取信号种类流式细胞术基本原理专家讲座第10页 FSC和和SSC直方图直方图流式细胞仪显示图种类流式细胞仪显示图种类流式细胞术基本原理专家讲座第11页 把前向散射光图和侧把前向散射光图和侧向散射光图一维图像向散射光图一维图像在二维图像上投影，在二维图像上投影，便是我们日常所看到便是我们日常所看到流式图。流式图。所以横坐标表示是细所以横坐标表示是细胞直径大小；纵坐标胞直径大小；纵坐标表示是细胞复杂程度。表示是细胞复杂程度。二者相结合就能说明二者相结合就能说明细胞种类细胞种类散点图散点图流式细胞术基本原理专家讲座第12页 二维等高图和密度图二维等高图和密度图流式细胞术基本原理专家讲座第13页 假三维图与三维图假三维图与三维图Pseudo 3D Plot3D Plot流式细胞术基本原理专家讲座第14页 流式细胞仪怎样获取细胞信号？FSCSSCFL流式细胞术基本原理专家讲座第15页 前向角信号（前向角信号（Forward Scatter，FSC）流式细胞术基本原理专家讲座第16页 前向角信号：细胞大小前向角信号：细胞大小流式细胞术基本原理专家讲座第17页 FSCCountFSCCount101000流式细胞术基本原理专家讲座第18页 侧向角信号（侧向角信号（Side Scatter，SSC）流式细胞术基本原理专家讲座第19页 SSCCountSSCCount101000流式细胞术基本原理专家讲座第20页 FL流式细胞术基本原理专家讲座第21页 countFL流式细胞术基本原理专家讲座第22页 FSC、SSC、FL流式细胞术基本原理专家讲座第23页 怎样分离90角内各种荧光信号？流式细胞术基本原理专家讲座第24页 荧光染料吸收某一波长光波后能发射出大于吸收光波长光波物质激发光激发光PI488n600nm流式细胞术基本原理专家讲座第25页 荧光染料种类荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 红色红色PI 488 620 DNA染色 橙红橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红色红色APC 633 670 免疫荧光 红色红色DAPI 359 462 DNA染色 蓝色蓝色流式细胞术基本原理专家讲座第26页 荧光染料光谱特征流式细胞术基本原理专家讲座第27页 荧光分离标准在流式细胞仪中，普通经过LP或SP滤片将荧光大致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光流式细胞术基本原理专家讲座第28页 开放式光路Calibur、Influx流式细胞仪光路流式细胞术基本原理专家讲座第29页 封闭式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）流式细胞术基本原理专家讲座第30页 分分选将目标细胞分离并富集，进行后续研究。分选纯度99%流式细胞术基本原理专家讲座第31页 震震荡激光激光流式细胞术基本原理专家讲座第32页 偏转板Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector流式细胞术基本原理专家讲座第33页 几个概念u信号放大模式u信号类型uCV值u样本流速u激光延迟u液滴延迟u荧光赔偿u阈值u门u对照流式细胞术基本原理专家讲座第34页 信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整PMT电压，信号强度将随之改变光信号光电倍增管（PMT）放大器电信号放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）流式细胞术基本原理专家讲座第35页 线性放大（lin）按光强度线性关系输出信号.适合用于在较小范围内改变信号以及代表生物过程信号，如DNA含量、总蛋白含量等。流式细胞术基本原理专家讲座第36页 对数放大（log）按光强度对数关系输出信号.在免疫学测量中通常使用对数放大。流式细胞术基本原理专家讲座第37页 电脉冲信号类型将与电脉冲信号 强弱相关电压 数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积信号A宽度信号W流式细胞术基本原理专家讲座第38页 CV值CV值（变异系数）：样品均一度及仪器分辨率标志CV值普通2%流式细胞术基本原理专家讲座第39页 样本流速流式细胞术基本原理专家讲座第40页 高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：普通用于对分辨率要求较高分析，如DNA分析。样本流速选择流式细胞术基本原理专家讲座第41页 激光延迟（laser delay）Laser 1Laser 2流式细胞术基本原理专家讲座第42页 液滴延迟（drop delay）流式细胞术基本原理专家讲座第43页 颜色赔偿采取适当方法校正荧光染料之间叠加所造成误差。在完成双色以上荧光标识样本时，都需要作颜色赔偿。流式细胞术基本原理专家讲座第44页 FITC主要由FITC检测器检测，但部分光也会进入PE检测器。假如单染FITC，同时打开PE检测器，则如图：理想状态实际情况赔偿效果阴性对照流式细胞术基本原理专家讲座第45页 阈值 信号放大过程会产生不需要脉冲信号，通常来自于碎片。经过设定某一信号最低强度值，可将不需要脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。屏蔽噪音信号和碎片信号流式细胞术基本原理专家讲座第46页 门（Gate）分析/分选感兴趣细胞群流式细胞术基本原理专家讲座第47页 对照同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清纯化IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合到组织细胞而产生背景染色。空白对照：即不进行标识细胞。主要用于确定待测标本基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。阳性对照：即已知表示某种抗原细胞（阳性细胞）进行平行试验，通惯用于检测抗体是否有问题或确定试验方法稳定性、准确性。流式细胞术基本原理专家讲座第48页 谢谢！流式细胞术基本原理专家讲座第49页