流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座.pptx

流式细胞术（流式细胞术（flow cytometery,FCM）是）是20世纪世纪70年代发展起来一年代发展起来一个个能够快速、准确、客观，可同时能够快速、准确、客观，可同时检测单个微粒（通常是细胞）多项检测单个微粒（通常是细胞）多项特征，并加以定量技术，而且能够特征，并加以定量技术，而且能够对特定群体加以分选。对特定群体加以分选。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第1页=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等=研究微粒特征包含各种物理及生物学特征，并加以定量。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第2页流式细胞仪是一个集激光技术、电子物流式细胞仪是一个集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体新型高科技及细胞荧光化学技术为一体新型高科技仪器。仪器。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第3页流式细胞仪特点流式细胞仪特点=单个细胞或微粒分析=同时多参数分析=速度快：10000个细胞(微粒)/秒=统计学意义：提供细胞群体均值和分布情况=分选感兴趣细胞或微粒流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第4页其结构普通分为其结构普通分为5部分：流动室及液流驱部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测、存放、显示分析系学系统；信号检测、存放、显示分析系统；细胞分选系统。统；细胞分选系统。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第5页（一）流动室与液流驱动系统（一）流动室与液流驱动系统流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第6页 流动室是仪器关键部件，被测样品在此与激流动室是仪器关键部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为璃中央开一个孔径为430m180m长方形孔，长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔中心，这种流动供细胞单个流过，检测区在该孔中心，这种流动室光学特征良好，流速较慢，因而细胞受照时间室光学特征良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可搜集细胞信号光通量大，配上广角搜集透长，可搜集细胞信号光通量大，配上广角搜集透镜，可取得很高检测灵敏度和测量精度。镜，可取得很高检测灵敏度和测量精度。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第7页 流动室内充满了鞘液，鞘液作用是将流动室内充满了鞘液，鞘液作用是将样品流环包，鞘液流是一个稳定液体流动，样品流环包，鞘液流是一个稳定液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变，样品流在鞘液环包下运行中流速是不变，样品流在鞘液环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流轴线方向，而且确保每个细胞经过激光流轴线方向，而且确保每个细胞经过激光照射区时间相等，从而得到准确细胞荧光照射区时间相等，从而得到准确细胞荧光信息。信息。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第8页流式细胞仪流动室和液流驱动系统流式细胞仪流动室和液流驱动系统流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第9页流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第10页(二二)激光光源与光束形成系统激光光源与光束形成系统流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第11页当前台式机当前台式机FCM，大多采取氩离子气体，大多采取氩离子气体激光器。激光激光器。激光(laser)是是种相干光源，种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高光它能提供单波长、高强度及稳定性高光照，是细胞微弱荧光快速分析理想光源。照，是细胞微弱荧光快速分析理想光源。因为细胞快速流动，每个细胞经过光照因为细胞快速流动，每个细胞经过光照区时间仅为区时间仅为1s左右，每个细胞所携带荧左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出荧光信号强弱，与被照光物质被激发出荧光信号强弱，与被照射时间和激发光强度相关，所以细胞需射时间和激发光强度相关，所以细胞需要足够光照强度。要足够光照强度。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第12页激光光束在到达流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22m66m，即短轴稍大于细胞直径光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为确保样品中细胞受到光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第13页流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第14页(三三)光学系统光学系统流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第15页流式细胞仪光学系统流式细胞仪光学系统 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第16页FCM光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，主要光学原件是滤光片，主要分成3类：长通滤片(long-pass filter，LP)、短通滤片(short-pass filtr，SP)及带通滤片(band-pass filter，BP)。它们分别将不一样波长荧光信号送到不一样电子探测器 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第17页流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第18页流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第19页(四四)信号检测与分析系统信号检测与分析系统流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第20页1散射光信号：散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品制备技术(如染色)，所以被称为细胞物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光原光束，其波长与激光波长相同。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第21页前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 侧向角散射（侧向角散射（SSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第22页(1)前向角散射：前向角散射与被测细胞大小相关，确切地说，它与细胞直径平方值亲密相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中各种碎片及鞘液中小颗粒，以防止对被测细胞干扰。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第23页(2)侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90方向散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜折射率更为敏感，可提供相关细胞内精细结构和颗粒性质信息。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第24页2荧光信号 激光作用原理激光作用原理 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第25页(1)(1)荧光信号线性测量与对数测量荧光信号线性测量与对数测量 当携带荧光素细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不一样波长光信号分别抵达不一样光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第26页细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等测量普通选取线性放大测量。在细胞膜表面抗原等检测时，细胞膜表面抗原分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清楚地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对数放大器，假如原来输出是1，当输入增大到原来10倍时，输出为2；当输入增大到原来100倍时，输出为3等。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第27页(2)荧光信号面积和宽度 所谓荧光信号面积是采取对荧光光通量所谓荧光信号面积是采取对荧光光通量进行积分测量，普通对进行积分测量，普通对DNA含量测量时，含量测量时，均采取面积均采取面积(FL2A)来计算。这是因为来计算。这是因为荧光脉冲面积比荧光脉冲高度更能准确荧光脉冲面积比荧光脉冲高度更能准确反应反应DNA含量。含量。荧光信号宽度荧光信号宽度(如如FL2W)惯用来区分惯用来区分双联体细胞双联体细胞 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第28页(3)光谱重合校正光谱重合校正 使用荧光赔偿电路 合理设置荧光信号赔偿值。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第29页(五五)FCM)FCM测量数据测量数据存存放、显示和分析放、显示和分析流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第30页流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=数据存放数据存放:LIST:LIST MODEMODE数据显示数据显示:直方图直方图(Histogram)(Histogram)二维点图二维点图(Dot Plot)(Dot Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)(Contour Plot)密度图密度图(Density)(Density)三维图（三维图（3D Plot3D Plot）等）等流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第31页单参数直方图 每一个细胞单参数测量数据可整理成份布统计，以分布直方图(distribution histogram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度值，其单位是道数，横坐标能够是线性，也能够是对数，纵坐标普通是细胞数 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第32页DNA含量直方图和抗原表示直方图含量直方图和抗原表示直方图 流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第33页双参数数据显示 双参数数据显示是用于表示来自同一细胞两个参数与细胞数量关系，惯用表示方法有二维点图(dot plot)、等高线图(contour plot)、二维密度图(density plot)。在二维图中，x坐标为某细胞一个参数数值，而Y坐标为该细胞另一参数数值。从双参数图形中能够将各细胞亚群区分开，同时可取得细胞相关主要信息。流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第34页外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第35页双色荧光标识细胞散点图双色荧光标识细胞散点图流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第36页=等高图和密度图分析等高图和密度图分析流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第37页数据分析数据分析=三维图分析三维图分析流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第38页流式细胞仪科研应用流式细胞仪科研应用=树突细胞研究树突细胞研究=干细胞研究干细胞研究=癌症病人多药耐药性癌症病人多药耐药性=细胞动力学功效研究细胞动力学功效研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第39页脑栓塞病人血小板活化检测脑栓塞病人血小板活化检测A CD61-SSC设设分析门分析门B 阴性对照阴性对照C 治疗前治疗前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第41页细胞凋亡细胞凋亡Caspases-3流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第42页谢谢谢谢谢谢谢谢流式细胞仪的构造工作原理和数据分析专家讲座第43页